方法文章

逆转录病毒整合位点的扩增，新一代测序和基因组DNA制图

DOI：

10.3791/53840

⸱

2016年3月22日

 ,  , 
1Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA, The Francis Crick Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种方案，用于从感染细胞的基因组 DNA 中扩增逆转录病毒整合位点，对扩增的病毒-宿主连接进行测序，然后将这些序列映射到参考基因组。我们还描述了使用 BEDTools 量化整合位点相对于各种基因组注释分布的技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本地和全球尺度上表现出逆转录病毒整合签名的偏好。这里，我们提出了（1）的生成用连接介导的PCR（LM-PCR）扩增和新一代测序（NGS）逆转录病毒整合位点的不同的库的详细的协议;（2）绘制的每个病毒 - 的基因组位置使用BEDTools交界处，和（3）分析统计相关数据主机。从感染的细胞中提取的基因组DNA是通过消化用限制性酶或通过超声处理分段。合适的DNA末端修复后，双链连接子连接到DNA末端，和半巢式PCR是使用这两个病毒的长末端重复（LTR）端部和连接接头DNA互补的引物进行的。 PCR引物携带NGS期间用于DNA聚类所需的序列，否定为单独的适配器连接的要求。质量控制（QC）下进行，以评估DNA片段大小分布和适应呃之前NGS DNA结合。序列输出文件过滤含有LTR-读取，并确定LTR和连接器的序列裁剪掉。修剪宿主细胞序列被映射到使用BLAT参照基因组和被过滤为最小97％的同一性的参照基因组中的独特点。独特的整合位点是审查相邻核苷酸（nt）的顺序和分配相对于不同的基因特性。使用该协议，高复杂度的整合位点文库可从基因组DNA在三天构成。该包括易感组织培养细胞至整合位点分析的外源病毒感染的整个协议可以因此在大约一到两周进行。这项技术的应用近期涉及到艾滋病毒感染患者的整合位点的纵向分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

病毒DNA（VDNA）到宿主细胞基因组中的整合是在逆转录病毒的生命周期的一个重要步骤。积分是由病毒酶整合酶（IN），其执行，导致建立稳定地插入原病毒1的两个不同的催化过程来完成的。在亚基接合是通过逆转录生成的线性VDNA的端部，形成具有VDNA高阶intasome端通过一个IN多聚体2-4保持在一起。在切割中称作3'-处理的处理顺序的3'从不变5'-CA-3下游VDNA的端部"，留下凹入3'在每个VDNA末端5-8活性羟基结束。该intasome随后导入细胞核作为大型组件的主机的一部分，并称为preintegration复合物（PIC），9-11的病毒蛋白。遇到细胞靶DNA（T-DNA）后，使用VDNA 3'-羟基GRO起坐裂解TDNA顶部和底部股线以交错的方式，同时通过链转移12,13的过程中加入VDNA到TDNA 5'磷酸基团。

在本地和全球尺度上表现出逆转录病毒整合位点的偏好。在当地，共识的整合位点包括了从VDNA插入位点14,15大约五到十个基点的上游和下游跨越弱保守的回文T-DNA序列。全球范围内，逆转录病毒针对具体的染色质注释16。有七种不同的逆转录病毒属 - 通过ε，伦蒂和spuma阿尔法。慢病毒，包括HIV-1，有利于积极转录基因17机构内....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.生成病毒原液

注意:此协议的湿式清洗台方面的流程图在图1中描绘的病毒原料生产和组织培养细胞的随后感染的细节通常将适用于不同类型的逆转录病毒。对于一些实验，靶细胞可能不表达内源性病毒受体（多个），并且在这种情况下，假型逆转录病毒颗粒携带异源病毒包膜糖蛋白的结构， 例如 ，从水泡性口炎病毒（VSV-G）对G糖蛋白，会需要感染44,45。

注:与HIV-1工作时，须采取预防措施。虽然具体准则会有所不同，从机构的机构，所有的基于病毒的工作应在一个专门的，操作者限制生物安全柜（通常被称为组织培养罩）来进行。适当的个人防护设备包括面部防护，鞋套，手套双层和全身套装西装应随时佩戴。从病毒相关的实验产生的所有废液应与漂白剂（10％终浓度）灭活，以及包括固体废弃物都应该在处置之前进行高压灭菌。

  1. 一个转染前一天，补充有10％（体积/体积）胎牛血清和1％的板3.3×10 6个 HEK293T细胞于10ml的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的（体积/体积）青霉素/链霉素（10,000ù / ml的股票）在每一个100 mm培养皿。
    注意:辅以的DMEM上称为DMEM-FPS从这一点。
  2. 在随后的日子，转染使用市售的转染试剂或磷酸钙细胞用质粒携带全长逆转录病毒分子克隆的10微克或9微....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表4列出一个代表性实验的结果，以示出用于从感染细胞的培养物中回收整合位点的NGS的灵敏度。未感染的细胞的DNA被用于串联从其中在平均每个细胞包含一个积分40的感染稀释的基因组DNA。 15625:在五个步骤的1的最大稀释制备稀释液。在滴定系列的基因组DNA，然后通过超声处理片段化或通过用限制性内切核酸酶消化MseI和BglⅡ，随后的LM-PCR的独特整合位点的数目，以及网站地图近端到选定的基因组注释的数目，是根据上述方案计算。数据分析显示，数十个独特的集成网站（量的1-2％，从整齐的基因组DNA恢复）从哪里理论上只有15625人被感染的细胞制备库恢复。

当分析整合位数据集，这是至关重要的数据进行比较，以匹配组随机基因组位点，这被称为匹配的随机控制或MRC。作为代表性的结果通过限制性内切酶消化或超声剪切基因组DNA，两个不同的数据集MRC构建。 MRC 恩茨包含从hg19随机选择地点邻近MseI和BglⅡ酶切的部位产生50000独特的基因组位点，而MRC 随机窝藏1.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种用于逆转录病毒整合位点的分析协议，从通过基因组分布模式映射的初始病毒感染步骤，进行说明。这个协议是适用于任何反转录病毒和任何可感染的细胞类型。此外，该测定管道是相当敏感，以回收的从基因组DNA等效的系列稀释独特的整合位点令人满意编号以与6.4×10 -5的MOI启动的感染的可能性。当从可能含有低病毒载量，其中只有细胞的一小部分会窝藏集成原病​​毒感染的患者施加到样本这种敏感性使得协议特别有用。在这一领域36,38,41-43之前方法论的论文一致，在这个协议的生物信息学部分的多个步骤将定制的脚本开发受益顺序处理大量数据文件。虽然BLAT 58是马pping在本协议中所述程序，用户可能会发现蝴蝶结67（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）是一个合适的选择。

一个替代的生物信息学流水线最近报道的测定莫洛尼鼠白血病病毒（的MoMLV）整合位点19。在它被开发成独立的软件，是可公开获得的，并且是相当强大的，因为它最初是用于映.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们非常感谢我们的同事斯蒂芬·休斯和亨利·莱文的意见，这是建立逆转录病毒整合位点的测序NGS协议在恩格尔曼实验的关键。这项工作是由美国国立卫生研究院授予AI039394和​​AI052014（以ANE）和AI060354（哈佛大学艾滋病研究中心）的支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMGibco11965-084标准细胞培养基，与HEK293T细胞兼容
胎牛血清Thermo ScientificSH 30088.03可能需要预先筛选不同批次的血清以实现最佳病毒生产
青霉素/链霉素Corning30-002-Cl抗生素将添加到 DMEM
磷酸盐缓冲盐水中Mediatech21-040-CV用于洗涤细胞
胰蛋白酶 EDTA康宁25-053-CI用于从组织培养板中分离贴壁细胞
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688DNA 转染试剂
0.45 &微量;m 过滤器Thermo Scientific09-740-35B用于过滤含有病毒颗粒的细胞培养基
Turbo DNaseAmbionAM2239用于降解病毒原液中的残留质粒
DNA HIV-1 p24 抗原捕获测定ABL Inc.5447用于定量病毒产量
DNeasy Blood 和组织试剂盒Qiagen69506用于从细胞中纯化基因组DNA
超声仪CovarisS2使用这种型号的超声仪执行两轮占空比，5%;强度，3;每次爆发循环，200;时间，80 秒
无核酸酶水GeneMateG-3250-125建议使用市售水，以减少样品交叉污染的可能性
QIAQuick PCR 纯化试剂盒Qiagen28106用于在文库构建过程中纯化
DNA End-It DNA End-Repair KitEpicentreER81050用于修复超声处理的 DNA 样品的 DNA 末端
Klenow 片段 （3'-5' exo–）New England Biolabs （NEB）M0212S与 dATP 一起用于 A 尾修复的 DNA 片段
dATPThermo ScientificR0141三磷酸脱氧腺苷
MseINEBR0525L用于基因组 DNA 切割的限制性核酸内切酶
BglIINEBR0144L内切酶抑制上游 HIV-1 U5 序列
T4 DNA 连接酶的扩增NEBM0202L/6218用于相容 DNA 末端共价连接的酶
DNA 寡核苷酸集成 DNA 技术定制让公司纯化寡核苷酸。HPLC 纯化足以检测 DNA <30 个核苷酸;PAGE 纯化较长的 DNA 
优势 2 聚合酶混合物Clontech639202含有 DNA 聚合酶的商业混合物，用于 PCR
dNTP（100 mM 溶液）ThermoScientificR0181用无菌水在冰上稀释四种化学品，以达到每个 dNTP 2.5 mM 的中等浓度
NanoDrop ThermoScientificNanoDrop 2000分光光度计，用于测定 DNA 浓度
Qubit 荧光计Life TechnologiesQubit® 3.0荧光计，用于确认整合位点文库 DNA 浓度
2200 TapeStation 系统AgilentG2964AA基于磁带的分析，用于确认整合位点文库 DNA 大小分布
MiSeqIlluminaSY-410-1003用于 NGS
限制性核酸

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S.....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Ligation mediated PCRRestriction Enzyme DigestionSonication FragmentationDNA End RepairSemi nested PCRBLAT Genome MappingBEDTools Analysis

相关文章