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方法文章

乳腺癌中雌激素受体信号通路调控代谢的系统生物学

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DOI：

10.3791/53832

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2016年3月17日

 , 
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

本文内容

摘要

整合全基因组测序实验与代谢组学实验的数据具有挑战性。本文首次报道了对经雌二醇处理的乳腺癌细胞的转录组、顺式调控组和代谢组数据的生成、分析及整合。

摘要

随着组学技术的发展，我们对癌症和代谢综合征等慢性疾病的理解得到了提升。然而，有效挖掘从基因表达微阵列、深度测序实验或代谢谱分析中获得的大规模数据集中的信息，对于揭示并有效靶向调控疾病细胞表型的关键因子至关重要。雌激素受体α（ERα）是一种主要的转录因子，调控着对雌激素响应性乳腺癌至关重要的基因程序。为了理解ERα信号通路在乳腺癌代谢中的作用，我们利用了经雌二醇处理的MCF-7细胞的转录组、染色质结合组和代谢组数据。本报告中，我们描述了用于RNA-Seq、ChIP-Seq和代谢组学实验的样本制备方法，以及对所得数据进行的整合性计算分析。该方法有助于阐明由特定转录因子调控的、影响正常或病变细胞代谢的新型分子机制和基因调控回路。

引言

雌激素是调控两性多种生理过程的重要调节因子，包括生殖组织、代谢组织、大脑和骨骼1。除了在这些组织中发挥有益作用外，雌激素还促进起源于乳腺和生殖组织的癌症发展。雌激素主要通过雌激素受体（ERs）发挥作用，诱导细胞类型特异性的效应。利用RNA-Seq对ERα调控的转录本进行深度测序，并结合ChIP-Seq分析全基因组范围内ERα的DNA结合位点，已被证明有助于理解ERα在不同组织及其相关癌症中的作用机制。我们及其他研究者已发表与不同受体（ERα与ERβ）2,3、不同配体3-5以及不同共调节因子2,4,6,7相关的基因表达谱。

RNA-Seq 是研究转录组的主要方法，与基于微阵列的基因表达分析相比，具有更高的精确度和效率8。从细胞系2-4,7、组织或肿瘤样本中提取的 RNA 经过测序后，比对到现有的基因组组装序列上，从而鉴定出差异表达的基因。染色质免疫沉淀（ChIP）技术用于解析转录因子和共调节因子在已知调控结合位点上的染色质结合情况。ChIP-Seq（即染色质免疫沉淀后接高通量测序）可无偏倚地检测全基因组范围内的结合位点。代谢组学是另一种日益广泛应用的系统生物学方法，用于定量测量活体系统对各种刺激（包括化学物质和遗传扰动）产生的动态多参数响应。

通过进行全局代谢谱分析，可以从细胞、组织和血液中获得功能性的读出结果。此外，转录组实验获得的信息并不总能反映参与生物化学通路的酶的实际水平变化。转录组与代谢组数据的联合分析使我们能够识别基因表达变化与实际代谢物变化之间的关联并建立联系。整合利用这些大规模数据集所提供的信息，可揭示转录因子在调控复杂生物系统中的作用机制，特别是与人类发育以及癌症、糖尿病等疾病相关的过程。

哺乳动物基因组的复杂性使得整合和全面解读转录组、顺式调控组和代谢组实验所获得的数据具有挑战性。识别能够导致靶基因表达变化的功能性结合事件非常重要，因为一旦确定了功能性结合位点，后续的分析（包括转录因子（TF）基序分析）就可以更准确地进行，从而有助于鉴定出具有生物学意义的转录因子级联反应及其调控机制。此外，RNA-Seq与ChIP-Seq实验的直接比较并不总是可行的，因为每种实验的数据在尺度和噪声水平上存在差异，某些情况下有意义的信号可能被群体噪声所掩盖。据我们所知，目前尚无研究整合这三种独立但相互关联的方法来理解ERα在乳腺癌中对代谢的直接调控作用。因此，本文的总体目标是将有效的结合事件与基因表达及代谢物变化关联起来。为实现这一目标，我们整合了RNA-Seq、ChIP-Seq和代谢组学实验的数据，鉴定出由雌激素诱导的ERα结合事件，这些事件可导致代谢通路中基因表达的变化。我们首次提供了一整套完整的实验方案（图1），用于生成ChIP-Seq、RNA-Seq和代谢组学图谱，并对数据进行整合分析，以揭示调控乳腺癌细胞系代谢的新基因调控回路。

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方案

1. RNA-Seq 样本的制备

  1. 细胞培养与处理
    1. 将MCF7细胞培养于含酚红的改良MEM（IMEM）培养基中，添加10% 灭活胎牛血清（FBS）和1% 青霉素/链霉素，于37 °C、5% CO2 湿润环境中培养。
      注：本研究全程使用相同的细胞系及细胞培养条件。
    2. 在6孔板中每孔接种100,000个MCF7细胞，每种处理设三个重复。第3天更换培养基，每孔加入2 ml新鲜培养基，含或不含10-8 M E2。将培养板置于37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育24小时。
    3. 收集细胞时，向每孔加入1 ml RNA提取试剂（酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法试剂），室温孵育5分钟。用移液器吹打收集细胞裂解液，转移至1.5 ml离心管中。
  2. RNA提取
    1. 向1 ml细胞裂解液（步骤1.1.3）中加入200 µl氯仿，涡旋振荡10秒。室温孵育5分钟。在4 °C条件下以16,000 × g离心15分钟。离心后，小心转移上层水相至新离心管，避免扰动其他相。
    2. 向含有转移后水相的新离心管中加入500 µl 100%异丙醇，通过反复倒置混匀。于-20 °C过夜孵育。在4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟。可见管底形成沉淀。弃去上清液，用750 µl无RNase的70%乙醇短暂涡旋洗涤沉淀。
    3. 在4 °C条件下以6,000 × g离心5分钟。弃去上清液，再于4 °C以16,000 × g离心1分钟，以收集残留乙醇。使用加样枪配合凝胶上样枪头吸除残余乙醇，将离心管倒置放置于空气中干燥10分钟。根据沉淀大小，用20–50 µl经DEPC处理的水溶解沉淀。
  3. 按照说明书4使用RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化。依据说明书9使用基于荧光测定的检测试剂盒测定RNA浓度。
    注：采用260 nm处的光密度（OD）值测定RNA浓度，260 nm与280 nm处OD比值用于评估样品纯度。建议使用生物分析仪（Bio-analyzer）检测RNA质量。
  4. 取约0.5至1 μg纯化后的RNA用于测序。
    注：生物技术中心将按照先前所述方法2制备测序文库，并进行双端测序。

2. ChIP-Seq 样本的制备

  1. 细胞培养与处理
    1. 每10 cm培养皿中接种500,000个MCF7细胞，使用生长培养基。
      注意：每次下拉使用16块板。第3天，移除培养基，并加入5 ml新鲜培养基，含或不含10-8 向每块板加入 M E2。在 37 °C、湿润的 5% CO₂ 条件下处理细胞 45 分钟2 大气）。
  2. 交联与细胞收集
    1. 向5 ml培养基中加入250 µl 37%甲醛以交联染色质，室温孵育15 min。用5 ml预冷的1x MEM洗涤细胞，终止交联。
    2. 每块培养板中加入 250 µl 细胞裂解缓冲液（10 mM EDTA，50 mM Tri HCl，1% SDS，0.5% N,N-二甲基十二烷-1-胺氧化物）收集细胞。
  3. 染色质片段化
    1. 将细胞以30%的振幅超声处理8次，每次30秒，以达到所需的染色质片段大小。每次30秒超声处理后，将样品置于冰上冷却。
    2. 在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟，然后小心吸取上清液，避免扰动底部的沉淀。
    3. 取5 µl上清液，按照之前所述方法，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。10理想的DNA片段大小应在200-500 bp之间。
  4. 染色质免疫沉淀
    1. 保存25 µl细胞裂解液作为输入样本。在50 ml离心管中，将4 ml细胞裂解液与20 ml免疫沉淀缓冲液（2 mM EDTA、100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl和0.5% Triton X）、ERα抗体（500 µl F10和500 µl HC-20）以及500 µl蛋白A和蛋白G包被的磁珠混合。4 °C旋转孵育过夜，以形成染色质-抗体复合物。
  5. 洗涤与逆转交联
    1. 使用磁力架将磁珠吸附至磁化侧，以去除洗涤缓冲液。
    2. 用 25 ml 洗涤缓冲液 I（2 mM EDTA，20 mM Tris HCl，0.1% SDS，1% Triton X，150 mM NaCl）洗涤磁珠。为在不破坏DNA-蛋白质复合物的前提下充分洗涤磁珠，应沿管壁缓慢加入 25 ml 洗涤缓冲液，然后反复倒置离心管，直至所有磁珠均匀分散于缓冲液中，不再形成沉淀。也可使用旋转仪倒置离心管。切勿涡旋震荡样品。后续步骤中均采用相同方法洗涤磁珠。
    3. 用25 ml洗涤缓冲液II（2 mM EDTA，20 mM Tris HCl，0.1% SDS，1% Triton X，500 mM NaCl）洗涤磁珠。
    4. 用 25 ml 洗涤缓冲液 III（1.6 mM EDTA，10 mM Tris HCl，1% NP-40，1% 脱氧胆酸钠，250 mM LiCl）洗涤磁珠。
    5. 用25 ml 1×TE缓冲液（1 mM EDTA和10 mM Tris HCl）洗涤磁珠两次。
    6. 用 500 µl 洗脱缓冲液（1% SDS 和 10 mM NaHCO₃）洗脱 DNA3) 然后将500 µl DNA洗脱液分装至4个管中。对于输入样品的DNA，用125 µl洗脱缓冲液进行DNA洗脱。
    7. 将试管置于加热块上，65 °C孵育过夜。用铝箔覆盖加热块上的试管，以确保所有试管受热均匀。在试管上放置重物，防止试管盖打开。
  6. DNA 提取
    1. 室温冷却离心管5分钟。使用ChIP DNA提取试剂盒从pull down样品中分离DNA，具体操作按照制造商说明书进行。
      1. 将洗脱缓冲液预热至 65 °C。向每管中加入 625 µl 结合缓冲液。若出现沉淀，再加入 250 µl 结合缓冲液，直至溶液澄清。
      2. 将样品上样至柱中，在16,000 × g条件下离心30秒。用250 µl洗涤缓冲液洗涤样品。首次使用时请记得在洗涤缓冲液中加入乙醇。重复洗涤一次。
      3. 用15 µl洗脱缓冲液洗脱DNA。将来自4个管的相同pull down的DNA合并，以获得约55 µl的DNA。
    2. 使用DNA纯化试剂盒分离输入DNA。
      1. 将洗脱缓冲液预热至 65 °C。向每管中加入 625 µl 结合缓冲液，孵育 10 分钟。将样品加载至置于 2 ml 收集管中的层析柱上。
      2. 用750 µl洗涤缓冲液洗涤样本，在16,000 x g离心1分钟。重复离心以去除残留缓冲液。将DNA洗脱至30 µl EB中。
    3. 使用经改良的商用荧光染料法测定DNA浓度11.
      1. 将20倍浓缩的TE缓冲液稀释为1倍TE缓冲液，作为稀释试剂和DNA样品的检测缓冲液。取5 µl已分离的DNA，用1倍TE缓冲液稀释至50 µl。
      2. 从2 µg/ml的DNA储备液配制DNA标准品，浓度范围为0（空白）、1、10、100、1000 µg/ml。在96孔板中，每种标准品及DNA稀释样品均设置两个复孔，各加入25 µl。（建议标准品设置三个复孔。）
      3. 在塑料管中用1×TE缓冲液将dsDNA试剂稀释200倍，配制工作液。用铝箔包裹工作液溶液以避光。向每个样品中加入200 µl工作液。室温孵育5分钟。用铝箔包裹板以避光。
      4. 使用荧光酶标仪（激发波长480 nm，发射波长520 nm）测定样品的荧光值。绘制荧光值与DNA浓度的DNA标准曲线。根据所生成的DNA标准曲线确定样品的浓度。
  7. 使用qPCR验证ChIP实验
    1. 取2 µl分离的DNA，加水稀释至20 µl。将2.5 µl DNA稀释液、5 µl Green I PCR预混液、1 µl引物和1.5 µl无核酸酶水混合，设置三份重复的qPCR反应。
    2. 使用Fast Real-Time PCR系统按照以下程序运行qPCR：第一步：95 °C 预变性60秒；第二步：95 °C 变性10秒，60 °C 退火延伸60秒，重复第二步39个循环。
  8. 将10 ng DNA样本送至生物技术中心进行测序。
    注意：生物技术中心将ChIP DNA按照说明制备成文库，并采用先前详细描述的方法进行单端测序2.

3. 代谢组学检测样品制备

  1. 细胞培养与处理
    1. 将400,000个MCF7细胞接种至每个10 cm培养皿中，使用生长培养基。每种处理准备三个样本，每个样本使用两个培养皿以获得足够数量的细胞用于检测。第3天，吸除培养基，并向细胞中加入5 ml新鲜培养基，培养基中含或不含10-8 M E2。在37 °C、5% CO2 湿润环境中处理细胞24小时。
  2. 样本收集
    1. 向培养皿中加入5 ml预冷的1×PBS，轻轻倾斜培养皿数次后吸除PBS。重复洗涤两次，并在最后一次洗涤后尽可能吸净PBS。
    2. 向每个培养皿中加入750 µl预冷丙酮，刮取细胞。将两个培养皿中的丙酮细胞悬液合并至一个2 ml离心管中，置于冰上。
    3. 细胞计数用于归一化
      1. 每种处理另取两个培养皿用于细胞定量。为使细胞脱离培养皿，向每个培养皿中加入2 ml HE缓冲液（1×HBSS、10 mM HEPES、0.075% NaHCO3 和1 mM EDTA），孵育5分钟。
      2. 用移液器反复吹打使细胞在HE缓冲液中充分混匀。取总共20 µl细胞悬液，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
  3. 在送至代谢组学中心进行代谢物鉴定与定量前，将样本储存于-80 °C。采用气相色谱-质谱联用分析（GC-MS）进行检测。

4. 整合分析

  1. RNA-Seq 数据分析：
    1. 使用 FastQC 进行 FASTQ 文件质量检测：读段质量控制（http://galaxy.illinois.edu）
      1. 在NGS：质控与操作工具中选择FastQC：Read。从当前历史记录中上传原始数据文件。
        注意：建议为输出文件命名一个标题，以便提醒自己该任务的内容，因为可能会有多个输出结果。
    2. 执行后，输出文件将显示在历史记录中。对每个序列文件重复相同步骤。使用NGS:FASTX Toolkit中的Clip功能去除接头。
    3. 使用 Tophat2 将测序读段比对至 hg19 参考基因组，并采用 RefSeq 基因组参考注释12 （默认值）
      1. 在NGS：RNA分析工具中选择Tophat2。指明文库配对类型（单端与双端）。
      2. 上传当前历史记录中的输入FASTQ文件。选择参考基因组。使用默认设置，或使用完整参数列表进行修改。
      3. 执行后将生成两个输出文件：一个是剪接位点的 UCSC BED 轨道文件；另一个是 BAM 格式的读段比对列表。
    4. 将BAM文件上传至测序数据分析工具。使用定量分析工具计算表达值。
    5. 使用表达分析工具，采用默认值和倍数变化，鉴定差异性上调的基因 >2 和 p值 <0.05。同样，使用表达分析工具（Expression Analysis Tool）并采用默认值和倍数变化来鉴定差异性下调的基因 <0.5 和 p 值 <0.05.
  2. ChIP-Seq 数据分析：
    1. 使用 Bowtie2 将 FASTQ 读段比对至 hg1913 Galaxy 中的默认值
      1. 在NSC：比对工具中选择Bowtie2。确认文库是否为双端测序（单端 vs 双端）。从当前历史记录中上传FASTQ文件。
      2. 选择参考基因组。使用默认参数设置。执行后将生成包含比对序列读段的 BAM 格式输出文件。对每个序列文件重复此操作。
    2. 使用 MACS 鉴定峰14 p 值阈值为 6.0e-7，FDR 为 0.01，如前所述2.
  3. 代谢组学数据分析：
    1. 将代谢物的化学名称转换为 KEGG_ID。
    2. 通过比较对照组与处理组中检测到的代谢物水平，鉴定差异调控的代谢物. E2 处理的样本（本研究中采用 2 倍截断值）。
  4. 整合分析：
    1. 使用测序数据分析工具鉴定具有ERα结合位点的基因。采用20 kb作为距离阈值，通过“区域到基因”功能将结合区域关联至相应基因。
    2. 利用倍数变化从RNA-Seq数据分析中鉴定差异上调和下调基因 >2 和倍数变化 <0.5，分别与 p值 <以0.05作为阈值，通过维恩图比较分析与ERα结合位点相关基因列表。
    3. 使用此列表通过 Metscape 鉴定受 E2 调控的代谢通路15 Cytoscape 模块
      1. 在应用中选择 Metscape 模块，点击构建网络，然后选择基于通路的选项。
      2. 选择生物体（人类）。选择E2非调控化合物列表（KEGG ID）数据文件，以及E2上调基因列表。
      3. 选择“化合物-反应-酶-基因”作为网络类型。选择化合物/基因作为查询对象。
      4. 构建网络。使用E2下调的化合物和基因重复上述步骤。

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结果

转录组学
为了分析E2处理引起的差异表达基因，我们选择进行RNA-Seq实验。除了提供mRNA水平的信息外，RNA-Seq数据还可用于监测非编码RNA（长链非编码RNA、微小RNA）以及可变剪接事件的变化。我们未提供关于非编码RNA或可变转录基因的分析信息，因为本研究的重点是鉴定在代谢调控中起重要作用的蛋白质编码基因。然而，RNA-Seq是获取基因差异表达信息的极佳方法。

为了获得高质量的测序读长，获取高纯度的RNA至关重要。在提取RNA后，我们使用RNA纯化试剂盒对RNA进行了纯化。然而，此过程几乎会损失近50%的RNA，因此在纯化步骤结束时，应充分考虑起始RNA的量，以确保获得所需的RNA量（100–500 ng）。

我们使用荧光计RNA HS检测法对RNA得率进行定量，该方法非常准确，是低丰度RNA定量的首选方法。接下...

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讨论

本文中，我们描述了对经雌二醇（E2）处理的 MCF-7 细胞进行 RNA-Seq、ChIP-Seq 和代谢组学数据的生成及整合分析。我们建立了一套实验方案，策略性地采用最高效的方法和用户友好的软件，以获得具有生物学意义的发现。据我们所知，本研究是首个整合三种不同组学分析数据，并鉴定出由雌激素受体 α（ERα）在乳腺癌细胞中直接调控的新型代谢通路的研究。

转录组学
高质量的RNA是成功进行转录组分析的关键。良好的实验操作可避免RNA降解，包括创建无RNase的实验台面、频繁更换手套以及在-80℃保存样品。 °C，并在使用时保持在冰上。添加于-20℃过夜孵育 ºC 可提高 RNA 回收率。为避免 RNA 反复冻融，可在 RNA 分离与纯化后即分配用于下游实验。由于测序可能存在错误，通常需利用样本的 cDNA 进行 qRT-PCR，以验证 RNA-Seq 鉴定出的差异表达基因，因此应保留足够的 RNA 用于此目的。我们采用双端测序，以便分析剪接变异体、非编码 RNA 和 miRNA。为降低测序成本，也可选择单端测序。与基因芯片相比，RNA-Seq 更为灵敏...

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披露

伊利诺伊大学获得了辉瑞公司资助的研究人员发起的科研项目经费。ZME 和 YCZ 的薪酬由该项经费支持。

致谢

本研究工作得到了美国农业部国家食品与农业研究所的资助，项目编号为ILLU-698-909（ZME），以及辉瑞公司（Pfizer, Inc）的资助（ZME）。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表美国农业部的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
甘油三酯混合物Sigma17810-1AMP-S
油酸 SigmaO1257-10MG油酸-水溶性粉末 
TRIzol试剂Life technologies 15596-026
Dynabeads Protein ALife technologies 10006D
Dynabeads Protein G生命技术 10007D
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28106输入样品的DNA提取 
ZYMO ChIP-DNA 纯化试剂盒 Zymo Research D5205ChIP DNA 纯化 &和浓缩器
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA检测试剂盒Invitrogen P7589DNA 定量
RNase-Free DNase 试剂盒QIAGEN79254RNA纯化
DEPC 处理水 LIFE TECH462224无DNase/RNase
Model 120 超声波破碎仪Fisher Scientific FB120110使用1/8探针 
 Fisher Scientific 隔音罩Fisher Scientific FB-432-A用于降低噪音
 Eppendorf 离心管 5.0 mlEppendorf 0030 119.401200 个管子（每袋 100 个，共 2 袋）
随机引物混合物 NEBS1330S
DNTP 混合液NEBN0447S
M-MuLV 逆转录酶NEBM0253S
FastStart SYBR Green Master罗氏4673484001
琼脂糖Fisher BP1601001.5% 琼脂糖凝胶 
Qubit RNA HS 检测试剂盒Life technologies Q32852RNA定量（100次检测） 
甲醛SigmaF8775
蛋白酶抑制剂片剂 罗氏 4693116001每片可配制10 ml裂解缓冲液
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂罗氏 4906845001每片可配制10 ml裂解缓冲液
Qubit 检测试剂盒生命技术公司 Q32850用于100次检测
自动细胞计数仪ORFLOMXZ000
试管旋转仪 VWR10136-084
Victor X5 多功能酶标仪 PerkinElmer2030-0050
Microcentrifuge 5417REppendorf22621807
磁力架DiagenodeB04000001 
快速实时荧光定量PCR系统应用科学 4351405

参考文献

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雌激素受体α乳腺癌代谢RNA测序染色质免疫沉淀代谢组学分析MCF-7细胞雌二醇处理整合组学分析基因调控回路核受体信号转导
乳腺癌中雌激素受体信号通路调控代谢的系统生物学
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