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方法文章

无饲养层条件下由人多能干细胞分化获得黑色素细胞

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DOI：

10.3791/53806

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2016年3月3日

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

本文内容

摘要

本研究描述了一种 体外 通过无饲养层、为期25天的分化方案，经由神经嵴和黑色素母细胞中间阶段，由人多能干细胞生成有色素的成熟黑色素细胞。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）为研究人类发育提供了一个平台 体外 在正常和疾病条件下均可进行研究。研究人员可通过调控培养条件，模拟发育过程中出现的信号，从而引导人多能干细胞（hPSCs）向目标细胞类型分化。其中一种细胞类型是黑色素细胞，这是一种起源于神经嵴（NC）的色素生成细胞，具有保护皮肤免受紫外线辐射的作用。本方案是对现有方法的一种延伸 体外 人多能干细胞向神经嵴细胞分化的方案，进而将神经嵴细胞进一步分化为完全色素化的黑素细胞。在双SMAD抑制条件下，通过定时暴露于WNT、BMP和EDN3信号通路激活剂，可从神经嵴分化方案中富集黑素细胞前体。随后，将获得的黑素细胞前体通过选择性培养基进行纯化并诱导成熟为完全色素化的黑素细胞。所得黑素细胞具有完全色素化特征，并可特异性表达成熟黑素细胞标志性的蛋白。

引言

人类多能干细胞（hPSCs）为疾病建模、药物筛选和细胞替代疗法中的正常分化过程提供了可扩展的模拟平台1-6。尤其值得关注的是，hPSCs为研究难以分离或稀有/短暂存在的细胞类型开辟了途径，这些细胞类型的患者样本通常极为稀缺。此外，诱导性多能干细胞（iPSCs）使研究人员能够以患者特异性的方式研究发育过程和疾病模型，从而揭示独特的生物学机制1,2,7-11。此前发表的由hPSCs向黑素细胞分化的方案需要长达6周的分化时间，并涉及使用L-Wnt3a细胞的条件培养基进行细胞培养12。本文所述的由Mica et al. 首次提出的方案可在三周内生成有色素的细胞，同时消除了条件培养基所带来的不确定性和实验重复性差的问题。

黑色素细胞起源于神经嵴，神经嵴是脊椎动物特有的迁徙性细胞群。在原肠胚形成期间，神经嵴被确定下来，代表位于神经板边缘、介于神经外胚层与非神经外胚层交界处的一群细胞。在神经管形成过程中，神经组织从神经板发育形成神经褶，神经褶在背侧中线处汇合，最终形成神经管13,14。

神经嵴细胞起源于神经管背侧的顶板，位于脊索的对侧，在迁移之前经历上皮-间充质转化，进而发育形成多种分化的细胞类型。神经嵴细胞的命运部分由胚胎体轴上顶板的解剖位置决定。神经嵴细胞的衍生物包括具有中胚层特征的细胞谱系（如平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞）以及外胚层特征的细胞谱系（如黑色素细胞、施万细胞、神经元）14。神经嵴干细胞会上调转录因子 SOX10 的表达，并可通过针对 p75 和 HNK1 的抗体进行荧光激活细胞分选来分离。

注定发育为黑色素细胞的神经嵴细胞会经历一个黑素母细胞阶段，并上调KIT和MITF（小眼畸形相关转录因子）6,21。MITF是黑色素细胞发育的主要调控因子，作为一种转录因子，负责调控大部分黑色素细胞的发育过程22-24。人类黑素母细胞迁移至表皮的基底层，在毛囊隆起区域或被角质形成细胞包围的表皮内定居（形成色素单位），作为成熟色素化黑色素细胞的前体。黑素母细胞向色素化黑色素细胞的分化与成熟过程伴随着毛球部的定植以及黑色素合成通路相关基因（TYRP1、TYR、OCA2和PMEL）的表达25,26。

从患者体内分离人黑色素细胞和黑色素母细胞成本高昂、操作困难且细胞数量有限。本方案使研究人员能够将人多能干细胞（诱导性或胚胎来源）分化为黑色素细胞或黑色素细胞前体，该方法具有定义明确、快速、可重复、可放大且成本低廉的优点，且无需细胞分选。此前该方案已用于在将色素异常疾病患者的诱导多能干细胞进行分化时，鉴定疾病特异性的缺陷。

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方案

注意：此处所述的黑素细胞实验方案最初由 Mica 等人演示。

1. 培养基制备、包被培养皿及人多能干细胞的维持

  1. 培养基制备
    注意：所有培养基在避光条件下于 4 °C 保存，最多可保存 2 周。所有培养基均需过滤灭菌。
    1. 制备 DMEM/10% FBS。混合 885 ml DMEM、100 ml FBS、10 ml 青霉素-链霉素（Pen/Strep）和 5 ml L-谷氨酰胺。过滤灭菌。
    2. 制备 hESC 培养基。混合 800 ml DMEM/F12、200 ml KSR、5 ml L-谷氨酰胺、10 ml MEM 最小必需氨基酸溶液、1 ml β-巯基乙醇和 5 ml 青霉素-链霉素。过滤后加入 10 ng/ml FGF-2。
    3. 制备 KSR-分化培养基：混合 820 ml Knockout DMEM、150 ml KSR、10 ml L-谷氨酰胺、10 ml 青霉素-链霉素、10 ml MEM 最小必需氨基酸溶液和 1 ml β-巯基乙醇。过滤灭菌。
    4. 制备 N2-分化培养基。将 12 g DMEM/F12 粉末溶解于 980 ml dH2O 中。加入 1.55 g 葡萄糖、2 g 碳酸氢钠和 100 mg 去唾液酸人转铁蛋白。将 2 ml dH2O 与 25 mg 人胰岛素和 40 µl 1 N NaOH 混合；溶解后，将该混合液加入培养基中。加入 100 µl 盐酸亚精胺、60 µl 硒酸钠和 100 µl 孕酮。用 dH2O 定容至 1 L 后进行过滤。
    5. 制备完全黑色素细胞培养基。将 50% Neurobasal 培养基、30% 低糖 DMEM 和 20% MCDB201 混合。向其中添加：0.8% ITS+、250 nM L-谷氨酰胺、100 µM 抗坏血酸（L-AA）、50 ng/ml 霍乱毒素、50 ng/ml SCF、0.05 µM 地塞米松、100 nM EDN3、4 ng/ml FGF2。无菌过滤后加入剩余试剂：2% B27 补充剂、25 ng/ml BMP4、3 µM CHIR99021、500 µM cAMP。
  2. 培养皿包被
    1. 使用如 Matrigel 等凝胶状蛋白进行包被。开瓶后，将 Matrigel 分装为每份 1 ml 并冷冻保存，以避免反复冻融。将 1 ml 冻存的 Matrigel 在冰上融化后，用 19 ml DMEM/F12 重悬。每 10 cm 培养皿加入 5 ml。室温孵育 1 小时。在接种细胞前立即吸除凝胶状蛋白，并用 DMEM/F12 洗涤。
    2. 使用多聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐/小鼠层粘连蛋白-I/纤连蛋白（PO/Lam/FN）进行包被。用含 15 µg/ml 多聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐的 PBS 包被培养皿。在湿润培养箱中 37 °C 过夜孵育。吸除溶液后，用 PBS 洗涤培养皿三次，然后用含 1 µg/ml 小鼠层粘连蛋白-I 和 2 µg/ml 纤连蛋白的 PBS 进行二次包被。在湿润培养箱中 37 °C 过夜孵育。
      1. 接种细胞前，吸除溶液，并在超净台中打开盖子使培养皿彻底干燥。干燥时间约为 10–15 分钟。
        注意：当肉眼观察到表面出现晶体结构时，表明培养皿已干燥并可进行细胞接种。只要液体不蒸发，包被了 LAM/FN 的培养皿可在培养箱中 PBS 中保存两周；干燥后的培养皿可在室温下保存数小时。 
  3. 人多能干细胞（hPSCs）的维持
    注意：hPSCs 在含 0.1% 明胶且经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，使用 hESC 培养基进行培养。细胞应每 6–8 天传代一次。
    1. 在室温下用 PBS 中的 0.1% 明胶包被 10 cm 培养皿，作用 5 分钟。
    2. 在 37 °C 水浴中快速融化冻存的 MEFs。
    3. 吸除明胶溶液后接种细胞。以约 50,000 个细胞/cm2 的密度将 MEFs 接种于 DMEM/10% FBS 中。在加入 hPSCs 前，于 37 °C 培养过夜。
    4. 从已准备好的 MEF 培养皿中吸除 DMEM/10% FBS，用 PBS 洗涤后加入含 hPSCs 的 10 ml hESC 培养基。根据传代前的密度，以 1:5 至 1:10 的比例传代 hPSCs。
      注意：若 hPSCs 为冻存复苏或以单细胞形式传代，需在培养基中补充 10 µM Y-27632 二盐酸盐（ROCKi），直至首次传代完成。
    5. 每天用新鲜的 10 ml hESC 培养基更换培养液。
    6. 开始分化前，去除任何出现分化细胞、边界不规则或中心透明的多能性克隆28。在层流罩中使用解剖显微镜，通过移液器机械性松解并吸除异常克隆。

2. 用于分化的人多能干细胞的铺板

注意：分化条件针对10 cm培养皿进行描述。

  1. 在开始分化前，按照步骤1.3.1所述方法准备10 cm Matrigel培养皿。
  2. 当接种hPSCs进行分化时，使用处于传代密度（约80%融合度）的hPSCs培养板，吸除hESC培养基，用PBS洗涤，并向细胞中加入3 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA。
  3. 在显微镜下观察，剧烈水平振荡培养皿2分钟，直至MEF细胞以单细胞形式脱落，而hPSC克隆应仍以克隆形式贴壁。
  4. 在MEF细胞脱落后、但hPSC克隆尚未脱落前，吸除胰蛋白酶溶液。
  5. 向培养板中加入10 ml含有10 µM Y-27632二盐酸盐的hESC培养基，通过反复吹打克隆区域使细胞脱落。
  6. 吸除步骤2.1中准备好的10 cm Matrigel培养皿中的Matrigel溶液，用DMEM/F12洗涤以去除团块。以1:2的比例将hPSCs接种至Matrigel培养皿中，加入含10 µM Y-27632二盐酸盐的hESC培养基至10 ml。于37 °C孵育过夜。
    注意：此接种密度应达到约100,000个细胞/cm2。

3. 诱导神经分化

注意：当 hPSCs 达到 80% 汇合度时，应启动分化（第 0 天）。在开始分化前，可每日使用含有 10 µM Y-27632 二盐酸盐的 hESC 培养基对细胞进行换液。

  1. 在第0天和第1天，使用含有100 nM LDN193189和10 µM SB431542的10 ml KSR-分化培养基喂养细胞。
  2. 在第2天，使用含有100 nM LDN193189、10 µM SB431542和3 µM CHIR99021的10 ml KSR-分化培养基喂养细胞。
  3. 在第3天，使用含有10 µM SB431542和3 µM CHIR99021的10 ml KSR-分化培养基喂养细胞。
  4. 在第4天和第5天，使用15 ml含3 µM CHIR99021的75% KSR-分化培养基和25% N2-分化培养基喂养细胞。
    注意：观察到大量细胞死亡（以漂浮细胞形式出现）时无需惊慌。这是正常且预期的现象。
  5. 在第6天和第7天，使用15 ml含3 µM CHIR99021、25 ng/ml BMP4和100 nM EDN3的50% KSR-分化培养基和50% N2-分化培养基喂养细胞。
  6. 在第8天和第9天，使用20 ml含3 µM CHIR99021、25 ng/ml BMP4和100 nM EDN3的25% KSR-分化培养基和75% N2-分化培养基喂养细胞。
  7. 在第9天和第10天，按照1.2.2节所述准备PO/Lam/FN培养皿，用于第11天的细胞传代。
  8. 在第10天，使用含有3 µM CHIR99021、25 ng/ml BMP4和100 nM EDN3的20 ml N2-分化培养基喂养细胞。

4. 用于神经嵴细胞分化的滴液重铺板

  1. 第11天，吸除已准备好的PO/LAM/FN培养板中的Lam/FN，并彻底干燥。
  2. 移除第11天细胞的培养基，用PBS洗涤，每10 cm培养皿加入4 ml细胞解离溶液（如Accutase），在37 °C孵育25分钟。
  3. 向培养皿中加入5 ml完全黑色素细胞培养基，用10 ml移液器反复吹打，使所有细胞脱离培养皿表面，重悬细胞。将细胞悬液转移至15 ml离心管中。
  4. 以200 × g离心5分钟，弃上清，用完全黑色素细胞培养基将细胞重悬至浓度为2 × 106 个细胞/ml。使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板或等效技术进行细胞计数。
  5. 在已干燥的PO/Lam/FN 10 cm培养皿上，滴加10 µl细胞悬液，液滴之间应紧密排列但互不接触。
    注意：此操作可为细胞创造高密度的局部环境，有利于细胞重铺，同时保留培养皿内空间供后续扩增。
  6. 将液滴在室温下静置10–20分钟，使细胞充分贴附，然后缓慢加入10 ml完全黑色素细胞培养基（避免扰动已贴壁的细胞），将培养皿移入培养箱中。

5. 扩增黑色素细胞前体细胞

  1. 每2至3天使用完全黑色素细胞培养基继续喂养。
    注意：预计在第一周结束时，细胞簇中开始出现可见的色素沉着，第二周时将变得非常明显。将培养板置于白色背景（如一张白纸）上方观察，以识别这些早期出现的小而深色的细胞簇。随着时间推移，细胞色素沉着会逐渐加深，直至整个培养板呈现均匀的色素分布（见图2B）。
  2. 每周传代一次，传代比例约为1:6（此阶段无需再以液滴形式接种）。使用Accutase消化细胞，并用普通Neurobasal培养基洗涤两次，然后在完全黑色素细胞培养基中重新接种。细胞需维持在PO/LAM/FN包被的培养板上。
    注意：我们发现完全黑色素细胞培养基最适合维持和扩增由hESC和iPSC分化的黑色素细胞。然而，细胞也可短暂培养于 commercially available M254 培养基中，但该简化培养基会增加细胞死亡和从培养板脱落的风险。

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结果

本方案提供了一种从人多能干细胞（hPSCs）高效诱导生成完全色素化的成熟黑素细胞的方法 体外 无饲养层、成本低廉且可重复的方式。与先前建立的Fang方法相比 等 人多能干细胞衍生黑色素细胞的方案，该方案无需使用条件培养基，并缩短了所需时间。Fang 等 采用WNT3A分泌型小鼠细胞系的条件培养基，最长需6周时间方可观察到色素沉着 6,12为了诱导神经嵴干细胞向黑色素细胞命运（黑色素母细胞）分化，我们在早期脉冲后去除BMP和TGFβ抑制剂（分别为LDN和SB），并在第6天引入外源性BMP4和EDN3信号，同时维持Wnt通路的激活（CHIR）。 6. 所获得的黑素细胞前体可通过表达KIT和MITF，以及持续表达SOX10来进行鉴定 6在培养第11天，SOX10的表达可在培养皿中形成脊状结构的区域观察到（图1B-C).

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讨论

为了成功地将人多能干细胞（hPSCs）分化为黑色素细胞，应考虑以下建议。首先，必须始终在无菌培养条件下操作。此外，起始使用的hPSCs必须具有多能性且完全未分化；如果起始细胞群体中包含已分化细胞，则分化产率必然下降，因为这些污染细胞无法被诱导转化为黑色素细胞，甚至可能干扰正常分化中的细胞。

为确保细胞保持多能性，需严格遵守干细胞培养的既定规则；定期换液和传代，并在传代前对培养物进行筛选，去除已分化细胞。当将细胞传代至用于诱导分化的凝胶状蛋白基质时，必须确保培养皿充分包被，以防止细胞在分化过程中脱落。

黑色素母细胞的分化应在细胞密度达到约80%时开始；密度过高会导致细胞死亡增加，而密度过低则会对分化产生不利影响。传代时，细胞应洗涤两次，以去除所有细胞解离溶液后再接种。为了在第11天最大限度地提高细胞存活率，重要的是将细胞传代至高密度、间距良好的液滴中，并在20分钟内不扰动，以便细胞聚集成簇并贴壁。

该方案能够有效生成大量黑色素细胞，在研究数量有限的人类患者样本时具有重要价值...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了乔安娜·M·尼古拉基金会黑色素瘤研究人员奖学金以及美国国立卫生研究院露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖F31项目的资助。此外，本研究还获得了纽约干细胞基金会（NYSTEM）和三机构干细胞计划（斯塔尔基金会）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accutase创新细胞技术AT104
人转铁蛋白（apo型）SigmaT1147
抗坏血酸（L-AA）SigmaA4034100 mM
B27（B27添加剂）Invitrogen17504044
β-巯基乙醇Gibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R&D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R&D Systems44236 mM
霍乱毒素SigmaC805250 mg/ml
cAMP（环磷酸腺苷）SigmaD0627100 mM
地塞米松SigmaD2915-100MG50 μM
DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基Gibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - 达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 粉末Invitrogen12500-096
EDN3（内皮素-3，人）American Peptide Company88-5-10B100 μM
纤连蛋白BD 生物科学356008200 μg/ml
明胶（不含 Mg/Ca 的 PBS）自主研发PBS 中 0.1%
葡萄糖SigmaG7021
人胰岛素SigmaI2643
ITS+ 通用培养基补充剂预混液 BD 生物科学354352
KSR（Knockout血清替代物）Gibco-Life Technologies10828-028
敲除DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-谷氨酰胺Gibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
低糖DMEMInvitrogen11885-084
Matrigel基质BD 生物科学354234在 DMEM/F12 中按 1:20 比例溶解
MCDB201 培养基SigmaM6770
MEM最低必需氨基酸溶液Gibco-Life Technologies11140-080
小鼠胚胎成纤维细胞（700万细胞/瓶）GlobalStemGSC-8105M
小鼠层粘连蛋白-IR&D Systems3400-010-011 mg/ml
Neurobasal 培养基Invitrogen21103049
青霉素/链霉素Gibco-Life Technologies15140-12210,000 U/ml
聚-L-鸟氨酸氢溴化物SigmaP365515 mg/ml 
孕酮SigmaP87830.032 g 溶于 100 ml 100% 乙醇
腐胺二盐酸盐SigmaP5780
FGF2（重组人碱性成纤维细胞生长因子）R&D Systems233-FB-001MG/CF10 mg/ml
SB431542Tocris-R&D Systems181410 mM
亚硒酸盐SigmaS5261
碳酸氢钠SigmaS5761
干细胞因子（SCF，重组人源） Peprotech Inc.300-0750 μg/ml
TYRP1 (G-17) 抗体Santa Cruz104431:200
TYRP2 抗体Abcam740731:200
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 二盐酸盐Tocris-R&D Systems125410 mM

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