乳腺癌中雌激素受体信号通路调控代谢的系统生物学

摘要

整合全基因组测序实验与代谢组学实验的数据具有挑战性。本文首次报道了对经雌二醇处理的乳腺癌细胞的转录组、顺式调控组和代谢组数据的生成、分析及整合。

摘要

随着组学技术的发展，我们对癌症和代谢综合征等慢性疾病的理解得到了提升。然而，有效挖掘从基因表达微阵列、深度测序实验或代谢谱分析中获得的大规模数据集中的信息，对于揭示并有效靶向调控疾病细胞表型的关键因子至关重要。雌激素受体α（ERα）是一种主要的转录因子，调控着对雌激素响应性乳腺癌至关重要的基因程序。为了理解ERα信号通路在乳腺癌代谢中的作用，我们利用了经雌二醇处理的MCF-7细胞的转录组、染色质结合组和代谢组数据。本报告中，我们描述了用于RNA-Seq、ChIP-Seq和代谢组学实验的样本制备方法，以及对所得数据进行的整合性计算分析。该方法有助于阐明由特定转录因子调控的、影响正常或病变细胞代谢的新型分子机制和基因调控回路。

引言

雌激素是调控两性多种生理过程的重要调节因子，包括生殖组织、代谢组织、大脑和骨骼¹。除了在这些组织中发挥有益作用外，雌激素还促进起源于乳腺和生殖组织的癌症发展。雌激素主要通过雌激素受体（ERs）发挥作用，诱导细胞类型特异性的效应。利用RNA-Seq对ERα调控的转录本进行深度测序，并结合ChIP-Seq分析全基因组范围内ERα的DNA结合位点，已被证明有助于理解ERα在不同组织及其相关癌症中的作用机制。我们及其他研究者已发表与不同受体（ERα与ERβ）^2,3、不同配体^3-5以及不同共调节因子^2,4,6,7相关的基因表达谱。

RNA-Seq 是研究转录组的主要方法，与基于微阵列的基因表达分析相比，具有更高的精确度和效率⁸。从细胞系^2-4,7、组织或肿瘤样本中提取的 RNA 经过测序后，比对到现有的基因组组装序列上，从而鉴定出差异表达的基因。染色质免疫沉淀（ChIP）技术用于解析转录因子和共调节因子在已知调控结合位点上的染色质结合情况。ChIP-Seq（即染色质免疫沉淀后接高通量测序）可无偏倚地检测全基因组范围内的结合位点。代谢组学是另一种日益广泛应用的系统生物学方法，用于定量测量活体系统对各种刺激（包括化学物质和遗传扰动）产生的动态多参数响应。

通过进行全局代谢谱分析，可以从细胞、组织和血液中获....

方案

1. RNA-Seq 样本的制备

1. 细胞培养与处理
   1. 将MCF7细胞培养于含酚红的改良MEM（IMEM）培养基中，添加10% 灭活胎牛血清（FBS）和1% 青霉素/链霉素，于37 °C、5% CO₂ 湿润环境中培养。
      注：本研究全程使用相同的细胞系及细胞培养条件。
   2. 在6孔板中每孔接种100,000个MCF7细胞，每种处理设三个重复。第3天更换培养基，每孔加入2 ml新鲜培养基，含或不含10^-8 M E2。将培养板置于37 °C、5% CO₂ 湿润环境中孵育24小时。
   3. 收集细胞时，向每孔加入1 ml RNA提取试剂（酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法试剂），室温孵育5分钟。用移液器吹打收集细胞裂解液，转移至1.5 ml离心管中。
2. RNA提取
   1. 向1 ml细胞裂解液（步骤1.1.3）中加入200 µl氯仿，涡旋振荡10秒。室温孵育5分钟。在4 °C条件下以16,000 × g离心15分钟。离心后，小心转移上层水相至新离心管，避免扰动其他相。
   2. 向含有转移后水相的新离心管中加入500 µl 100%异丙醇，通过反复倒置混匀。于-20 °C过夜孵育。在4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟。可见管底形成沉淀。弃去上清液，用750 µl无RNase的70%乙醇短暂涡旋洗涤沉淀。

结果

转录组学
为了分析E2处理引起的差异表达基因，我们选择进行RNA-Seq实验。除了提供mRNA水平的信息外，RNA-Seq数据还可用于监测非编码RNA（长链非编码RNA、微小RNA）以及可变剪接事件的变化。我们未提供关于非编码RNA或可变转录基因的分析信息，因为本研究的重点是鉴定在代谢调控中起重要作用的蛋白质编码基因。然而，RNA-Seq是获取基因差异表达信息的极佳方法。

为了获得高质量的测序读长，获取高纯度的RNA至关重要。在提取RNA后，我们使用RNA纯化试剂盒对RNA进行了纯化。然而，此过程几乎会损失近50%的RNA，因此在纯化步骤结束时，应充分考虑起始RNA的量，以确保获得所需的RNA量（100–500 ng）。

我们使用荧光计RNA HS检测法对RNA得率进行定量，该方法非常准确，是低丰度RNA定量的首选方法。接下.......

讨论

本文中，我们描述了对经雌二醇（E2）处理的 MCF-7 细胞进行 RNA-Seq、ChIP-Seq 和代谢组学数据的生成及整合分析。我们建立了一套实验方案，策略性地采用最高效的方法和用户友好的软件，以获得具有生物学意义的发现。据我们所知，本研究是首个整合三种不同组学分析数据，并鉴定出由雌激素受体 α（ERα）在乳腺癌细胞中直接调控的新型代谢通路的研究。

转录组学
高质量的RNA是成功进行转录组分析的关键。良好的实验操作可避免RNA降解，包括创建无RNase的实验台面、频繁更换手套以及在-80℃保存样品。 °C，并在使用时保持在冰上。添加于-20℃过夜孵育 ºC 可提高 RNA 回收率。为避免 RNA 反复冻融，可在 RNA 分离与纯化后即分配用于下游实验。由于测序可能存在错误，通常需利用样本的 cDNA 进行 qRT-PCR，以验证 RNA-Seq 鉴定出的差异表达基因，因此应保留足够的 RNA 用于此目的。我们采用双端测序，以便分析剪接变异体、非编码 RNA 和 miRNA。为降低测序成本，也可选择单端测序。与基因芯片相比，RNA-Seq 更为灵敏.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘油三酯混合物	Sigma	17810-1AMP-S
油酸	Sigma	O1257-10MG	油酸-水溶性粉末
TRIzol试剂	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	生命技术	10007D
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28106	输入样品的DNA提取
ZYMO ChIP-DNA 纯化试剂盒	Zymo Research	D5205	ChIP DNA 纯化 &和浓缩器
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA检测试剂盒	Invitrogen	P7589	DNA 定量
RNase-Free DNase 试剂盒	QIAGEN	79254	RNA纯化
DEPC 处理水	LIFE TECH	462224	无DNase/RNase
Model 120 超声波破碎仪	Fisher Scientific	FB120110	使用1/8探针
Fisher Scientific 隔音罩	Fisher Scientific	FB-432-A	用于降低噪音
Eppendorf 离心管 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 个管子（每袋 100 个，共 2 袋）
随机引物混合物	NEB	S1330S
DNTP 混合液	NEB	N0447S
M-MuLV 逆转录酶	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	罗氏	4673484001
琼脂糖	Fisher	BP160100	1.5% 琼脂糖凝胶
Qubit RNA HS 检测试剂盒	Life technologies	Q32852	RNA定量（100次检测）
甲醛	Sigma	F8775
蛋白酶抑制剂片剂	罗氏	4693116001	每片可配制10 ml裂解缓冲液
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂	罗氏	4906845001	每片可配制10 ml裂解缓冲液
Qubit 检测试剂盒	生命技术公司	Q32850	用于100次检测
自动细胞计数仪	ORFLO	MXZ000
试管旋转仪	VWR	10136-084
Victor X5 多功能酶标仪	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
磁力架	Diagenode	B04000001
快速实时荧光定量PCR系统	应用科学	4351405