本研究描述了一种 体外 通过无饲养层、为期25天的分化方案，经由神经嵴和黑色素母细胞中间阶段，由人多能干细胞生成有色素的成熟黑色素细胞。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人类多能干细胞（hPSCs）为研究人类发育提供了一个平台 体外 在正常和疾病条件下均可进行研究。研究人员可通过调控培养条件，模拟发育过程中出现的信号，从而引导人多能干细胞（hPSCs）向目标细胞类型分化。其中一种细胞类型是黑色素细胞，这是一种起源于神经嵴（NC）的色素生成细胞，具有保护皮肤免受紫外线辐射的作用。本方案是对现有方法的一种延伸 体外 人多能干细胞向神经嵴细胞分化的方案，进而将神经嵴细胞进一步分化为完全色素化的黑素细胞。在双SMAD抑制条件下，通过定时暴露于WNT、BMP和EDN3信号通路激活剂，可从神经嵴分化方案中富集黑素细胞前体。随后，将获得的黑素细胞前体通过选择性培养基进行纯化并诱导成熟为完全色素化的黑素细胞。所得黑素细胞具有完全色素化特征，并可特异性表达成熟黑素细胞标志性的蛋白。
引言
人类多能干细胞（hPSCs）为疾病建模、药物筛选和细胞替代疗法中的正常分化过程提供了可扩展的模拟平台1-6。尤其值得关注的是，hPSCs为研究难以分离或稀有/短暂存在的细胞类型开辟了途径，这些细胞类型的患者样本通常极为稀缺。此外，诱导性多能干细胞（iPSCs）使研究人员能够以患者特异性的方式研究发育过程和疾病模型，从而揭示独特的生物学机制1,2,7-11。此前发表的由hPSCs向黑素细胞分化的方案需要长达6周的分化时间，并涉及使用L-Wnt3a细胞的条件培养基进行细胞培养12。本文所述的由Mica et al. 首次提出的方案可在三周内生成有色素的细胞，同时消除了条件培养基所带来的不确定性和实验重复性差的问题。
黑色素细胞起源于神经嵴，神经嵴是脊椎动物特有的迁徙性细胞群。在原肠胚形成期间，神经嵴被确定下来，代表位于神经板边缘、介于神经外胚层与非神经外胚层交界处的一群细胞。在神经管形成过程中，神经组织从神经板发育形成神经褶，神经褶在背侧中线处汇合，最终形成神经管13,14。
神经嵴细胞起源于神经管背侧的顶板，位于脊索的对侧，在迁移之前经历上皮-间充质转化，进而发育形成多种分化的细胞类型。神经嵴细胞的命运部分由胚胎体轴上顶板的解剖位置决定。神经嵴细胞的衍生物包括具有中胚层特征的细胞谱系（如平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：此处所述的黑素细胞实验方案最初由 Mica 等人演示。
1. 培养基制备、包被培养皿及人多能干细胞的维持
- 培养基制备
注意：所有培养基在避光条件下于 4 °C 保存，最多可保存 2 周。所有培养基均需过滤灭菌。- 制备 DMEM/10% FBS。混合 885 ml DMEM、100 ml FBS、10 ml 青霉素-链霉素（Pen/Strep）和 5 ml L-谷氨酰胺。过滤灭菌。
- 制备 hESC 培养基。混合 800 ml DMEM/F12、200 ml KSR、5 ml L-谷氨酰胺、10 ml MEM 最小必需氨基酸溶液、1 ml β-巯基乙醇和 5 ml 青霉素-链霉素。过滤后加入 10 ng/ml FGF-2。
- 制备 KSR-分化培养基：混合 820 ml Knockout DMEM、150 ml KSR、10 ml L-谷氨酰胺、10 ml 青霉素-链霉素、10 ml MEM 最小必需氨基酸溶液和 1 ml β-巯基乙醇。过滤灭菌。
- 制备 N2-分化培养基。将 12 g DMEM/F12 粉末溶解于 980 ml dH2O 中。加入 1.55 g 葡萄糖、2 g 碳酸氢钠和 100 mg 去唾液酸人转铁蛋白。将 2 ml dH2O 与 25 mg 人胰岛素和 40 µl 1 N NaOH 混....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案提供了一种从人多能干细胞（hPSCs）高效诱导生成完全色素化的成熟黑素细胞的方法 体外 无饲养层、成本低廉且可重复的方式。与先前建立的Fang方法相比 等 人多能干细胞衍生黑色素细胞的方案，该方案无需使用条件培养基，并缩短了所需时间。Fang 等 采用WNT3A分泌型小鼠细胞系的条件培养基，最长需6周时间方可观察到色素沉着 6,12为了诱导神经嵴干细胞向黑色素细胞命运（黑色素母细胞）分化，我们在早期脉冲后去除BMP和TGFβ抑制剂（分别为LDN和SB），并在第6天引入外源性BMP4和EDN3信号，同时维持Wnt通路的激活（CHIR）。 6. 所获得的黑素细胞前体可通过表达KIT和MITF，以及持续表达SOX10来进行鉴定 6在培养第11天，SOX10的表达可在培养皿中形成脊状结构的区域观察到（图1B-C).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了成功地将人多能干细胞（hPSCs）分化为黑色素细胞，应考虑以下建议。首先，必须始终在无菌培养条件下操作。此外，起始使用的hPSCs必须具有多能性且完全未分化；如果起始细胞群体中包含已分化细胞，则分化产率必然下降，因为这些污染细胞无法被诱导转化为黑色素细胞，甚至可能干扰正常分化中的细胞。
为确保细胞保持多能性，需严格遵守干细胞培养的既定规则；定期换液和传代，并在传代前对培养物进行筛选，去除已分化细胞。当将细胞传代至用于诱导分化的凝胶状蛋白基质时，必须确保培养皿充分包被，以防止细胞在分化过程中脱落。
黑色素母细胞的分化应在细胞密度达到约80%时开始；密度过高会导致细胞死亡增加，而密度过低则会对分化产生不利影响。传代时，细胞应洗涤两次，以去除所有细胞解离溶液后再接种。为了在第11天最大限度地提高细胞存活率，重要的是将细胞传代至高密度、间距良好的液滴中，并在20分钟内不扰动，以便细胞聚集成簇并贴壁。
该方案能够有效生成大量黑色素细胞，在研究数量有限的人类患者样本时具有重要价值.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了乔安娜·M·尼古拉基金会黑色素瘤研究人员奖学金以及美国国立卫生研究院露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖F31项目的资助。此外，本研究还获得了纽约干细胞基金会（NYSTEM）和三机构干细胞计划（斯塔尔基金会）资助项目的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accutase | 创新细胞技术 | AT104 | |
| 人转铁蛋白（apo型） | Sigma | T1147 | |
| 抗坏血酸（L-AA） | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27（B27添加剂） | Invitrogen | 17504044 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP（环磷酸腺苷） | Sigma | D0627 | 100 mM |
| 地塞米松 | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基 | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - 达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 粉末 | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3（内皮素-3，人） | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| 纤连蛋白 | BD 生物科学 | 356008 | 200 μg/ml |
| 明胶（不含 Mg/Ca 的 PBS） | 自主研发 | PBS 中 0.1% | |
| 葡萄糖 | Sigma | G7021 | |
| 人胰岛素 | Sigma | I2643 | |
| ITS+ 通用培养基补充剂预混液 | BD 生物科学 | 354352 | |
| KSR（Knockout血清替代物） | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| 敲除DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| 低糖DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel基质 | BD 生物科学 | 354234 | 在 DMEM/F12 中按 1:20 比例溶解 |
| MCDB201 培养基 | Sigma | M6770 | |
| MEM最低必需氨基酸溶液 | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞（700万细胞/瓶） | GlobalStem | GSC-8105M | |
| 小鼠层粘连蛋白-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal 培养基 | Invitrogen | 21103049 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| 聚-L-鸟氨酸氢溴化物 | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| 孕酮 | Sigma | P8783 | 0.032 g 溶于 100 ml 100% 乙醇 |
| 腐胺二盐酸盐 | Sigma | P5780 | |
| FGF2（重组人碱性成纤维细胞生长因子） | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| 亚硒酸盐 | Sigma | S5261 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | |
| 干细胞因子（SCF，重组人源） | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) 抗体 | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 抗体 | Abcam | 74073 | 1:200 |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
参考文献
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
