选择性收获边缘化肺部白细胞

摘要

边缘化肺部白细胞与其他白细胞群体相比具有独特的特征和不同的免疫功能。本文介绍了通过强制灌注大鼠和小鼠肺脏，选择性分离该肺部白细胞亚群的方法。边缘化肺部白细胞在决定机体对血源性和肺部相关疾病易感性方面似乎起着关键作用。

摘要

边缘化-肺部（MP）白细胞是指黏附于肺毛细血管内皮内侧的白细胞。研究表明，与机体其他免疫区室中的白细胞相比，MP-白细胞具有独特的组成和特性。有证据表明，自然杀伤细胞在MP-白细胞群体中表现出更高的细胞毒性，且该群体相较于循环系统或脾脏中的免疫细胞，具有特异性的促炎和抗炎特征。本文所述方法通过在小鼠或大鼠中对肺组织进行强制灌注，实现对MP-白细胞的选择性分离。与其他用于提取肺白细胞的方法（如组织研磨和生物降解）相比，该方法仅获取肺毛细血管来源的白细胞，不会混杂肺实质、间质或支气管肺泡细胞。此外，灌注技术能更好地保持MP-白细胞的完整性和生理微环境，避免因组织处理而诱发的生理反应。这一独特的MP-白细胞群体处于关键解剖位置，可识别并响应异常的循环细胞，因为所有循环中的恶性细胞和感染细胞在通过肺毛细血管时均会被滞留，并与内皮细胞及常驻白细胞发生物理相互作用。因此，在不同条件下选择性分离并研究MP-白细胞，有助于深入理解其生物学意义和临床价值，特别是在控制循环异常细胞及肺部相关疾病方面。

引言

黏附于肺部毛细血管的白细胞（即，边缘池-肺部（MP）白细胞）¹ 显示出与其他免疫区室中白细胞不同的白细胞组成和独特活性（例如，循环，脾脏，骨髓^2-4例如，与循环系统和脾脏中的自然杀伤（NK）细胞相比，MP-白细胞对多种肿瘤细胞表现出更高的NK细胞毒活性，同时具有差异化的信使RNA（mRNA）表达水平，并增加促炎和抗炎细胞因子的分泌。在细胞组成方面，MP-白细胞也不同于循环白细胞，其固有免疫与适应性免疫的比值高于循环白细胞（分别为50%与30%）。本文所介绍方法的目标是实现对MP-白细胞的选择性分离，以研究这一重要且独特的免疫区室（细胞群体），并阐明各种干预措施的影响例如，这些特定细胞上的免疫激活）

要理解这一独特细胞群的重要性，需注意到免疫系统可通过细胞介导免疫（CMI）的体内功能来控制循环肿瘤细胞、微转移灶及残留病灶。尽管免疫系统此前未能控制原发性肿瘤，但这种能力在癌症患者和动物模型中已有大量体内证据支持⁵。重要的是，这些发现常常与体外和离体研究结果不一致，后者报告大多数自体肿瘤细胞对人和动物血液样本中循环白细胞的细胞毒性作用具有抗性（通过细胞毒性实验测定）^6,7。这种差异可能归因于体内存在特定的白细胞亚群，例如上述的腹膜腔（MP）白细胞群，尤其是其中活化的自然杀伤（NK）细胞亚群³。事实上，研究发现对循环和脾脏来源白细胞具有抗性的同基因型肿瘤细胞（MADB106），可被MP-NK细胞有效裂解^3,8。因此，尽管MADB106细胞被称作“NK抗性”并可在Fischer344（F344）大鼠肺部形成转移，但其实际上受到MP-NK细胞的控制，而非由通常因易于获取而被广泛研究的循环或脾脏NK细胞所控制。

通过标准的肺部白细胞收获方法无法获得纯净且具有活性的MP-白细胞，这些标准方法基于肺组织研磨或生物降解⁹。与组织处理方法相比，我们的方法具有两个主要优势。首先，灌注法能够选择性地收获MP-白细胞，将其与来源于肺实质、间质及支气管肺泡腔室的其他细胞分离开来。其次，灌注技术能更好地保持MP-白细胞的完整性和生理微环境，而研磨和生物处理方法会损伤细胞，改变其形态，并诱导多种因子的产生和释放，这些因子可调节免疫活性，特别是抑制NK细胞的细胞毒性¹⁰。

肺是癌症转移和多种感染性疾病的主要靶器官。所有循环中的恶性细胞和受感染细胞都会经过肺毛细血管，在此处它们需要发生形变，并与毛细血管内皮细胞及常驻白细胞相互作用。在此条件下，循环细胞很容易被常驻的巨噬细胞样白细胞（MP-白细胞）所靶向。因此，从生物学角度来看，在这一免疫区室中存在活化的白细胞似乎具有优势，因而有必要在不同的生物学、实验和临床条件下研究这一独特的MP细胞群体。值得注意的是，多种生物反应调节剂（例如，多聚肌苷酸-多聚胞苷酸（poly I:C）或C型CpG寡脱氧核苷酸（CpG-C ODN））引起的全身性免疫激活已被证明对MP-白细胞的激活作用强于对循环白细胞的激活^3,8,11。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得特拉维夫大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 大鼠实验方案

1. 准备工作
   1. 准备2个21G蝶形针。可选步骤：通过锉平针头的锋利边缘，制备2个钝头蝶形21G针。
   2. 灭菌手术器械：两把剪刀、钝头镊子、止血钳、齿状组织镊，于121 °C高压灭菌器中重力（干燥）模式下灭菌至少30分钟。
   3. 配制含肝素的 PBS（30 单位/毫升）：每毫升磷酸盐缓冲液（1× PBS）中加入 30 单位肝素。室温使用。每只动物至少需要 35 毫升。
   4. 将肝素化 PBS 缓慢注入蠕动泵管路和蝶形针头中，以避免产生气泡。
2. 肺灌注及MP-白细胞的收集
   1. 使用8%异氟烷过量麻醉处死动物，通过监测呼吸停止确认动物死亡。
   2. 呼吸停止后，立即使用无菌剪刀和齿镊打开腹腔和胸腔。沿腹部正中线切开腹腔，直至剑突。
   3. 用镊子抬起胸骨，小心地在两侧剪开肋骨，避免刺破任何内部器官或大血管。在胸骨上夹住一个止血钳，并将肋骨向前折叠，以暴露心肺复合体。
   4. 将蝶形针插入心脏右心室，并在约一分钟内用注射器收集最大体积的血液（来自250 g动物的约6 ml）。
   5. 用止血钳夹闭下腔静脉，以防止肝脏反向灌注（参见 讨论).
   6. 将含有血液的注射器更换为蠕动泵的出流管路时，保持蝴蝶针位于右心室内。
   7. 将连接有5 ml 收集注射器的第二根蝶形针插入左心室，避免穿刺室间隔。
   8. 打开蠕动泵，调节流速至约5 ml/min，用注射器轻轻收集最初含有血液污染的灌注液数毫升。持续灌注直至灌注液颜色由深红色变为淡红色。 （弃去被血液污染的灌注液）。
   9. 在不停止蠕动泵的情况下，迅速将5 ml收集注射器更换为20 ml收集注射器，并以较高的灌注速度（最高达7 ml/min）收集20 ml肺灌注液。持续监测灌注液流入收集注射器的流量，避免产生负压。
   10. 停止蠕动泵的流动。
3. 白细胞提取
   1. 将灌注液在400 × g条件下离心10分钟。
   2. 吸出液体。
   3. 加入10 ml PBS或培养基，以400 × g离心10分钟，吸去上清液。重复此步骤两次。PBS或培养基的使用取决于样本的后续用途。
   4. 加入20 ml PBS或培养基，以400 × g离心10分钟，吸去上清液。
   5. 根据样本用途（FACS、PCR）将细胞重悬至所需浓度。 等等。).

2. 小鼠实验方案

1. 准备工作
   1. 准备2个25 G蝶形针。可选步骤：通过锉去针头的锋利边缘，制备2个钝头蝶形25 G针。
   2. 灭菌手术器械：两把剪刀、钝头镊子、止血钳、齿状组织镊，于121 °C高压灭菌至少30分钟，采用重力（干燥）模式。
   3. 通过向每毫升1×PBS溶液中加入30单位肝素，制备含肝素的PBS（30单位/毫升）。室温使用。每只动物至少需要25毫升。
   4. 将肝素化 PBS 缓慢注入蠕动泵管路和蝶形针头，以避免产生气泡。
2. 肺灌注及MP-白细胞的收集
   1. 使用8%异氟烷过量麻醉处死动物，通过监测呼吸停止确认动物死亡。
   2. 呼吸停止后，立即使用无菌剪刀和齿镊打开腹腔和胸腔。沿腹部正中线做切口，直至剑突。
   3. 用镊子抬起胸骨，小心地在两侧剪开肋骨，避免刺破任何内部器官或大血管。在胸骨上夹住一个止血钳，并将肋骨向前折叠，以暴露心肺复合体。
   4. 用止血钳夹闭下腔静脉，以防止肝脏反向灌注（参见讨论部分）。
   5. 将连接至蠕动泵出流管的蝶形针插入心脏右心室，同时将另一支连接至2 ml 收集注射器的蝶形针插入心脏左心室，避免穿刺室间隔。
   6. 打开泵，调节流速至约2 ml/min，用收集注射器收集最初含有血液污染的灌注液，直至灌注液颜色由深红色变为淡红色（弃去含血液的灌注液）。
   7. 在不停止蠕动泵的情况下，迅速将2 ml收集注射器更换为10 ml收集注射器，并以较高的灌注速度（最高达4 ml/min）收集10 ml肺灌注液。持续监测灌注液流入收集注射器的流动情况，避免产生负压。
   8. 停止蠕动泵的流动。
3. 白细胞提取
   1. 将灌注液在400 × g离心10分钟。
   2. 吸出液体。
   3. 加入10 ml PBS或培养基，以400 × g离心10分钟，吸去上清液。重复此步骤三次。PBS或培养基的使用取决于样本的后续用途。
   4. 加入10 ml PBS或培养基，以400 × g离心10分钟，吸去上清液。
   5. 根据样本用途（FACS、PCR）将细胞重悬至所需浓度， 等等。).

结果

与循环白细胞相比，腹膜腔白细胞亚群的组成存在差异。通过流式细胞术分析，鉴定并定量了循环白细胞和腹膜腔白细胞的亚群，以表征其组成。根据前向散射和侧向散射信号鉴定粒细胞和淋巴细胞。在淋巴细胞中，NKRP-1^bright细胞被鉴定为自然杀伤细胞（NK细胞），CD3⁺为T细胞，RM1⁺为单核细胞，CD4⁺/CD8⁺/CD25⁺用于T细胞亚群的鉴定。固有免疫细胞（包括粒细胞、单核细胞和NK细胞）占腹膜腔白细胞总数的52%（±1.52%），而循环白细胞中该比例为27.9%（±0.66%）（p <0.05）。相反，T细胞亚群（包括CD4⁺、CD4⁺CD8⁺ T细胞和调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺））以及树突状细胞在腹膜腔中的比例显著低于循环系统（p <0.005；n = 8）。该品系小鼠腹膜腔的细胞得率约为300万白细胞（

讨论

本文所述方法能够选择性地分离并研究MP-白细胞这一独特细胞群体。与循环系统或脾脏中的白细胞相比，MP细胞群体具有不同的白细胞亚群组成、更高的活化水平、更强的多种细胞因子释放能力，以及更高的促炎性和抗炎性细胞因子mRNA水平^2,3。具体而言，我们已证明MP-NK细胞对多种靶细胞的杀伤活性强于循环NK细胞^3,4，且表达更高水平的干扰素-γ。总体而言，我们的研究结果表明，MP-NK白细胞比循环NK细胞具有更强的细胞毒性，因此可能在控制血源性转移和肺转移方面具有更重要的生物学意义。因此，不应将脾脏或循环白细胞视为反映免疫状态的金标准或默认细胞群体，对于通常仅依赖循环白细胞开展的人类研究应谨慎解读。此外，由于多种疾病特异性地影响肺部，应在该器官内开展免疫学研究，并将MP区室与间质、实质及支气管肺泡亚区室区分开来，而我们的灌注方法正是实现了这一区分。

为确保本实验操作的成功，必须做到以下几点：（i）在呼吸完全停止后迅速打开腹腔和胸腔，以维持足够的血压，从而最大限度地收集心脏血液；同时（ii）应避免使用尖锐边缘的蝶形针头，以防对心脏心室造成不必要的额外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Autoclud 蠕动泵
蝶形针	OMG		26G
蝶形针	OMG		21G*3/4"
注射器	Pic 溶液		1 ml
注射器	Pic 溶液		2.5 ml
注射器	Pic 溶液		5 ml
注射器	Pic 溶液		10 ml
注射器	Pic 溶液		25 ml
钝头镊
剪刀
止血钳
组织镊
肝素钠（猪黏膜来源，无防腐剂）	Sigma Aldrich