方法文章

从昆虫模型中测定感光细胞的光谱敏感性 在体 内 细胞内记录

DOI：

10.3791/53829

⸱

2016年2月26日

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

演示了细胞内记录的电生理技术，并用于测定蝴蝶复眼中单个感光细胞的光谱敏感性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞内记录是一种强大的技术，用于确定单个细胞对特定刺激的反应方式。在视觉研究中，细胞内记录历来是研究单个感光细胞对不同光刺激敏感性的常用技术，至今仍在广泛使用。然而，目前文献中仍缺乏详细的实验方法，使得希望在眼部开展细胞内记录实验的研究人员难以重复相关操作。本文以昆虫作为研究眼生理学的通用模型。昆虫的感光细胞位于眼睛表面附近，易于触及，且参与视觉的许多机制在动物不同门类之间具有保守性。我们描述了在蝴蝶眼睛中进行感光细胞体内细胞内记录的基本操作流程，旨在使电生理经验较少的研究人员也能更便捷地掌握该技术。我们介绍了所需的基本设备、如何准备活体蝴蝶用于记录、如何将玻璃微电极插入单个细胞，以及最终的记录过程。此外，我们还解释了原始反应数据的基本分析方法，以确定不同类型细胞的光谱敏感性。尽管本实验方案主要聚焦于光谱敏感性的测定，但该装置同样适用于其他刺激（例如，偏振光）及方法的多种变体。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过测量细胞膜上离子流动引起的电压或电流变化，可以观察细胞（如神经元）的电学特性。目前已开发出多种电生理技术用于测量细胞中的生物电事件。动物眼睛中所含的神经元易于接近，且其神经环路通常比大脑中的更为简单，因此这些细胞是进行电生理研究的理想对象。眼内电生理学的常见应用包括视网膜电图（ERG）1,2和微电极细胞内记录。ERG技术涉及将电极置于动物眼球内部或表面，施加光刺激，并测量所有邻近细胞反应总和所导致的电压变化3-6。如果研究目标是特异性地表征单个感光细胞的光谱敏感性，通常多种细胞类型会对同一刺激以不同强度同时响应 ，因此仅从ERG数据中确定特定细胞类型的敏感性可能较为困难，尤其是在眼睛中存在多种光谱特性相似的感光细胞时。一种可能的解决方案是构建转基因Drosophila，使其眼部多数R1-6细胞表达目标感光细胞（视蛋白）基因，然后进行ERG记录7。该方法的潜在缺点包括感光蛋白表达量极低或完全不表达8，以及转基因动物的构建和筛选过程耗时较长。对于光谱上不同类型的感光细胞种类较少的眼睛，可通过使用彩色滤光片对眼睛进行适应性处理，降低某些细胞类型对ERG信号的贡献，从而有助于估算其光谱敏感性的峰值9。

细胞内记录是另一种技术，通过微电极刺入细胞并施加刺激，电极仅记录该单个细胞的反应，因此对多个单个细胞进行记录和分析，可以获得生理学上不同细胞类型....

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方案

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所有动物均尽可能以人道方式对待。昆虫以蛹的形式从哥斯达黎加昆虫供应公司（Costa Rica Entomological Supply，哥斯达黎加）运送。

1. Heliconius 蛹的饲养

  1. 使用昆虫针将所有蛹悬挂在加湿的培养箱中，蛹之间间隔 2-3 cm。
  2. 羽化后，让翅膀自然干燥，然后将蝴蝶在加湿培养箱中至少存活 1 天，并每天喂食稀释的蜂蜜溶液，之后再进行记录。
    1. 将蜂蜜按体积用水稀释至约 20% 的蜂蜜溶液，并倒入浅的培养皿中。
    2. 将单只蝴蝶逐一移至培养皿旁。当其前足跗节接触到溶液时，蝴蝶会自动伸出喙并从培养皿中吸食。如果其喙未自动伸出，可用镊子轻轻拉出喙，并将其引入蜂蜜溶液中。

2. 实验光照条件的光学轨迹、校准与测量

  1. 将一个带灯箱和通用电源的150 W氙弧灯及其附带的聚光镜组件放置在至少一米长的实验台一端，以提供明亮的白光。
    警告：氙弧灯会产生极强的光线，并具有强烈的紫外线强度。操作时应始终佩戴护目镜，并严格按照制造商说明使用，以防止紫外线与大气中的氧气相互作用产生臭氧。
  2. 设置一条长度为一米的光学轨道，使从灯箱组件射出的光线能够通过（图1）。
    1. 按以下顺序在光学轨道上依次放置各元件，各元件之间大....

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于记录装置的许多组成部分，仅靠文字描述无法提供足够的细节。 图1是完整记录装置中所涉及组件的示意图。图2绘制了白光及每种干涉滤光片的光谱，以说明为何需要校正因子以及计算该校正因子所需的信息。图3展示了本实验所用万向节臂的照片和示意图。图4是一幅组合图像，显示了记录平台和显微操作器。图5展示了蝴蝶实验前准备过程中的多个步骤。

一旦开始记录，光刺激引起的电压负向变化表明电极位于细胞外，如图6a所示。反应强度取决于电极尖端与感光细胞的接近程度以及光刺激的入射角度。在电极尖端接近到足以刺入细胞之前，反应应足够大（>30 mV）。图6b显示了对光刺激明显的去极化反应，表明电极已进入感光细胞。静息电位应保持稳定，且反应幅度应较大（至少40 mV），尽管绝对幅度可能存在较大差异。我们测量的是相对反应，因此更重要的是信噪比要高。如果静息电.......

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞内记录是一种较难掌握的技术，因其涉及诸多技术步骤。要获得成功的实验结果，必须考虑几个关键因素。首先，实验所用的平台必须具备良好的防振性能。许多研究人员使用气浮台，其台面与底座完全分离，可提供优异的振动隔离效果。我们的实验装置采用一块厚重的大理石台面，上方放置一个沙箱，将显微操作器、电极夹持器和样品台装置置于其中。这是一种有效且成本较低的替代方案，尤其适用于无法方便获取室内气体或压缩空气的实验室。此外，还可采取其他减振措施，例如使用被动式空气悬浮系统，或在桌腿上加装缓冲元件例如，打开的网球、自行车内胎、厚凝胶垫）。此外，实验装置必须置于法拉第笼内，且所有设备需妥善接地。法拉第笼前方应设有可拆卸的金属网屏蔽层，以便在笼内操作时取下，记录时重新装回。即使少量的环境电噪声（尤其是来自交流电源的50 Hz噪声）也可能导致原本良好的记录无法使用。

在制备样本时，包绕小眼的血淋巴和色素层可能会阻碍成功记录。如果角膜上的切口过大，体内血淋巴的正常泵动会导致切口处液面上下移动，从而引起记录不稳定。一旦切开，即使使用凡士林密封，血淋巴和表面色素层也会迅速凝结成无法穿透的痂状物，因.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢已故的 Rudy Limburg 制作了万向节臂视野计，感谢 Kimberly Jamison、Matthew McHenry 和 Raju Metherate 借给我们设备，感谢 Almut Kelber 和 Kentaro Arikawa 的鼓励。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金（授予 KJM）以及 NSF 资助项目 IOS-1257627（授予 A.D.B.）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蝴蝶蛹可提供多种本地物种，跨州运输需美国农业部（USDA）许可。Carolina Bio Supply 公司提供多种可在美国境内订购的昆虫物种，无需额外许可。
大型塑料圆筒任何能够保持湿润的培养室均可使用
2号昆虫针BioQuip1208B2
100% 沙漠牧豆树蜂蜜特易购任何蜂蜜或蔗糖溶液均可使用
氙弧灯Oriel Instruments66003Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
通用电源供应器Oriel Instruments68805Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
光学追踪Oriel Instruments11190Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
大型轨道载具（2个）Oriel Instruments11641Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
小型轨道载具（4x）Oriel Instruments11647Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
螺纹适配器，8-32外螺纹转1/4-20外螺纹，每包10个Newport CorporationTA-8Q20-10
光学安装柱，1.0 英寸，0.5 英寸直径，不锈钢，8-32 && 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
无滑动光学柱架，2英寸，0.5英寸直径柱，1/4-20（5个）Newport CorporationVPH-2
固定镜头接口，50.8 毫米纽波特公司LH-2
固定镜头接口，25.4 mmNewport CorporationLH-1
聚光镜组件Newport Corporation60006
凸面石英透镜，50.8 mmNewport CorporationSPX055
六位置滤光轮，x2Newport CorporationFW1X6
滤光轮安装轮毂Newport CorporationFWM
凹面二氧化硅透镜，25.4 mmNewport CorporationSPC034
准直器支架Newport Corporation77612
准直光束探头Newport Corporation77644
套管转换器，SMA端接转11 mm标准套管Newport Corporation77670该适配器可使光纤装入准直器支架中 
600 μ直径为 m 的紫外-可见光光纤电缆Oriel Instruments78367Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分
带驱动单元的快门Uniblitz100-2B
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.1 OD纽波特FRQ-ND01
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.3 光密度纽波特FRQ-ND03
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.5 OD纽波特FRQ-ND05
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，1.0 OD纽波特FRQ-ND10
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，2.0 OD纽波特FRQ-ND30
紫外熔融石英金属中性密度滤光片，3.0 OD纽波特FRQ-ND50
LS-1-Cal 灯海洋光学LS-1-Cal
光谱仪海洋光学USB-2000
SpectraSuite 软件海洋光学
300 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67749
310 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67752
320 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67754
330 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67756
340 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65614
350 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67757
360 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67760
370 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67761
380 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67762
390 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67763
400 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65732
410 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65619
420 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65621
430 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65622
440 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67764
450 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65625
460 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67765
470 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65629
480 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65630
492 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65633
500 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65634
510 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65637
干涉带通滤光片，520 nm Edmund Optics65639
532 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65640
540 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65642
550 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65644
560 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67766
570 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67767
580 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65646
589 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65647
600 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65648
610 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65649
620 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65650
632 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65651
640 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65653
650 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65655
660 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67769
671 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65657
680 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67770
690 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics65659
700 nm 干涉带通滤光片 Edmund Optics67771
法拉第笼任何可接地且适合实验装置的金属结构均可使用。
体视显微镜，6倍、12倍、25倍、50倍放大倍数Wild Heerbrugg野生型 M5任何体视显微镜均可使用
带摆动臂和重型底座的显微镜支架McBain Instruments任何带有支架的重型底座均可
万向节定制构建，参见 <强>图4
Fiber-lite 高强度照明器Dolan-JennerMI-150用于样本照明
光纤灯鹅颈导光管Dolan-JennerEEG 2823任何鹅颈灯导管均可使用
大理石台面
抬高的木桌应在该桌子中间开孔，以便沙盘能够放置在下方的大理石桌面上
装有沙子的木箱定制构建，任何装有沙子的盒子
操作器卡尔·蔡司 - 耶拿
电极夹 holder
样品台
用于接地的鳄鱼夹导线
绝缘铜线
银丝，直径0.125 mm世界精密仪器公司AGW0510
BNC 电缆
前置放大器与前置放大头stageDagan CorporationIX2-700
Humbug 噪声消除器Quest Scientific恶作剧
示波器，30 MHz，2通道，双踪，交替触发，不带探头EZ Digitalos-5030
BNC T型接头
Powerlab 硬件 2/20ADI 仪器ML820
Labchart 软件ADI 仪器图表 5
10 MHz 脉冲发生器BK Precision4030
玻璃微量移液器拉制仪Sutter InstrumentsP-87
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管World Precision Instruments1B120F-4
氯化钾，3 M
带槽塑料管
低熔点石蜡
电烙铁韦勒
带球窝磁性底座的平台Hama 照片和视频
双刃碳钢可折断剃须刀片电子显微镜科学公司72004
凡士林
Microsoft Excel微软

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
  2. Leboulle, G., et al.

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