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方法文章

从昆虫模型中测定感光细胞的光谱敏感性 在体 内 细胞内记录

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DOI：

10.3791/53829

⸱

2016年2月26日

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

本文内容

摘要

演示了细胞内记录的电生理技术，并用于测定蝴蝶复眼中单个感光细胞的光谱敏感性。

摘要

细胞内记录是一种强大的技术，用于确定单个细胞对特定刺激的反应方式。在视觉研究中，细胞内记录历来是研究单个感光细胞对不同光刺激敏感性的常用技术，至今仍在广泛使用。然而，目前文献中仍缺乏详细的实验方法，使得希望在眼部开展细胞内记录实验的研究人员难以重复相关操作。本文以昆虫作为研究眼生理学的通用模型。昆虫的感光细胞位于眼睛表面附近，易于触及，且参与视觉的许多机制在动物不同门类之间具有保守性。我们描述了在蝴蝶眼睛中进行感光细胞体内细胞内记录的基本操作流程，旨在使电生理经验较少的研究人员也能更便捷地掌握该技术。我们介绍了所需的基本设备、如何准备活体蝴蝶用于记录、如何将玻璃微电极插入单个细胞，以及最终的记录过程。此外，我们还解释了原始反应数据的基本分析方法，以确定不同类型细胞的光谱敏感性。尽管本实验方案主要聚焦于光谱敏感性的测定，但该装置同样适用于其他刺激（例如，偏振光）及方法的多种变体。

引言

通过测量细胞膜上离子流动引起的电压或电流变化，可以观察细胞（如神经元）的电学特性。目前已开发出多种电生理技术用于测量细胞中的生物电事件。动物眼睛中所含的神经元易于接近，且其神经环路通常比大脑中的更为简单，因此这些细胞是进行电生理研究的理想对象。眼内电生理学的常见应用包括视网膜电图（ERG）1,2和微电极细胞内记录。ERG技术涉及将电极置于动物眼球内部或表面，施加光刺激，并测量所有邻近细胞反应总和所导致的电压变化3-6。如果研究目标是特异性地表征单个感光细胞的光谱敏感性，通常多种细胞类型会对同一刺激以不同强度同时响应 ，因此仅从ERG数据中确定特定细胞类型的敏感性可能较为困难，尤其是在眼睛中存在多种光谱特性相似的感光细胞时。一种可能的解决方案是构建转基因Drosophila，使其眼部多数R1-6细胞表达目标感光细胞（视蛋白）基因，然后进行ERG记录7。该方法的潜在缺点包括感光蛋白表达量极低或完全不表达8，以及转基因动物的构建和筛选过程耗时较长。对于光谱上不同类型的感光细胞种类较少的眼睛，可通过使用彩色滤光片对眼睛进行适应性处理，降低某些细胞类型对ERG信号的贡献，从而有助于估算其光谱敏感性的峰值9。

细胞内记录是另一种技术，通过微电极刺入细胞并施加刺激，电极仅记录该单个细胞的反应，因此对多个单个细胞进行记录和分析，可以获得生理学上不同细胞类型的特异性敏感性10-14。尽管本实验方案主要关注光谱敏感性的分析，但使用锐利电极进行细胞内记录的基本原理可针对其他应用进行调整。例如，通过采用不同的样本制备方法，并使用尖端石英电极，可根据研究问题记录视叶更深层或其他脑区的信号。例如，单个感光细胞的反应时间15、视叶（包括外髓状体、内髓状体或叶状体17）16中的细胞活动、脑18或其他神经节19的活动，均可采用类似技术进行记录；此外，颜色刺激也可替换为偏振光刺激20-22或运动刺激23,24。

光转导是指光能被吸收并转化为电化学信号的过程，这一特性古老而普遍，几乎存在于当今所有动物门类中25。位于感光细胞中、负责启动视觉光转导的视觉色素是视紫红质（rhodopsin）。所有动物的视紫红质均由一种视蛋白（opsin）和一个与之结合的发色团组成，其中视蛋白属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族，发色团则来源于视黄醛或类似的分子26,27。视蛋白的氨基酸序列和发色团的结构会影响视紫红质对不同波长光的吸收能力。当发色团吸收一个光子后，视紫红质被激活，进而在细胞内启动G蛋白级联反应，最终导致膜结合离子通道的开放28。与大多数神经元不同，感光细胞发生的是分级电位变化，这种变化可通过光刺激强度改变所引起的反应幅度相对变化进行测量。通常情况下，特定类型的感光细胞仅表达一种视蛋白基因（尽管存在例外情况8,10,29-31）。复杂的色觉，如许多脊椎动物和节肢动物所具备的，依赖于包含数百至数千个感光细胞的复杂眼睛，每个细胞表达一种（偶尔为多种）视紫红质类型。视觉信息通过眼睛和大脑中复杂的下游神经信号，对感光细胞马赛克阵列的响应进行比较，从而形成包含颜色和运动信息的完整图像感知。

通过细胞内记录测量光感受器细胞对不同波长光的原始反应后，可以计算其光谱敏感度。该计算基于单变量原理（Principle of Univariance），该原理指出，光感受器细胞的反应仅取决于其吸收的光子数量，而与所吸收光子的具体性质无关32。任何被视紫红质吸收的光子都会引发相同类型的反应。实际上，这意味着细胞的原始反应幅度会因光照强度增加（可吸收的光子更多），或因波长向其敏感度峰值偏移（视紫红质对该波长的吸收概率更高）而增强。我们利用这一原理，将已知强度下同一波长的细胞反应，与相同强度但波长不同且相对敏感度未知条件下的反应进行关联。通常根据细胞敏感度达到峰值的波长来鉴定细胞类型。

本文介绍了一种用于记录和分析蝴蝶复眼中感光细胞光谱敏感性的细胞内记录方法，并着重于使该方法更易于被更广泛的研究群体所采用。尽管细胞内记录在文献中仍较为常见，尤其是在昆虫色觉研究领域，但我们发现，关于材料与方法的描述通常过于简略，难以据此重现该技术。我们以视频形式呈现本方法，旨在促进其更便捷地被复制和应用。同时，我们所描述的技术采用易于获取且价格合理的设备。我们还指出了在优化这一新颖且复杂的技术过程中常遇到但通常未被报道的注意事项，以避免研究进程因此类问题而延缓。

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方案

所有动物均尽可能以人道方式对待。昆虫以蛹的形式从哥斯达黎加昆虫供应公司（Costa Rica Entomological Supply，哥斯达黎加）运送。

1. Heliconius 蛹的饲养

  1. 使用昆虫针将所有蛹悬挂在加湿的培养箱中，蛹之间间隔 2-3 cm。
  2. 羽化后，让翅膀自然干燥，然后将蝴蝶在加湿培养箱中至少存活 1 天，并每天喂食稀释的蜂蜜溶液，之后再进行记录。
    1. 将蜂蜜按体积用水稀释至约 20% 的蜂蜜溶液，并倒入浅的培养皿中。
    2. 将单只蝴蝶逐一移至培养皿旁。当其前足跗节接触到溶液时，蝴蝶会自动伸出喙并从培养皿中吸食。如果其喙未自动伸出，可用镊子轻轻拉出喙，并将其引入蜂蜜溶液中。

2. 实验光照条件的光学轨迹、校准与测量

  1. 将一个带灯箱和通用电源的150 W氙弧灯及其附带的聚光镜组件放置在至少一米长的实验台一端，以提供明亮的白光。
    警告：氙弧灯会产生极强的光线，并具有强烈的紫外线强度。操作时应始终佩戴护目镜，并严格按照制造商说明使用，以防止紫外线与大气中的氧气相互作用产生臭氧。
  2. 设置一条长度为一米的光学轨道，使从灯箱组件射出的光线能够通过（图1）。
    1. 按以下顺序在光学轨道上依次放置各元件，各元件之间大致保持如下距离：1）在距聚光镜组件40 cm处放置一个凸面石英或熔融石英透镜；2）再沿轨道前进22 cm处放置一个中性密度滤光轮（当前光路中不插入任何滤光片）；3）在ND滤光片后14 cm处放置一个带驱动单元的快门；4）在快门后紧邻处放置一个凹面石英或熔融石英透镜；5）在轨道远端再前进6 cm处放置一个准直光束探头。
    2. 将一根直径为600 µm的光纤电缆连接至准直光束探头。
      注：根据光照强度的不同，可能需要使用直径为5–10 mm的光纤电缆，以向其他样品提供足够的光照，此时可替换使用。
    3. 调节每个光学元件的距离、高度和角度，使从组件射出的光束达到最大可能强度。
    4. 由于不同应用中光学轨道元件可能略有差异，请确保所有元件均能透过UVA和可见光范围（315–700 nm）的光。
  3. 完成光学轨道组装后，使用光谱仪测量通过该装置的光线。首先使用已知光谱的校准灯和制造商提供的软件对光谱仪进行校准。
    注：为便于说明，我们以下描述使用Ocean Optics的产品，但其他厂商（例如，Avantes）也提供类似产品。
    1. 在开始测量前至少45分钟开启钨灯校准光源 。
    2. 进行校准时，通过USB将光谱仪连接至安装有配套软件的计算机，然后使用可在紫外-可见光范围内传输的余弦校正器将光谱仪与钨灯校准光源连接。
    3. 在"文件"选项卡中选择"新建绝对辐照度测量"，并将光谱仪选为"光源"。
    4. 按照提示创建一个新的校准"cal"文件。当系统提示时，将提供的钨灯校准光源在可见光范围（300–800 nm）内的已知光谱数据文件载入软件，软件将自动根据光谱仪输出计算出校正后的光谱。
    5. 保存该校准文件。今后每次使用光谱仪测量光谱前，在初始化软件时均需加载此校准文件。
  4. 光谱仪校准完成后，使用其记录实验装置发出的光谱。此后每次打开软件时，选择"新建绝对辐照度测量"并加载之前保存的校准文件。接下来通过遮挡光谱仪的所有入射光来采集暗背景光谱。
    1. 在光谱仪当前测量所需实验光照条件的情况下，调整积分时间（4毫秒）、平均扫描次数（5次）和箱形平均宽度（5），使光谱得到适当缩放和平滑处理。所有光谱测量均应保持设置一致，以便比较不同测量之间的光强。
  5. 测量未衰减的白光光谱、实验中将使用的所有中性密度滤光片的光谱，以及每种带通干涉滤光片的光谱（图2）。
    1. 将第2.2.2步中的光纤电缆自由端连接至光谱仪，在光路中不加任何滤光片的情况下测量白光光谱。加载第2.3步中保存的校准文件，使用光谱仪软件将白光光谱保存为文本文件。
      注：以文本文件格式保存的光谱数据在一列中列出波长（x坐标），在第二列中列出光强（y坐标），以便将数据导入电子表格用于第2.6步的计算。
    2. 采用与第2.5.1步相同的设置，通过旋转光学轨道上的中性密度（ND）滤光轮，依次记录实验中使用的各个光密度（OD）（0–3.5 OD）下的光谱，并为每个OD值保存对应的文本文件。
    3. 采用与第2.5.1步相同的设置，将半带宽为10 nm的干涉滤光片逐一插入光路，记录每种滤光片对应的光谱。对41种不同的干涉滤光片重复此操作，其峰值透射波长从300 nm到700 nm每隔10 nm分布一次。对于大多数应用，滤光片间隔更宽（20 nm）亦可接受（光谱参见图2）。
  6. 校正因在光路中插入干涉滤光片而导致的光强差异。每种干涉滤光片允许通过的光子总数不同，某些滤光片透射率较低，难以进一步衰减光强，从而难以使所有滤光片通过的光子数相等。
    1. 为计算每个10 nm带宽干涉滤光片的相对光强（I），求解公式 I = T/sec 中的 I，其中 T 为每个10 nm干涉滤光片光谱曲线下的面积（来自第2.5.3步），s 为白光在每个滤光片峰值波长处的最大绝对辐照度（即第2.5.1步所保存文本文件中的y值）（参见图2 中520 nm处的示例）。
    2. 将所有计算得到的光强值除以第2.6.1步中计算出的最大光强值，归一化至1，再取归一化后相对值的倒数，作为校正因子，用于校正各波长下的原始敏感度（见第6.4步）。
  7. 第2.1至2.6步仅需在一组实验开始前执行一次。在实验过程中，应定期记录氙弧灯在强光及中性密度滤光片条件下的绝对辐照度，以确保光刺激强度未发生变化。
  8. 在实验过程中，若细胞对通过干涉滤光片的光刺激响应接近最大响应幅度，应使用ND滤光片衰减信号。若实验中使用了ND滤光片，则在计算光谱敏感度时需计入相应的光强衰减。
  9. 应在实验开始前数天或数周设置好光学轨道、校准系统和滤光片。滤光片应保持遮盖，以防灰尘积聚。

3. 录音设备设置

  1. 将用于校准的同一根光纤电缆穿过法拉第笼，并安装在如卡丹臂周长计之类的测角装置上（示意图见图3 ）。该电缆应距离样本眼睛约10 cm。
  2. 将一个金属载物台放置在隔振台上，并在载物台正上方通过显微操作器控制安装电极夹持器（图4）。将卡丹臂放置好，使样本头部位于该臂旋转运动所形成的球体中心。
  3. 使用包含放大器（置于法拉第笼外）和前置放大器（头级放大器，位于法拉第笼内靠近样本处）的细胞内记录前置放大系统，将头级放大器安装在样本将被放置的金属载物台上方。
    1. 通过BNC接口将同轴电缆连接至头级放大器。仅剥开同轴电缆另一端的尖端部分，分离电缆的外层金属屏蔽层与内部导线。
    2. 将外层屏蔽层（保持接地电位）焊接到一根带鳄鱼夹的绝缘铜线的一端。该鳄鱼夹将连接至样本平台上的金属参考电极（步骤5.1.4）。
    3. 将同轴电缆的内芯导线焊接到一根细银丝上，作为记录电极。该银丝应足够细，以便插入步骤5.2.3中充满溶液的玻璃电极内。
  4. 将连接在摆臂和底座上的体视显微镜放置在法拉第笼外的木制实验台上，使其可摆动进入以将电极插入眼内，并在电极进入眼内后再次摆出。
  5. 确保法拉第笼内所有金属部件均正确接地。
  6. 在法拉第笼外，将前置放大器连接至50-60 Hz噪声抑制器的输入端（可选），并使用BNC T型接头将输出端连接至示波器的一个通道。
  7. 利用T型接头的另一端，将通过示波器的信号连接至硬件的一个通道。通过USB线缆将该硬件连接至计算机，从而使软件能够读取前置放大器记录的反应信号。
  8. 使用另一个T型接头，将光学轨道上的快门驱动器连接至示波器的第二个通道，并将此连接至脉冲发生器，以控制递送至眼睛的光脉冲频率和持续时间（步骤5.5）。
    注意：实验装置本身的搭建通常只需进行一次。在此暂停，直至准备开始记录。

4. 记录当天的准备

  1. 实验前至少45分钟打开氙灯，并在拉制玻璃微电极前至少30分钟开启玻璃微电极拉制仪。
  2. 开启所有记录设备（快门、放大器、噪声消除器、脉冲发生器、示波器和数据采集硬件），并确保快门默认处于关闭状态，以防止光线通过光纤电缆。
  3. 使用玻璃微电极拉制仪拉制细的硼硅酸盐（或铝硅酸盐）玻璃微电极（理想电阻为100–250 MΩ）。拉制后的玻璃电极应在数小时内使用。
  4. 用3 M氯化钾（KCl）溶液反向充填电极。请注意，可根据研究人员需要调整该溶液，e.g. 用于染料注射。

5. 标本制备与记录流程

  1. 制备样本
    1. 用热蜡将一只蝴蝶固定在小型塑料管内，使头部保持不动并从管的一端伸出。用蜡固定口器、触角和翅膀（图5).
    2. 用一块干燥的石蜡固定腹部，并通过在腹部后方的管内放置湿润的纸巾以保持管内湿润。确保标本完全静止不动。
    3. 使用少量石蜡将试管固定在带有球窝关节的小平台上，该平台连接至磁性底座。
    4. 在解剖显微镜下，将一根直径为0.125 mm的银丝通过口器插入昆虫头部，作为参考电极。实验前，将该银丝永久固定在平台上，确保当平台置于记录台时，3.3.2步骤中的铜丝可与之连接。
    5. 参考电极置于合适位置后，可通过迅速加热并冷却导线周围的石蜡将其固定。
    6. 使用可折断的碳钢剃须刀片，用刀片夹夹住刀片的一部分，折断一小段用于切割角膜。
    7. 使用剃刀片在左角膜上切出一个小孔（直径约10个小眼），并用凡士林密封小孔以防止干燥。
  2. 角膜切开后，应尽快将记录电极插入眼内，因为眼内的血淋巴会迅速凝固，导致电极无法插入。若条件允许，应在记录装置中进行解剖操作。
    注意： 凡士林不应涂抹于眼睛的其他部位，否则会导致光学成像失焦。
    1. 若尚未放置于载物台上，将安装好的标本及平台置于记录装置的载物台上。使用鳄鱼夹将步骤3.3.2中的前置放大器接地线连接至标本平台上的参考电极。
      注意： 如果可能，使用红色滤光片照射动物。
    2. 使用带有鹅颈管附件的光源，在体视显微镜下短暂照射标本，同时将记录电极插入眼部。
    3. 将步骤 3.3.3 中连接至前置放大器的银丝插入玻璃微电极后端的 KCl 溶液中。将玻璃电极安装在电极夹持器上。
    4. 调整电极夹持器，使微电极位于角膜 previously 切开的孔正上方，距角膜约一毫米。使用显微操作器将微电极缓慢降入眼内，直至电路接通，示波器上显示电位（mV）发生显著变化。
  3. 进入眼睛后，将体视显微镜移至法拉第笼外，并关闭照射样本的光源。房间应保持黑暗，以便眼睛适应暗环境。
  4. 通过放大器施加1 nA电流并记录电压变化，检测电极的电阻。电阻值通常应在100–250 MΩ范围内。电阻过高提示电极堵塞或弯曲，电阻过低则提示电极断裂。
  5. 启动脉冲发生器，使快门打开，每隔0.5秒释放一次持续时间为50毫秒的闪光，并在整个实验过程中持续闪烁。
    1. 调节脉冲发生器，使其产生最长持续时间为50毫秒的闪光。该闪光持续时间及闪光间0.5秒的间隔可使标本在整个实验过程中尽可能保持暗适应状态。50毫秒接近能够引发与较长闪光相同反应幅度的最短闪光持续时间。
    2. 在实验开始和结束时重新测量反应（步骤 5.16）。在约二十分钟的实验过程中，这些闪光设置不会随时间推移而降低反应水平。不同的制备样本可能需要对这些闪光设置进行调整。
  6. 将万向臂放置到位，使光纤电缆朝向眼睛。
  7. 使用示波器检测每次闪光引起的电压变化。电压的负向变化表明电极尚未进入细胞。
  8. 移动万向臂，使其围绕样本调整至眼睛处电压响应最大的角度位置。
  9. 来回旋转显微操作器，使电极在两个方向上产生微小的垂直移动，同时轻轻敲击电极架底部或使用前置放大器上的 Buzz 功能。持续进行微调，直至示波器上出现去极化光反应（图6).
  10. 再次调整万向臂，找到入射角使闪光产生的去极化信号最大。使用显微操作器进行微调，并根据需要使用放大器上的“Buzz”功能，确保电极稳定记录细胞，并能在整个实验过程中保持在细胞内（参见步骤5.11）。
  11. 一旦装置稳定，开始记录。稳定的记录应表现为静息电位几乎无变化、背景噪声低，并具有稳定且显著的去极化反应（信噪比至少达到10:1）。
    1. 在计算机上运行软件，然后开始 "新实验，" 将打开一个包含四个通道的弹出窗口。
    2. 在软件窗口右上角将电压量程调整为 500 mV。第一通道将实时显示来自电极的记录信号，第二通道将记录函数发生器产生的方波信号（若该信号通过示波器输入至数据采集硬件），以显示快门开启的时间点。其余两个通道无需使用。
    3. 点击 "开始" 在右下角开始录制，让软件在整个实验过程中持续运行。调整 x 轴（时间）和 y 轴（电压）的缩放比例，使反应信号清晰可见。
  12. 首先，使用白光照射，在中性密度滤光轮（ND滤光轮）设置为3.5 OD时记录最多10次单独的反应（每次约5–10秒）。
  13. 接着在3.3 OD下记录相同数量的反应，然后依次在3.1、3.0、2.5、2.3、2.1等条件下记录，直至0.0 OD，涵盖所有组合。这些对中性密度滤光片系列的反应幅度将在第6节中用于绘制反应-对数强度曲线。若出现漂白现象，应在实验过程中减少强刺激闪光的次数。
  14. 使用干涉滤光片记录细胞对所有波长的反应。
    1. 首先确定峰值波长。在光路中不使用中性密度滤光片（0.0 OD）的情况下，将紫外透射滤光片置于光路中，短暂观察反应幅度。随后依次使用蓝光透射滤光片、绿光透射滤光片和红光透射滤光片重复该步骤，以初步判断峰值反应所在波长范围。
    2. 在步骤5.14.1中，使用波长约为350、450、550和650 nm的滤光片来确定峰值敏感度的大致范围。此初步搜索阶段无需精确波长，因为所有波长将在下一步中被记录。若已有关于峰值敏感度的估计值或先前记录结果，可直接使用已知波长快速确定峰值响应。
    3. 一旦确定峰值响应或接近峰值响应的波长，即在此波长下记录10次响应（约5秒）。
    4. 在记录峰值响应波长的数据后，使用其他干涉滤光片，以10 nm为间隔，从300 nm到700 nm依次记录。从峰值波长开始，通过逐个更换光路中的滤光片，分别向更短和更长波长方向逐步测量（例如 如果峰值反应位于520 nm，首先记录该波长下的反应，然后依次记录510 nm、530 nm、500 nm、540 nm、490 nm、550 nm，依此类推，直至无反应为止。
    5. 每个滤光片最多允许记录10次反应（每次5秒）。更换干扰滤光片时，让细胞对1-2次无滤光片的白光闪光产生反应，以监测峰值反应是否随时间衰减。若出现漂白现象，应减少反应次数或增加光密度（OD）。
  15. 如果在0 OD白光下的任何干涉滤光片的响应接近最大响应，则需使用中性密度（ND）滤光片进行衰减。本实验所用的干涉滤光片及光纤电缆尺寸会显著衰减光强，因此通常无需使用ND滤光片。
  16. 如果记录保持稳定，则重新记录峰值反应附近的波长，以此作为假重复，用于确认先前的反应幅度，并有助于确保反应未随时间衰减。完成所有波长的记录后，按照步骤5.12的方法，重新记录在中性密度滤光片（ND系列）条件下的反应。
  17. 记录完成后，单击 "停止" 在软件中保存录制内容以供分析。
  18. 实验结束后，通过冷冻处死个体，或先冷却数分钟，随后迅速切断头部并压碎胸部。
  19. 关闭所有设备。如需在分析前暂停，可在此处中断。

6. 光谱敏感性分析

  1. 使用记录原始反应的软件，分别计算ND滤光片系列中每个滤光片以及每个干涉滤光片的10次独立反应的平均反应幅度。
  2. 根据第5.12–5.13步记录的ND滤光片系列数据，绘制反应-对数强度（VlogI）函数（图7），方法是将强度的对数单位（OD）作为X轴，将每个强度对应的反应值作为Y轴进行作图。
    1. 为获得细胞在不同波长下的光谱敏感性，通常需将Naka-Rushton方程拟合到第6.2步的数据，并利用该方程将实验测得的不同波长的光谱反应与在恒定波长（本例中为白光）下引发该反应所需的相对光子数关联起来。
      注：Naka-Rushton方程为：V/Vmax = In/(In + Kn)，其中I为刺激强度，V为反应幅度，Vmax为最大反应幅度，K为产生½ Vmax的刺激强度，n为指数斜率。可通过曲线拟合软件或基于代码的统计软件包等多种方法将该方程拟合至VlogI数据。
    2. 若使用简单的计算和电子表格程序拟合Naka-Rushton方程，需对每个刺激强度的VlogI反应数据进行转换：log[(Vmax/V) - 1]。然后对转换后的数据进行线性回归，得到最佳拟合直线的方程。
      注：Vmax必须大于任何实测反应值；为保持一致性，本方法将Vmax估计为最高实测反应值的101%。
    3. 根据回归直线方程，通过取负斜率估计指数（n），并计算log(K) = 截距/n。
  3. 在估算出Vmax、n和K的参数后，将特定波长下测得的光谱反应值代入V，求解I，从而确定在每个波长下引发细胞光谱反应所需的相对光子数。
  4. 将第6.3步计算得到的刺激强度（I）乘以每个波长下各干涉滤光片的校正因子（来自第2.4.3步）。
  5. 为获得敏感性，所有强度必须与V-logI曲线相关联以便比较。可通过将各波长的强度与第6.2.3步计算得到的½ Vmax或K进行比较来实现。
    1. 从K中减去每个经校正的波长强度（第6.4步）。 
    2. 然后对每个波长强度，将此“与K的距离”值加至K，并乘以(-1)。 
    3. 接着，通过向每个波长的数据点加上该序列中最小数据点的绝对值，使所有数据点变为正值。
  6. 通过取第6.5.1步中新计算的所有强度的倒数，得到各波长下的敏感性。对数据进行转换，使敏感性光谱落在0至1之间。
  7. 在记录多个同类型细胞的反应后，对最终结果取平均值，并以标准误差条或95%置信区间作图（图8）。 

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结果

对于记录装置的许多组成部分，仅靠文字描述无法提供足够的细节. 图1 是完整记录装置中所涉及组件的示意图。在 图2， 为白光及每种干涉滤光片绘制光谱，以说明为何需要校正因子以及计算该校正因子所需的信息。 图3 展示了用于这些实验的卡丹臂的照片和示意图。 图4 是一张显示记录阶段和显微操作仪的复合图像。 图5 展示了实验前准备蝴蝶的多个步骤。 

一旦开始记录，光刺激引起的电压负向变化表明电极位于细胞外，如图6a所示。反应强度取决于电极尖端与感光细胞的接近程度以及光刺激的入射角度。在电极尖端接近到足以刺入细胞之前，反应应足够大（>30 mV）。图6b显示了对光刺激明显的去极化反应，表明电极已进入感光细胞。静息电位应保持稳定，反应幅度应较大（至少40 mV），尽管绝对幅度可能存在较大差异。我们测量的是相对反应，因此更重要的是信噪比要高。如...

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讨论

细胞内记录是一种较难掌握的技术，因其涉及诸多技术步骤。要获得成功的实验结果，必须考虑几个关键因素。首先，实验所用的平台必须具备良好的防振性能。许多研究人员使用气浮台，其台面与底座完全分离，可提供优异的振动隔离效果。我们的实验装置采用一块厚重的大理石台面，上方放置一个沙箱，将显微操作器、电极夹持器和样品台装置置于其中。这是一种有效且成本较低的替代方案，尤其适用于无法方便获取室内气体或压缩空气的实验室。此外，还可采取其他减振措施，例如使用被动式空气悬浮系统，或在桌腿上加装缓冲元件例如，打开的网球、自行车内胎、厚凝胶垫）。此外，实验装置必须置于法拉第笼内，且所有设备需妥善接地。法拉第笼前方应设有可拆卸的金属网屏蔽层，以便在笼内操作时取下，记录时重新装回。即使少量的环境电噪声（尤其是来自交流电源的50 Hz噪声）也可能导致原本良好的记录无法使用。

在制备样本时，包绕小眼的血淋巴和色素层可能会阻碍成功记录。如果角膜上的切口过大，体内血淋巴的正常泵动会导致切口处液面上下移动，从而引起记录不稳定。一旦切开，即使使用凡士林密封，血淋巴和表面色素层也会迅速凝结成无法穿透的痂状物，因...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢已故的 Rudy Limburg 制作了万向节臂视野计，感谢 Kimberly Jamison、Matthew McHenry 和 Raju Metherate 借给我们设备，感谢 Almut Kelber 和 Kentaro Arikawa 的鼓励。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金（授予 KJM）以及 NSF 资助项目 IOS-1257627（授予 A.D.B.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蝴蝶蛹可提供多种本地物种，跨州运输需美国农业部（USDA）许可。Carolina Bio Supply 公司提供多种可在美国境内订购的昆虫物种，无需额外许可。
大型塑料圆筒任何能够保持湿润的培养室均可使用
2号昆虫针BioQuip1208B2
100% 沙漠牧豆树蜂蜜特易购任何蜂蜜或蔗糖溶液均可使用
氙弧灯Oriel Instruments66003Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
通用电源供应器Oriel Instruments68805Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
光学追踪Oriel Instruments11190Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
大型轨道载具（2个）Oriel Instruments11641Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
小型轨道载具（4x）Oriel Instruments11647Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
螺纹适配器，8-32外螺纹转1/4-20外螺纹，每包10个Newport CorporationTA-8Q20-10
光学安装柱，1.0 英寸，0.5 英寸直径，不锈钢，8-32 && 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
无滑动光学柱架，2英寸，0.5英寸直径柱，1/4-20（5个）Newport CorporationVPH-2
固定镜头接口，50.8 毫米纽波特公司LH-2
固定镜头接口，25.4 mmNewport CorporationLH-1
聚光镜组件Newport Corporation60006
凸面石英透镜，50.8 mmNewport CorporationSPX055
六位置滤光轮，x2Newport CorporationFW1X6
滤光轮安装轮毂Newport CorporationFWM
凹面二氧化硅透镜，25.4 mmNewport CorporationSPC034
准直器支架Newport Corporation77612
准直光束探头Newport Corporation77644
套管转换器，SMA端接转11 mm标准套管Newport Corporation77670该适配器可使光纤装入准直器支架中 
600 μ直径为 m 的紫外-可见光光纤电缆Oriel Instruments78367Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
带驱动单元的快门Uniblitz100-2B
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.1 OD纽波特FRQ-ND01
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.3 光密度纽波特FRQ-ND03
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.5 OD纽波特FRQ-ND05
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，1.0 OD纽波特FRQ-ND10
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，2.0 OD纽波特FRQ-ND30
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，3.0 OD纽波特FRQ-ND50
LS-1-Cal 灯海洋光学LS-1-Cal
光谱仪海洋光学USB-2000
SpectraSuite 软件海洋光学
300 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67749
310 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67752
320 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67754
330 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67756
340 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65614
350 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67757
360 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67760
370 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67761
380 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67762
390 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67763
400 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65732
410 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65619
420 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65621
430 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65622
440 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67764
450 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65625
460 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67765
470 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65629
480 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65630
492 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65633
500 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65634
510 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65637
干涉带通滤光片，520 nm Edmund Optics65639
532 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65640
540 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65642
550 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65644
560 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67766
570 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67767
580 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65646
589 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65647
600 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65648
610 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65649
620 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65650
632 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65651
640 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65653
650 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65655
660 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67769
671 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65657
680 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67770
690 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65659
700 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67771
法拉第笼任何可接地且适合实验装置的金属结构均可使用。
体视显微镜，6倍、12倍、25倍、50倍放大倍数Wild Heerbrugg野生型 M5任何体视显微镜均可使用
带摆动臂和重型底座的显微镜支架McBain Instruments任何带有支架的重型底座均可
万向节定制构建，参见 <强>图4
Fiber-lite 高强度照明器Dolan-JennerMI-150用于样本照明
光纤灯鹅颈导光管Dolan-JennerEEG 2823任何鹅颈灯导管均可使用
大理石台面
抬高的木桌应在该桌子中间开孔，以便沙盘能够放置在下方的大理石桌面上
装有沙子的木箱定制构建，任何装有沙子的盒子
操作器卡尔·蔡司 - 耶拿
电极夹 holder
样品台
用于接地的鳄鱼夹导线
绝缘铜线
银丝，直径0.125 mm世界精密仪器公司AGW0510
BNC 电缆
前置放大器与前置放大头stageDagan CorporationIX2-700
Humbug 噪声消除器Quest Scientific恶作剧
示波器，30 MHz，2通道，双踪，交替触发，不带探头EZ Digitalos-5030
BNC T型接头
Powerlab 硬件 2/20ADI 仪器ML820
Labchart 软件ADI 仪器图表 5
10 MHz 脉冲发生器BK Precision4030
玻璃微量移液器拉制仪Sutter InstrumentsP-87
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管World Precision Instruments1B120F-4
氯化钾，3 M
带槽塑料管
低熔点石蜡
电烙铁韦勒
带球窝磁性底座的平台Hama 照片和视频
双刃碳钢可折断剃须刀片电子显微镜科学公司72004
凡士林
Microsoft Excel微软

参考文献

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