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方法文章

从儿童鼻腔上皮细胞中进行原代培养并重编程为诱导性多能干细胞

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⸱

DOI：

10.3791/53814

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2016年3月10日

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

本文内容

摘要

本出版物展示了从儿童鼻腔上皮黏膜成功采样和培养的方法，并将这些细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。

摘要

鼻上皮细胞（NECs）是呼吸道的一部分，可对空气污染物产生反应，并且是呼吸病毒最先感染的细胞。它们还通过先天免疫反应以及与免疫细胞和呼吸道基质细胞的相互作用，参与多种呼吸道疾病的发生发展。由于在临床就诊期间易于获取，鼻上皮细胞在儿童相关研究中具有特殊价值。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）可由多种细胞类型产生，是研究人类发育与疾病建模的有力工具，也具有再生医学应用的潜力。本方案是首个针对从儿童参与者来源的鼻上皮细胞成功生成iPSCs的研究性操作流程。该方案详细描述了如何从儿童获取鼻上皮细胞，如何从这些样本建立原代NEC培养，以及如何将原代NECs重编程为特征明确的iPSCs。鼻黏膜样本在与儿童空气污染暴露相关的流行病学研究中具有重要用途，也为研究呼吸道疾病提供了关键工具。来源于此类样本的原代鼻上皮细胞及其诱导生成的iPSCs，可为哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等呼吸道上皮生物学多个领域的患者特异性研究提供无限的材料来源。

引言

来自人体样本的诱导多能干细胞（hiPSCs）是干细胞研究中发展迅速的技术。与胚胎干细胞（hESC）研究相比，该技术具有更少的伦理和道德争议1,2。尽管在表观遗传学上与hESCs并不完全相同3-5，hiPSCs仍为研究发育过程和疾病表型提供了独特途径，并且可从与疾病状态相关的组织中获得5-8。目前正不断探索生成hiPSCs的新方法，以确定最适起始细胞类型，推动制备适用于移植的符合药品生产质量管理规范（GMP）质量的iPSCs，并进一步提高重编程过程的时效性和效率6,9-11。

气道上皮细胞在过敏性炎症的发生中起着关键作用12，上皮组织通过与免疫细胞和基质细胞的相互作用，是过敏反应和气道重塑的主要驱动因素。气道上皮在哮喘等肺部疾病的发生和持续过程中发挥着至关重要的作用。然而，在临床环境中获取下气道上皮细胞较为困难，尤其是来自健康对照者和儿童的样本。多项研究的数据支持鼻黏膜上皮细胞可作为下气道上皮细胞有效且实用的替代模型13-20，特别是在研究对空气污染物和过敏原的反应时。鼻黏膜中超过90%为纤毛气道上皮细胞，采集鼻上皮细胞（NECs）的操作可轻松应用于四至五岁以上的儿童，因其侵入性远低于其他细胞/组织取样技术，且发生感染等不良事件的风险极低20-23。该方法为健康和患病儿童提供了一种快速、简便的取样途径，避免了耗时、不必要且常伴有疼痛的支气管镜检查，后者通常需要镇静。先前的研究发现，哮喘严重程度相关的疾病亚型在哮喘患儿的鼻黏膜和支气管细胞样本中均可被区分，且两种组织类型在约90%的非泛在基因中基因表达相似22,24。作为诱导多能干细胞（iPSCs）的来源，鼻上皮细胞相较于其他常用细胞类型具有优势。成纤维细胞常用于iPSC的生成，尽管这些细胞可通过皮肤活检轻松培养，但该过程通常需要局部麻醉、切口和缝合，且存在一定的感染风险。因此，患者对此类活检的知情同意较难获得25。成纤维细胞的一种替代来源是外周血单个核细胞（PBMCs），但儿科患者可能难以提供足够量的血液用于iPSC生成。此外，成纤维细胞和血细胞来源的iPSC在下游应用方面存在局限性，尤其是向某些特定细胞类型的分化能力5,26。因此，鉴于其相对易于获取且采集后不良反应风险低，鼻上皮细胞是儿科人群中iPSC生成的理想细胞来源。

近年来，诱导多能干细胞（iPSCs）作为一种研究人类发育、建立新型疾病模型以及作为个性化治疗潜在细胞来源的平台，受到了广泛关注。在充分实现该技术潜力之前，必须阐明重编程过程的分子基础。但目前，本方案及其所述程序将阐明聚焦于气道暴露的研究，并为涉及iPSCs的个性化医学效应研究提供一个平台。

多个实验室的协作工作已成功开发出一种技术，不仅可用于采集鼻黏膜样本，还可用于培养鼻上皮细胞（NECs），并将这些细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）23。本文概述了一种优化的采样、培养和重编程操作方案。

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方案

以下方案遵循各机构人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 鼻腔黏膜取样

注意：应从无呼吸道病毒感染症状的受试者处获取样本。

  1. 在受试者到访前，准备一个15 ml的锥形管，并加入2 ml BEGM（支气管上皮细胞生长培养基）以及20 µl无菌的青霉素/链霉素/两性霉素B（P/S/F）（0.01%）。
  2. 在采集样本前立即打开细胞刷，确保细胞刷保持无菌状态，且除鼻腔表面外，不得接触任何其他表面。
  3. 要求受试者保持静坐，头部向后仰起朝向天花板。对于较小或较为躁动的儿童，可让其坐在自己的手上和/或平躺，以避免挥打导致细胞刷移位。
  4. 将细胞刷对准鼻腔后部通道变窄的位置（看起来像一个小黑孔）。将刷子轻轻滑入，并在从鼻孔中取出时旋转手腕。
  5. 将细胞刷放入锥形管中，并完全浸入BEGM培养基内。剪去多余的刷柄部分，并盖紧管盖。切勿涡旋震荡。
    注意：若受试者愿意，可采用相同方法在另一侧鼻孔采集第二根细胞刷样本。双侧鼻孔取样将显著提高采样成功的可能性。在同一鼻孔重复取样可能导致出血，且不太可能改善样本质量。
  6. 运输过程中，应尽可能将样本保持在接近37 °C的环境中，可使用盛有温水的烧杯进行保温。

2. 细胞计数与细胞离心涂片

  1. 将刷子在 BEGM 中轻轻振荡，取 10 µl 样品，用血细胞计数板进行细胞计数。加入 10 µl 活/死染料，仅在显微镜下计数活细胞。
  2. 取 50 µl 样品，用 1× PBS 稀释至 200 µl。加入连接在玻片上的细胞离心涂片装置中，以 300 rpm 离心 2 分钟。让玻片过夜干燥，然后按照制造商说明书进行染色。最好在避光条件下过夜干燥。
  3. 使用 Hema 3 染色液染色玻片
    1. 将每种溶液（Hema 固定液，浅蓝色；Hema 3 溶液 I，粉红色；Hema 3 溶液 II，深蓝色）转移至染色缸中；不使用时保持加盖。将玻片插入玻片染色架中
    2. 将玻片持续浸入固定液中 30 秒，然后让多余液体流尽。将玻片持续浸入溶液 I 中 30 秒，然后让多余液体流尽。将玻片持续浸入溶液 II 中 30 秒，然后让多余液体流尽
    3. 用去离子水冲洗，直至水流清澈。最好在避光条件下过夜干燥
  4. 在显微镜下观察玻片，计数细胞，确定上皮细胞百分比。若取样良好，应达到 90% 或更高。

3. 接种细胞

注意：所有细胞培养操作均须在经过认证的无菌细胞培养罩内进行，并采用无菌技术。

  1. 用牛皮胶原蛋白（BDC）I型包被培养板。将0.5 ml浓度为3 mg/ml的BDC加入49.5 ml 1× PBS中稀释后使用。若仅需少量培养板，可相应减少配制量。如需要，用2 ml BDC包被一个T25培养瓶，并在无菌操作台中过夜孵育，或在37 °C孵育2小时。
  2. 孵育结束后，吸除残留液体。将培养瓶置于无菌操作台中，用紫外光照射30分钟。包被后的培养瓶可在4 °C保存最多一个月，但在接种细胞前需恢复至室温或37 °C。
  3. 将刷子和细胞置于BEGM培养基中，在37 °C保存直至准备接种。轻轻晃动锥形管内的刷子，但不要涡旋震荡。
    1. 在T25培养瓶中接种7 × 105个细胞。若细胞数量不足，可使用较小容器，例如6孔板中的一个孔。此规格的培养容器约需3 × 105个细胞。
      注意：若细胞数量未达到要求，不建议继续实验。
  4. 在无菌操作台内，将刷子从管中取出，并在包被好的培养瓶表面轻轻旋转涂抹，注意避免刮伤包被层。使用后将刷子丢弃至适当的生物危害废物容器中。
  5. 用移液器缓慢将锥形管中剩余的BEGM培养基中的细胞转移至T25培养瓶中。在显微镜下观察细胞。此时可见部分悬浮细胞，以及少量来自鼻腔的碎片，此现象在此阶段属正常（图3A）。

4. 细胞培养

  1. 接种细胞后，将其静置培养48小时，期间避免扰动图348 小时后，缓慢轻柔地加入 2 ml 温热的 BEGM 和 20 µl 无菌青霉素/链霉素/两性霉素 B（P/S/F）。
    注意：不要吸出最初的 2 ml 培养基。
  2. 第4天th 接种后24小时，小心吸除所有液体，加入4 ml新鲜预热的BEGM培养基，含1x青霉素/链霉素（无需再添加两性霉素B）。每两天更换一次培养基，并观察细胞的贴壁、生长和融合情况。当细胞融合度达到约80%时，通常需要2-3周，即可进行传代。
  3. 一个T25培养瓶（约2.5 × 10⁵）6 细胞长满后可传代至三个T25培养瓶或一个T75培养瓶。首次传代后，细胞应生长旺盛且状态良好，大约每三天达到一次汇合。

5. 细胞传代

  1. 轻轻吸去培养板中的培养基。每T25培养瓶加入1 ml 0.05%胰蛋白酶溶液，放入培养箱中孵育约4分钟，或直至细胞从培养板上脱落。每2分钟检查一次细胞脱落程度，胰蛋白酶作用时间不得超过10分钟。
  2. 加入5 ml胰蛋白酶中和液（TNS）或含血清的培养基以中和酶活性。将所有液体和细胞从培养瓶中转移至15 ml锥形离心管中。
  3. 以200 × g（加速度0，减速度0）离心5分钟，获得细胞沉淀。吸去上清液，并将细胞重悬于所需体积的BEGM + P/S培养基中（T25培养瓶加4 ml，T75培养瓶加10 ml）。
  4. 按照上述方法（2.1）使用活/死染色进行细胞计数。将适量BEGM培养基和细胞加入已包被的培养瓶中，放回培养箱继续培养。按前述方法维持培养，或以冻存液（70% BEGM、20% FBS和10% DMSO）在0.5–2 × 106 个细胞/ml的浓度下进行冷冻保存。

6. 重编程为诱导多能干细胞

注意：在生成诱导多能干细胞（iPSCs）之前，须确保遵守所有关于人类iPSCs生成与使用的机构规章制度。无菌操作技术对于iPSC培养尤为重要，因为培养基通常不含有抗生素。为了成功实现重编程，神经嵴细胞（NECs）必须呈现健康状态并具有旺盛的增殖能力。

  1. 将每孔 5 × 105 个 NEC 接种至 6 孔组织培养板中。24 小时后，在 BEGM 中加入聚凝胺，使其终浓度为 8 µg/ml，并通过向培养基中添加表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的慢病毒颗粒来转导 NEC。目标为实现约 5 的感染复数（MOI）27。
    1. 为确定 MOI，对浓缩的慢病毒原液进行系列稀释，并用这些稀释液转导 HT1080 细胞。在 HT1080 细胞中首次明确检测到 dTomato 表达后，通过计数各稀释度中 dTomato 阳性细胞/小细胞团的数量，计算每毫升“转导单位”"的数量"。
      注意：通常会存在过高（全部为 dTomato 阳性）或过低（无阳性细胞或仅有少数阳性细胞）的稀释度。
    2. 对可识别出独立阳性细胞/小细胞团的稀释度进行计数。通过相应的稀释倍数校正每毫升转导单位数，从而确定病毒滴度。MOI 即为转导细胞数与病毒颗粒数之比27。
      注意：每个 dTomato 阳性细胞/小细胞团被认为来源于单个病毒颗粒。
  2. 转导约 3 小时后，移除培养基并更换为新鲜 BEGM。按照机构批准的程序丢弃含慢病毒的培养基。将转导后的 NEC 放回培养箱继续培养 3 天。
  3. 第 3 天，更换为新鲜 BEGM，再继续培养 3 天。吸除废弃培养基，用 1× PBS 洗涤细胞，每孔加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶溶液。按上述方法（第 5 节）用胰蛋白酶传代细胞。小心吸除上清液，将细胞重悬于 4 ml BEGM + P/S 中。可将细胞传代至已包被 BDC 的 6 孔板新孔中，或如准备就绪，可加入 MEF 培养物中（见下一步）。
  4. 制备 MEF 包被的培养板。第 4 天，在 6 孔板的两孔中各加入 0.1% 明胶溶液（1 ml/孔）（如需进行 ± Thiazovivin (SPT) 实验，请参见步骤 6.6）。次日，解冻一管灭活的 MEF28。
  5. 将 MEF 加入 10 ml MEF 培养基（DMEM + 1× NEAA + 10% dFCS）中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟以形成沉淀。用 MEF 培养基重悬细胞。吸除 6 孔板中的明胶溶液，每孔加入 1.87 × 105 个 MEF 至明胶包被的 6 孔板中。于 37 °C 过夜培养，或至少培养 24 小时。
  6. 将含转导细胞的 BEGM 每孔 2 ml 转移至预先包被的 6 孔板的两孔中，过夜培养。次日，将 BEGM 更换为每孔 2.5 ml 含 4 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子的标准 hESC 培养基。每日用新鲜 hESC 培养基 ± SPT 喂养细胞，持续 10 天。
    注意：可添加小分子化合物混合物（SB431542、PD0325901 和 Thiazovivin (SPT) 混合物）以提高 NEC 重编程的效率和速度23。
  7. 十天后，继续使用不含 SPT 的 hESC 培养基每日喂养。每日更换培养基，直至出现类似 hESC 的克隆（图 5A，P0 克隆）。根据其高核质比和明显的核仁特征，识别可能含有 iPSC 的克隆。
  8. 手动切除具有 hESC 样形态的克隆，并将其转移至不同的孔中，在无饲养层系统中分别培养和扩增为独立细胞系。切除的克隆应能迅速适应这些培养条件。
    1. 接种切除的克隆后，这些独立的潜在 iPSC 细胞系现被视为第 1 代（p1）。每日使用 mTeSR1 培养基喂养。按照标准操作进行 iPSC 细胞系的传代与扩增。p1 克隆可能需要数天至一周时间才能生长至适合传代的大小。

7. 培养中维持诱导多能干细胞

  1. 每天喂养并评估培养物。使用无菌玻璃移液管或微量移液器吸头刮除出现明显分化的区域。每日挑取后更换培养基。
  2. 大约每四天传代一次细胞：轻轻吸除培养基，每孔（6孔板）加入1 ml预热的Dispase溶液（1 mg/ml）（相当于喂养体积的一半），于37 °C孵育约4分钟。此时菌落边缘开始翘起，表现为菌落周围出现白色轮廓。轻轻吸除Dispase溶液，并用预热的DMEM/F12洗涤3次。
  3. 加入2 ml mTeSR1培养基，使用细胞刮刀将菌落从培养板上刮下。用5 ml血清移液管或P1000移液器轻轻吹打细胞，直至菌落分散成较小的细胞团。
    1. 避免产生过小的细胞团或单细胞，因为其存活率及后续增殖能力会显著降低。重新接种菌落时，按1:4至1:6的比例传代可维持最佳的菌落密度。轻柔地将菌落和培养基从原孔中转移，并接种至新的Matrigel包被的培养孔中。

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结果

鼻腔的起始部分称为鼻前庭，该区域由软骨包围29。采样刷需顺利通过鼻前庭，越过鼻瓣（内孔，或称鼻孔后方所见的“黑孔”），在下鼻甲处采集样本（图1）。鼻甲为骨性结构，可增加鼻腔表面积29，因此是理想的采样部位。该区域还覆有富含血管的黏膜组织，其结构与下呼吸道黏膜相似，并在应对环境暴露的免疫反应中具有活性。

正确取样组织可确保被重编程的细胞为上皮细胞。可通过初始细胞计数和细胞离心涂片法进行评估，也可通过观察培养中的细胞来判断。细胞离心涂片制备后经离心、干燥和染色，可显示样本的细胞组成。大多数样本由柱状且带有纤毛的上皮细胞构成，细胞具有一个圆形细胞核。使用Hema 3染色试剂盒染色后，细胞质呈浅蓝色，细胞核呈较深的紫色（图2）；当细胞直接从鼻腔获取时，常可见其成团聚集。尽管鼻腔细胞样本最初包含多种细胞类型以及鼻腔碎片，但随着培养时间的延长和培养基的更...

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讨论

鼻上皮细胞（NECs）是研究气道疾病的可及性平台，而NEC-iPSC为探索疾病的发生、治疗和疗法提供了令人振奋的途径1,31,32。NECs可通过无创或潜在伤害性较小的操作轻松获取6,23。根据我们的经验，按照本方案所述采集鼻黏膜样本对儿童而言似乎比抽血更少造成压力且更容易接受。因此，该方法可能特别适用于儿科患者群体，并与气道疾病的研究密切相关。NECs的另一优势在于，一旦进入培养阶段，通过培养基和培养条件的选择可富集上皮细胞并实现细胞群体的均一化。相比使用血液细胞等复杂组织，这种方法更具优势，也更便于利用转录组学和表观遗传学方法评估细胞来源对所获得iPSC细胞系的影响。

采集鼻黏膜样本时，必须确保采样部位正确，以获取尽可能多的上皮细胞，这一点可通过显微镜下观察细胞涂片来确认（图2）。正确的采样应获得≥90%的上皮细胞。获取健康受试者的样本至关重要，同时必须确保采样操作规范，以最大程度地提高所获得并接种的细胞数量。本方案中描述的旋转动作（第1.5节）可确保刷头尽可能广泛地接触鼻腔表面。当有异物接近面部时，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此致谢辛辛那提儿童医院的多能干细胞中心和共聚焦成像核心设施。本研究由以下项目资助：R21AI119236（HJ）、R21AI101375（HJ）、NIH/NCATS 8UL1TR000077-04（HJ）、U19 AI070412（HJ）和 2U19AI70235（GKKH）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 ml 锥形离心管Fisher Scientific14-959-49D实验步骤 1.1.
BEGM 培养基LonzaCC-3170实验步骤 1.1.
青霉素/链霉素/抗真菌剂（Penn/Strep/Fungicide）Life Technologies15240-062实验步骤 1.1.
青霉素/链霉素（Penn/Strep）Life Technologies15140-122实验步骤 4.a.
cytosoft 细胞刷Fisher Scientific22-263-357实验步骤 1.2.
台盼蓝（trypan blue）Fisher ScientificMT-25-900-CI实验步骤 2.1.
血细胞计数板（hemacytometer）Fisher Scientific02-671-54实验步骤 2.1.
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP2438-4实验步骤 2.2.
细胞学漏斗夹（Cytology Funnel Clips）Fisher Scientific10-357实验步骤 2.2.
细胞离心涂片漏斗（cytospin funnel）Fisher Scientific23-640-320实验步骤 2.2.
Cytospin 4 细胞离心涂片仪Fisher ScientificA78300003实验步骤 2.2.
空白载玻片（blank slide）Fisher ScientificS95933实验步骤 2.2.
hema 3 染色试剂盒Fisher Scientific22-122-911实验步骤 2.2.
牛皮 I 型胶原蛋白（Bovine Dermal Collagen, type 1）Life TechnologiesA1064401实验步骤 3.2.
T25 培养瓶Fisher Scientific08-772-45实验步骤 3.3.
胰蛋白酶（Trypsin）LonzaCC-5012实验步骤 5.2.
胰蛋白酶中和液（Trypsin Neutralizing Solution）LonzaCC-5002实验步骤 5.2.
胎牛血清（FBS），65 °C 热灭菌 30 分钟Sigma-AldrichF2442实验步骤 5.5.
二甲基亚砜 Hybri-Max™，无菌过滤，BioReagent 级，适用于杂交瘤，≥99.7%Sigma-AldrichD2650实验步骤 5.5.
多顺反子慢病毒（polycistronic lentivirus）*例如 MilliporeSCR511实验步骤 6.4. 
此处列出了一种商业来源的重编程载体。我们常规使用 Voelkel 等人（PMID: 20385817）报道的 4-in-1 质粒，在实验室内部制备 VSV-G 假型多顺反子重编程慢病毒。该质粒可通过联系 
聚凝胺（polybrene）Santa Cruz Biotechnologysc-134220实验步骤 6.4.
经照射处理的 CF1 小鼠胚胎成纤维细胞（Irradiated CF1 MEFs）GlobalStem GSC-6301G实验步骤 6.4.
人胚胎干细胞培养基（hESC media）参见本方案中提供的配方实验步骤 6.11.
SB431542Stemgent04-0010实验步骤 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006实验步骤 6.11.
Thiazovivin Stemgent04-0017实验步骤 6.11.
适用于人胚胎干细胞的 Matrigel（hESC-qualified Matrigel）BD Biosciences354277实验步骤 6.13.
Corning 6 孔板Fisher Scientific08-772-1B实验步骤 6.13.
mTeSR1 培养基StemCell5850实验步骤 6.13.
250 ml 一次性滤瓶（0.22 µm）FisherSCGP-U02-RE 
分散酶（dispase）StemCell7923实验步骤 7.3.
DMEM/F12 培养基Life Technologies11320-033实验步骤 7.3.
细胞刮刀（cell lifter）Fisher Scientific08-100-240实验步骤 7.4.
人胚胎干细胞培养基（hESC Media）**实验步骤 6.11.
各组分应混合后过滤除菌。培养基可在 4 °C 保存最多两周。温浴时，避免在 37 °C 超过 15 分钟
DMEM-F12 50/50 培养基Invitrogen 11330-032终浓度
敲除血清替代物（KO replacement serum, KO-SR）Invitrogen10828-0280.2
200 mM L-谷氨酰胺Invitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-巯基乙醇Invitrogen21985-0230.1 mM
100 倍非必需氨基酸Invitrogen11140-0501 倍
2 µg/ml 碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）Invitrogen13256-0294 ng/ml

参考文献

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从儿童鼻腔上皮细胞中进行原代培养并重编程为诱导性多能干细胞
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