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方法文章

人诺如病毒突出域的制备 E. coli 用于X射线晶体学

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DOI：

10.3791/53845

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2016年4月19日

 ,  ,  , 
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种用于表达和纯化高质量诺如病毒凸起（P）结构域的方法 E. coli 用于X射线晶体学研究。该方法可应用于其他杯状病毒P结构域以及非结构蛋白。 即病毒蛋白基因组连接蛋白（VPg）、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。

摘要

诺如病毒衣壳由一种主要结构蛋白组成，称为 VP1。VP1 可进一步分为壳体（S）结构域和突出（P）结构域。S 结构域在病毒 RNA 周围形成连续的支架结构，而 P 结构域则在 S 结构域上形成病毒刺突，并含有介导抗原性和宿主细胞相互作用的决定簇。P 结构域可结合碳水化合物结构。 即组，据认为在诺如病毒感染中具有重要作用。在本方案中，我们描述了一种高效表达高质量诺如病毒P结构域蛋白的方法。这些蛋白可用于X射线晶体学和ELISA，以研究其抗原性及与宿主细胞的相互作用。

首先将P结构域克隆到表达载体中，然后在细菌中进行表达。该蛋白通过三步纯化流程进行纯化，包括固定化金属离子亲和层析和尺寸排阻层析。原则上，可在不到四周的时间内完成蛋白的克隆、表达、纯化及结晶，这使得本实验方案成为分析新出现的诺如病毒株的一种快速系统。

引言

全球范围内，人诺如病毒是急性胃肠炎的主要病因1。这些病毒属于杯状病毒科（Caliciviridae），该科至少包含五个属，分别为诺如病毒属（Norovirus）、札如病毒属（Sapovirus）、 Lagovirus 属（Lagovirus）、水疱病毒属（Vesivirus）和 Nebovirus 属（Nebovirus）。尽管其对医疗系统造成重大影响且分布广泛，但由于缺乏稳定的细胞培养系统，人诺如病毒的研究受到严重阻碍。迄今为止，尚无获批的疫苗或抗病毒治疗策略。

诺如病毒的主要衣壳蛋白称为VP1，可分为壳体（S）结构域和突出（P）结构域2P结构域通过一个柔性的铰链（H）区与S结构域相连。S结构域围绕病毒RNA形成支架结构，而P结构域则构成病毒衣壳的最外层。当在细菌中表达时，P结构域可组装成具有生物学意义的二聚体。该P二聚体能够与存在于唾液中的可溶性抗原以及某些宿主细胞表面的糖类结构——即组织血型抗原（HBGAs）——发生相互作用。3P结构域与HBGA的相互作用被认为在感染过程中具有重要作用4事实上，最近的一份报告揭示了合成的HBGA或表达HBGA的细菌在人类诺如病毒感 染中的重要性 体外5.

目前关于诺如病毒与宿主细胞附着的研究主要使用在昆虫细胞中表达的病毒样颗粒（VLPs），或在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中表达的重组P结构域。为了在原子分辨率水平上理解P结构域与组B类抗原（HBGA）之间的相互作用，可利用X射线晶体学解析P结构域-HBGA复合物的结构。本文描述了一种用于P结构域表达与纯化的实验方案，可高效、高质量地制备适用于X射线晶体学研究的P结构域蛋白。此外，该方法也可应用于其他杯状病毒P结构域及非结构蛋白的研究。

P结构域的密码子经过优化以利于在大肠杆菌（E. coli）中表达，并被克隆至标准的转移载体中。随后，将P结构域重新克隆到一个表达载体中，该载体编码一个多聚组氨酸（His）标签和一个甘露糖结合蛋白（MBP），其后接有一个蛋白酶切割位点。MBP-His-P结构域融合蛋白在大肠杆菌（E. coli）中表达后，经过三个纯化步骤。首先使用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化MBP-His-P结构域融合蛋白。接着，利用人鼻病毒（HRV）-3C蛋白酶对融合蛋白进行切割，并通过另一次IMAC纯化步骤将P结构域与MBP-His分离。最后，采用尺寸排阻色谱法（SEC）对P结构域进行进一步纯化。纯化后的P结构域可用于X射线晶体学研究。通过市售的结晶条件筛选试剂盒，在不同P结构域蛋白浓度下进行蛋白质结晶条件的筛选。观察晶体生长情况，并对最有希望的条件进行优化。

通过此处描述的方法，可在不到四周的时间内实现从基因到蛋白质再到结构的全过程。因此，我们针对P结构域的表达、纯化及结晶方法适用于在分子水平上研究诺如病毒与宿主之间的相互作用，并可为最新的疫苗设计和药物筛选提供重要数据支持。

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方案

1. P 区域克隆

  1. 通过诺如病毒株的序列比对确定P区编码区 例如， GII.10 型毒株，GenBank：AF504671，pdb-ID：3ONU6此外，移除P结构域C末端的柔性区域（图2A）。对DNA进行密码子优化 E. coli 表达并包含BamHI（N端）和NotI（C端）限制性酶切位点，以便将P结构域编码区亚克隆至pMalc2x表达载体中6,7.
    注意：P结构域编码区由商业服务公司进行优化并合成。P结构域编码区（插入片段）长度约为1 kb，搭载于标准转运载体中递送。
  2. 用BamHI（20,000 U/ml）和NotI（10,000 U/ml）限制性内切酶各1 µl，在37 °C下孵育1小时，消化2 µg转移载体，反应体系中加入生产商提供的缓冲液。
  3. 在1%琼脂糖凝胶中以135 V电压电泳分离消化后的插入片段，持续20分钟，然后使用商业化试剂盒从凝胶中纯化插入片段DNA。
  4. 用 1 µl BamHI（20,000 U/ml）和 1 µl NotI（10,000 U/ml）限制性内切酶在 37 °C 下消化 2 µg 的 pMalc2x 表达载体，反应 1 小时，以制备该载体。按照上述步骤（1.3）从琼脂糖凝胶中纯化载体。注意：两个样品（1.2 和 1.4）均可在 -20 °C 下保存。
  5. 将纯化的插入片段与经BamHI和NotI限制性位点消化的pMalc2x载体连接，加入1 µl T4-DNA连接酶（400,000 U/ml），在室温（RT）下反应15分钟图2B和2C)。使用至少 20 ng 的 pMalc2x 载体，并保持载体：插入片段的分子量比为 1:3。连接反应体系通常为 ~ 20 µl。
  6. 将2 µl连接混合物转化至50 µl化学感受态细胞中 E. coli 使用标准转化程序将DH5α细菌细胞进行转化（冰上放置10分钟，42 °C热激45秒），随后在37 °C下于600 µl S.O.C.培养基中培养1小时。将转化后的细胞以1,000 x g离心3分钟，弃上清液，将沉淀重悬于30 µl S.O.C.培养基中。
    1. 将转化混合物涂布于含有100 µg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养以进行筛选。挑选至少五个菌落。
  7. 对于每个克隆，分别接种2-3 ml添加了50 µg/ml氨苄青霉素的LB培养基（LB-amp），在37 °C、160 rpm条件下振荡培养过夜。
  8. 使用商业试剂盒从过夜培养物中提取质粒。利用pMalc2x正向引物（5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3'）和反向引物（5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3'）进行测序，验证P结构域插入片段的存在。

2. P 结构域表达

  1. 将1 μl（浓度为150 ng/μl - 400 ng/μl）编码MBP-His-P结构域融合蛋白的pMalc2x质粒转化至50 μl感受态细胞中 E. coli 使用标准转化程序将BL21细胞进行转化（冰上放置10分钟，42 °C热激45秒），并在600 μl S.O.C.培养基中培养1小时 37 °C 下培养数小时。将菌种转接到120 ml LB-氨苄培养基中，于37 °C、160 rpm条件下过夜培养。
  2. 接种九升（例如， 6个5 L摇瓶，每瓶装有1.5 L LB-amp培养基，并接种1:100的种子液。将细胞在37 °C、160 rpm振荡条件下培养至OD600 达到0.4 - 0.6后，将温度降至22 °C，持续约1小时，然后加入0.66 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。8在22 °C下培养细胞过夜（约18小时）。
    注意：温度可以调整，但我们建议使用 22 °C 或更低温度。
  3. 通过离心收集细胞（10,543 × g，15 分钟，4 °C）。弃去上清液，将细胞沉淀在 -20 °C 冻存。

3. 1st 纯化步骤与蛋白酶切割

  1. 从储备液中配制蛋白质纯化步骤中所用的缓冲液，以确保实验的可重复性和稳定性。为固定化金属离子亲和层析（IMAC）配制四种不同的缓冲液，每种缓冲液含有不同浓度的咪唑（10 mM、20 mM、50 mM 和 250 mM）。对于尺寸排阻层析（SEC），配制一种不含咪唑但盐浓度较高的凝胶过滤缓冲液（GFB）。使用去离子水配制缓冲液，并在使用前用孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤所有缓冲液。
    注意：详细的缓冲液配制方案请参见 表1.
  2. 从九升培养物中解冻细胞沉淀，并在 4 °C 下用 150 ml PBS 溶解。将细胞悬液在冰上进行超声处理，每次 2 分钟，共三次（功率 130 W，振幅 20%，脉冲频率 50%），以破碎细胞。超声过程中保持细胞悬液处于冰上。
  3. 将超声处理后的细胞悬液离心（43,667 × g，30 分钟，4 °C），以分离含有表达蛋白的上清液与细胞碎片。收集上清液，弃去沉淀。
  4. 用10 mM咪唑缓冲液在层析柱中洗涤并平衡10 ml（等于1个柱体积[CV]）的镍（Ni）-NTA琼脂糖珠悬浮液。将平衡后的Ni珠加入到第3.3步上清液中，该上清液含有表达的MBP-His-P结构域融合蛋白，于4 °C缓慢旋转孵育30分钟。
  5. 孵育后，将整个镍珠-蛋白混合物上样至层析柱。依次用5个柱体积的10 mM、20 mM和50 mM咪唑缓冲液缓慢洗涤层析柱，顺序为先10 mM，再20 mM，最后50 mM（图3A).
  6. 使用 250 mM 咪唑缓冲液洗脱 MBP-His-P 结构域融合蛋白（图3A）。洗脱过程中，检测OD280 nm 以验证融合蛋白的洗脱情况（OD值上升）280 nm）。继续洗脱直至OD280 nm 降至约 0.1。用大量 250 mM 咪唑缓冲液（至少 10 个柱体积）洗涤磁珠，随后用 10 mM 咪唑缓冲液再洗至少 10 个柱体积。保留磁珠用于第二次纯化步骤（第 4 节）。
  7. 使用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10 × 8 cm）通过SDS-PAGE验证MBP-His-P结构域融合蛋白的存在9 (图3A以45 A和200 V进行凝胶电泳，持续45分钟。
  8. 浓缩（Concentrate）例如， 使用商用浓缩器将洗脱的MBP-His-P结构域融合蛋白浓缩至终浓度约3 mg/ml。在4 °C下，将MBP-His-P结构域融合蛋白与HRV-3C蛋白酶于2 L含10 mM咪唑的缓冲液中透析过夜（酶与底物比例约1:100），以进行切割。图3A根据浓缩后蛋白质的最终体积，选择使用透析盒或透析管进行透析。
    注意：HRV-3C 蛋白酶用于蛋白切割的用量需根据其特定酶活性（2 U/µl，1 U 可充分切割 100 µg 蛋白）以及洗脱融合蛋白的量来计算，后者因表达水平不同而异，可通过 SDS-PAGE 结果（3.7）进行估算。

4. 2nd 纯化步骤

  1. 将步骤 3.6 中的 Ni-珠在 10 mM 咪唑缓冲液中平衡。
  2. 将步骤 3.7 中透析后的蛋白（含有被切割的 P 结构域、MBP 蛋白和 HRV 蛋白酶）与已平衡的 Ni-珠（4.1）在 4 °C 下缓慢旋转孵育 30 分钟。
  3. 将 Ni-珠混合物上样至层析柱，收集流出液（被切割的 P 结构域）（图 3B）。检测蛋白浓度，持续监测流出液的 OD280nm，直至其降至约 0.1。
    注意：MBP-His 应仍结合在 Ni-珠上（图 3B）。
  4. 使用 12% 的 SDS-PAGE 凝胶检测被切割的 P 结构域的存在（如上所述）（图 3B）。将洗脱的 P 结构域浓缩至约 3 mg/ml，并在 4 °C 下用 GFB 缓冲液透析过夜，用于后续的 SEC 纯化。

5. 3rd 纯化步骤

  1. 使用GFB缓冲液清洗HPLC纯化系统的泵和管路，并对凝胶过滤色谱柱（见材料列表）进行预平衡。
  2. 根据浓缩样品的体积，使用超大进样环（最多12 ml）或标准进样环（最多3 ml），以1 ml/min的流速将P结构域注入色谱柱。进样完成后，将流速提高至2.5 ml/min。
  3. 当OD值上升且P结构域开始从色谱柱中洗脱时，收集每份1.5 ml的洗脱组分。使用12% SDS-PAGE凝胶检测各组分（图4A和4B）。仅合并最纯的组分，并浓缩至约3 mg/ml和约8 mg/ml。
    注意：对于填料体积为320 ml的凝胶过滤色谱柱，经过约110 ml（空隙体积）后，大部分杂质已被洗脱。P结构域通常以二聚体形式洗脱，其二聚体的洗脱时间/体积取决于凝胶过滤色谱柱的制备级数（pg）。

6. P 结构域的结晶

  1. 使用浓度约为 3 mg/ml 和 8 mg/ml 的 P 结构域进行初步结晶筛选。每种浓度至少准备 100 µl 的 P 结构域样品，用于包含 384 种商业化筛选条件的初步筛选实验。在 18 °C 下采用 96 孔板格式进行筛选，每个孔的储液池中含有 100 µl 母液，液滴由 0.2 µl 母液和 0.2 µl 蛋白质组成。
  2. 重复并优化获得成功的结晶条件。使用含有 3 排的 15 孔板，第一排加入 100% 母液，第二排加入 90% 母液和 10% 水，第三排加入 80% 母液和 20% 水。液滴体积设为 2 µl（1 µl 蛋白质 + 1 µl 母液），储液池体积为 500 µl 母液。
  3. 利用优化后的结晶条件进行 P 结构域与配体的共结晶。按步骤 6.2 所述制备结晶板，但液滴体积改为 3 µl，包含 1 µl 母液、1 µl 蛋白质和 1 µl 浓度为 1 mg/ml 的配体。
  4. 利用同步辐射光源收集单晶衍射数据集。以已发表的、具有高序列相似性的 P 结构域结构作为初始搜索模型，进行分子置换6,10-13。
    注意：配体的存在会表现为未建模的电子密度团块。

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结果

所述实验方案的示意图见图1。该方案包含6个主要部分，分别为目的基因的克隆、表达、三步纯化以及结晶。图2展示了表达载体构建物（EC）的设计及pMalc2x表达载体的特性。pMalc2x载体的多克隆位点（MCS）序列显示了限制性酶切位点和蛋白酶切割位点。图3展示了MBP-His-P结构域融合蛋白及其切割后P结构域的代表性SDS-PAGE结果，并附有纯化前两步的相应示意图。第三步纯化过程见图4，包括纯化流程、纯化后P结构域的洗脱色谱图以及所收集组分的代表性SDS-PAGE结果。根据SDS-PAGE分析最纯的组分被合并、浓缩，并用于X射线晶体学研究。

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讨论

在此，我们描述了一种高质量和高产量表达与纯化诺如病毒P结构域的实验方案。诺如病毒的研究尚不充分，需要持续获得其结构数据。据我们所知，采用其他方案进行P结构域的生产（例如，带有 GST 标签的 P 结构域）一直存在问题，迄今为止，关于诺如病毒与宿主相互作用的结构数据仍然缺乏。通过本文所述方法，我们最近在理解诺如病毒碳水化合物结合的分子细节方面取得了显著进展。本方案可适用于多种蛋白质，但该方案的成功实施取决于纯化方法各个步骤中的多个因素。

表达载体的设计是首要的重要步骤。我们对P结构域表达载体进行密码子优化，以提高其在大肠杆菌（E. coli）中的表达产量，并去除编码区内存在的相关限制性酶切位点。此外，我们删除了C末端的一个柔性区域，该区域可能对表达过程中的蛋白质折叠以及结晶过程中的蛋白堆积产生不利影响。以MBP融合蛋白形式表达是一种使蛋白在表达过程中保持可溶性的策略。

关于可溶性蛋白的表达，还需考虑其他参数。E. coli BL21 菌株适用于高产量蛋白表达，因此本实验方案中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由 CHS 基金会提供资助。我们感谢海德堡大学卓越集群 CellNetworks 内的蛋白质结晶平台在晶体筛选方面提供的支持，以及欧洲同步辐射装置（European Synchrotron Radiation Facility）提供的同步辐射设施。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
P 结构域 DNALife TechnologiesGeneArt 基因合成服务
pMalc2x  载体按需提供
BamHINew England BiolabsR0136L
NotINew England BiolabsR0189L
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202S
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒Qiagen27104
S.O.C. 培养基Life Technologies15544-034
Econo-Column 层析柱Bio-Rad73725122.5 × 10 cm，也可使用其他规格
Ni-NTA 琼脂糖凝胶Qiagen30210
Vivaspin 20 超滤管GE Healthcarevarious截留分子量分别为 10 kDa、30 kDa 和 50 kDa
Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞Life Technologies18265-017
One Shot BL21(DE3) 化学感受态 E. coliLife TechnologiesC6000-03
HRV 3C 蛋白酶Merck Millipore71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PGGE Healthcare28-9893-34尺寸排阻层析柱（SEC 柱）
JCSG 核心筛选套装Qiagenvarious共 4 个筛选板，每板 96 孔
碳水化合物Dextra Laboratories, UKvarious血型相关产物

参考文献

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