采用打印的聚糖微阵列策略，将传统的96孔板检测方法微型化，用于分析甲型流感病毒血凝素对含唾液酸受体的结合强度和特异性。
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本文内容
摘要
摘要
甲型流感病毒（IAV）的血凝素通过识别细胞表面的唾液酸作为功能性受体，从而进入细胞。野生水禽是IAV的天然宿主，但IAV可跨越物种屏障感染家禽、猪、马和人类。禽类病毒识别通过α2-3糖苷键连接至倒数第二个半乳糖的唾液酸（禽型受体），而人类病毒则优先识别具有α2-6糖苷键的唾液酸（人型受体）。为了监测禽类病毒是否正在适应人型受体，可采用多种方法。目前越来越多地使用包含多样化合成唾液酸寡糖库的糖芯片技术来评估受体特异性。然而，该技术不能用于测量结合强度（avidity）。结合强度的测定通常是通过检测系列稀释的血凝素或病毒与吸附在传统聚丙烯96孔板上的糖链之间的结合来实现。在此类实验中，含有α2-3或α2-6唾液酸的糖链可被偶联至生物素并吸附到链霉亲和素包被的孔板上，或偶联至聚丙烯酰胺（PAA）后直接吸附于塑料表面。我们已对该方法进行了显著微型化改进，将PAA偶联的唾液酸寡糖及其非PAA偶联的对应物直接打印在微孔玻璃载片上。这种设置可在单张载片上容纳48个阵列，能够同时对6种糖链结合蛋白在8个稀释度下检测其与6种不同糖链的结合情况，其中包括两个非唾液酸化的对照。其通量相当于传统96孔板法的18块板。糖芯片格式显著减少了化合物和生物试剂的消耗，从而大幅提高了实验效率。
引言
野生水禽是甲型流感病毒（IAV）的天然宿主，但IAV能够跨越物种屏障感染家禽和哺乳动物，包括人类。禽类IAV识别α2-3连接的唾液酸（禽型受体），而人类病毒则结合α2-6连接的唾液酸（人类型受体）。为了能够在人类之间高效复制和传播，禽类IAV需要结合人类型受体1。
根据血清学特征，甲型流感病毒（IAVs）被划分为不同亚型，这些特征主要针对其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两种包膜糖蛋白的抗原性。HA 能够结合唾液酸，而 NA 则在病毒生命周期的另一端发挥受体破坏酶的作用，可切割唾液酸2。所有感染人类的病毒，包括 H1N1、H2N2 和 H3N2，均起源于禽类3。在过去二十年中，已发生多起禽类病毒向人类传播的事件，其中以 H5N1、H7N7 和 H7N9 最为知名；然而，其他亚型也偶有感染人类的报道（如 H6N1、H7N1、H7N2、H9N2、H10N7、H10N8）4。幸运的是，目前尚无证据表明这些病毒能够完全适应人类类型的 α2-6 连接唾液酸受体5-8。若禽类或其他人畜共患病毒获得在人类宿主中有效复制和传播的能力，将对人类健康造成灾难性影响。因此，提前了解这些病毒如何进化以结合人类类型受体，将有助于全球对新发流感病毒的监测。
受体偏好的测定最初是利用不同物种的红细胞进行的，至今仍是流感研究人员常用的检测方法....
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方案
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
1. 芯片构建
- 聚糖制备与板设置
- 制备打印缓冲液储备液。首先配制500 ml的150 mM二碱式磷酸钠储备溶液，同时配制50 ml的150 mM单碱式磷酸钠储备溶液。将二碱式磷酸钠溶液置于烧瓶中，使用磁力搅拌子和pH计，缓慢滴加单碱式磷酸钠溶液，直至pH达到8.5。然后加入Tween-20至终浓度0.005%。
- 准备聚糖样品。将PAA偶联的聚糖（diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA)、3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) 和6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA)（图1A））用步骤1.1.1中的打印缓冲液稀释至100 µg/ml。单价聚糖diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2)、3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2) 和6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal....
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结果
打印、扫描与数据分析
为确保正确打印，必须使点样网格在聚四氟乙烯（Teflon）掩膜内的位置准确对齐，该掩膜用于界定芯片上每个微阵列的区域。在打印过程中，由于聚四氟乙烯涂层的特性，点样后的信号在MPX芯片上无法通过肉眼直接观察。因此需重点关注预先点样在聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysine）包被芯片上的预点样外观。打印完成后，应立即肉眼检查每张芯片，确认每个点样化合物的存在，其可见性源于缓冲液中的盐分在点样处干燥后形成的残留物。同时需检查微阵列中各点样位点是否位于聚四氟乙烯边界的正确位置，并确认点样特征的数量是否正确。
载玻片采用从低到高扫描功率的逐级扫描方式，以避免光漂白，并实现对高亲和力与低亲和力结合蛋白的比较，二者在输出信号上分别表现为较强和较弱的荧光强度。扫描完成后，使用成像软件测量输出图像中每个点的荧光强度。每个芯片均.......
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讨论
评估流感病毒（IAV）受体特异性是分析禽类病毒大流行潜力的重要步骤。病毒对唾液酸的识别与其多种生物学特性相关，例如与细胞的结合及从细胞释放的过程。明确禽类病毒获得结合α2-6受体能力并跨越物种屏障所需的关键氨基酸突变，有助于大流行的预防与准备。目前有多种检测方法用于确定受体特异性，但这些方法均存在局限性，例如仅能测量结合强度（avidity）而无法准确反映特异性 反之亦然.
本文介绍了一种基于广泛应用且公认的ELISA技术的新型微型化工具，该工具使用与聚丙烯酰胺（PAA）连接的复杂糖链的末端片段。通过使用4种明确的凝集素——其中2种来源于植物，2种来源于甲型流感病毒——我们证明了该方法能够保持特异性和相对亲和力。
当我们将ELISA微型化至糖阵列芯片上时，计算所减少的化学品和生物试剂用量，会得到显著巨大的差异。首先，对于生物试剂：我们使用的检测体积减少了10倍，并在6个重复中使用6种测试化合物，这相当于96孔板中的36行。结果是，我们使用的生物试剂减少了360倍。关键步骤包括正确的打印操作，以及使用未纯化的糖.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作部分得到了斯克里普斯微阵列核心设施以及美国疾病控制中心（J.C.P.）合同的支持。RPdV 获得了荷兰科学研究组织（NWO）Rubicon 和 VENI 基金的资助。由 NIGMS 基金 GM62116（J.C.P.）资助的功能糖组学联盟（http://www.functionalglycomics.org/）提供了本研究中使用的多种糖链。本文为斯克里普斯研究所第 29113 号出版物。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | 微孔载玻片 |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | 已停产 | 共聚焦微阵列扫描仪 |
| Innoscan 1100AL 扫描仪/Mapix 软件 | Innopsys | - | 共聚焦微阵列扫描仪 |
| MicroGrid II | Digilab | - | 微阵列点样仪 |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | 植物凝集素 |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | 植物凝集素 |
| Anti-Strep 抗体 | IBA | 2-1509-001 | HA 结合用抗体 |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | HA 结合用抗体 |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | 去垢剂 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma | 255793 | 点样缓冲液组分 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | 229903 | 点样缓冲液组分 |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma | P8920 | 点样前处理载玻片组分 |
| 氢氧化钠 | Sigma | 221465 | 点样前处理载玻片组分 |
| 乙醇 | Sigma | 493546 | 点样前处理载玻片组分 |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 46-013-CM | 孵育/洗涤缓冲液 |
| SMP4B 点样针 | Telechem | SMP4B | 点样针 |
| 压缩氮气（5级） | Praxair | UN1066 | 通用吹扫/干燥工具 |
| 硼酸 | Sigma | B6768-500G | 载玻片封闭试剂 |
| 乙醇胺 | Sigma | E9508-500ML | 载玻片封闭试剂 |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | 芯片上的网格标记物 |
| PAA-LNLN | 功能糖组学联盟 | PA368 | 点样的糖类 |
| PAA-3SLNLN | 功能糖组学联盟 | PA362 | 点样的糖类 |
| PAA-6SLNLN | 功能糖组学联盟 | PA343 | 点样的糖类 |
| LNLN | 功能糖组学联盟 | Te98 | 点样的糖类 |
| 3SLNLN | 功能糖组学联盟 | Te175 | 点样的糖类 |
| 6SLNLN | 功能糖组学联盟 | Te176 | 点样的糖类 |
| 384孔微孔板 | Matrix TechCorp | 4361 | 点样板 |
| VWR 实验室标记笔 | VWR | 52877-150 | 载玻片编号 |
| Wheaton 载玻片染色缸 | Sigma | Z103969-1EA | 封闭与干燥 |
参考文献
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional ba....
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重印与许可
