Method Article

功能互补分析（FCA）:实验室练习设计和实施，以补充生化途径的教学

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

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所涉及的生化途径的酶活性的确认可以使用功能性互补分析（FCA）阐明。描述在这个手稿是FCA测定表明参与氨基酸，细菌严格的响应和细菌的肽聚糖的生物合成的代谢酶的酶活性。

Abstract

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功能互补测定（FCA）是一种体内测定，被广泛用来阐明基因/酶的功能/作用。这种技术是很常见的生物化学，遗传学等众多学科。该技术的全面介绍，以补充有关氨基酸，肽聚糖和细菌严格的响应在这个手稿报道的生化途径的教学。从所涉及的赖氨酸（L，L-二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）以及参与酪氨酸和苯丙氨酸的代谢酪氨酸转氨酶（tyrB）的代谢模式植物生物体拟南芥两个cDNA被突出显示。另外，细菌肽聚糖合成代谢途径是通过UDP-ñ-acetylmuramoyl基-L-丙氨酰-D- glutamate- 消旋 -2,6-二氨基庚二酸连接酶（MURE）基因从参与跨细菌Verrucomicrobium棘的分析突出-linking肽聚糖。细菌严格的响应也通过RSH（R ELA / s的锅ħomolog）负责在细菌Novosphingobium藻一个超粘液型双功能基因的分析报告。FCA的四个实例。视频将专注于他们三个，分别是赖氨酸，肽聚糖和严格的响应。

Introduction

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在基因的阐明功能（多个）/角色（多个）的上下文功能互补被定义为一个特定的同源或直系同源基因的当同源与观察到的表型来恢复一个特定的突变体与野生型状态的能力或直系同源基因在顺式或反式引入突变体背景。这种技术已被广泛地用于分离和鉴定的功能（多个）的许多基因的/角色（多个）。一个具体的例子是使用S的URA3突变的白色念珠菌乳清苷-5'-磷酸脱羧酶的分离和鉴定酵母和大肠杆菌的的pyrF突变体大肠杆菌 1的作者已经使用此技术来阐明所涉及的氨基酸，肽聚糖和在他们的研究方案的严格响应代谢后，已把该技术进在B的教学计划的基因的功能艾讴和分子生物学（BMB）在罗切斯特技术学院（RIT）程序。

笔者教植物生物化学/病理学（FPBP）（哈德森）和生物分离的基本原理:原理与实践（BPP）（哈德森/ Savka），在BMB计划在RIT两个上师选修课实验室为主的课程。由于一些那是在课程中讨论的主题与他们的研究兴趣关联，作者纳入了许多了在各自的研究项目中使用到这两个基于实验室的课程，技术和实验工具。一个这样的例子是功能互补作为实验室锻炼来加强涉及氨基酸从植物，肽聚糖和从细菌中严格的响应代谢酸代谢的演讲材料。

从植物是在FPBB过程所讨论的氨基酸途径的三个是赖氨酸（....

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Protocol

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注:作者愿意提供菌株和重组质粒，以促进功能互补分析，为教学目的纳入为个人谁是感兴趣。了用来促进功能互补实验的质粒列于表1。

1质粒的构建功能互补

  1. 对于功能互补二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）的克隆。
    1. 从五扩增DAPL开放阅读框（ORF） 棘和cDNA的距离A.拟南芥和C.通过PCR 藻 。使用在94℃1个循环2分钟，随后为15秒的94℃30个循环，60℃30秒和72℃2分钟。包括引物各12皮摩尔，1毫用MgSO 4所示 ，每个4脱氧核苷三磷酸为0.5mM，和模板DNA为0.5ng和PFX的1个单位DNA聚合酶。
      注:从工厂A.关于三个DAPL同源重组克隆的完整描述拟南芥 （ 在 -dapL），细菌Verrucomicrobium棘 （VS -dapL）和藻类莱茵衣藻（铬 -dapL）先前已公布。2,18-20
      注意:是用于DAPL直向同源物的克隆的引物如下:
      VS DAPL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCC....

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Results

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了在各功能互补分析中使用的细菌菌株列于表2中 。

功能互补分析:L，L-二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）

大肠大肠杆菌双突变AOH1（ΔDAPD :: Kan2，dapE6）窝藏在dapE的基因中的突变和DAPD基因的完全缺失（ 图1）。这样，突变体不能生长，除非提供DAP。由于这些突变，AOH1被视为营养缺陷型。AOH1适合升功能互补分析，L-二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）直向同源物作为DAPL催化L的合成，L-二氨基庚二酸直接从THDP便于PG和赖氨酸合成（ 图1）。

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Discussion

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许多是不可或缺的生物技术和分子生物学课程在罗切斯特技术学院的课程除了拥有课程的讲授实验室组件。学年2014-2015年的课程包含了共48场，其中29含有实验室组件，它代表了约60％。一个这样的课程是植物生物化学和病理学（FPBP），混合的讲座/实验课和生物分离的基本原理:原理与实践（BPP），以实验室为基础课程。

每门课程的实验室组件旨在加强讲课材料。例如，生化途径和代谢都严重强调FPBP和BPP。一些主题包括氨基酸代谢，合成肽，植物次生代谢，环境壁龛，除其他细菌的反应。作者已经集成功能COMPLEMentation在这两门课程实验练习巩固了在演讲和或实验室预演讲讨论的代谢途径的理解。讨论使用功能互补实验以分析参与赖氨酸，PG TYR，PHE和细菌的严格的响应的生化途径的基因的功能的四个例子。

有几个原因，作者已经集成了这个实验模块到他们的课程。首先，接触功能互补分析是加强或引入相关的遗传学，进化，基因组学，生物信息学和生物化学的主题一个很好的工具。其次，实验是轻便，并且可以在一个过程中的实验室环境来实现。所有被使用的试剂是安.......

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Disclosures

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作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

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AOH和MAS承认科学学院和生命科学在罗切斯特技术学院的支持托马斯H戈斯内尔学校。这项工作由美国国家科学基金会（NSF）奖AOH MCB-1120541一部分支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
大肠杆菌突变体Hudson/Savka 实验室或 CGSC （http://cgsc.biology.yale.edu/）
电穿孔仪Biorad-USA1652100
电穿孔比色皿Biorad-USA1652082
温控培养箱通用
微量离心机通用
Luria 琼脂Thermofisher Scientific22700025
Luria 肉汤Thermofisher Scientific12795084
M9 培养基Sigma-Aldrich63011
马铃薯葡萄糖培养基Fisher Scientfic DF0013-15-8
卡那霉素Sigma-AldrichK1377
二氨基庚氨酸Sigma-Aldrich92591
胸腺嘧啶Sigma-AldrichT0376
氯霉素Sigma-AldrichC0378
酪氨酸Sigma-AldrichT3754
苯丙氨酸Sigma-AldrichP2126
天冬氨酸Sigma-AldrichA9256
缬氨酸Sigma-AldrichV0500
亮氨酸Sigma-AldrichL8000
异亮氨酸Sigma-AldrichI2752
尿嘧啶Sigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
阿拉伯糖Sigma-AldrichA3256
四环素Sigma-Aldrich87128
Taq DNA 聚合酶Thermofisher Scientific10342-020
铂金 pfx DNA 聚合酶Thermofisher Scientific11708-013
T4 DNA 连接酶Thermofisher Scientific15224-041
大肠杆菌 Dh5-α ThermofisherScientific18258012
大肠杆菌Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo 载体Thermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 载体Thermofisher ScientificK2030-01

References

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  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

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