在脑核糖凝视与原子力显微镜

摘要

虽然核糖体结构已经被广泛表征，但多核糖体的组织仍然研究不足。为了克服这种知识的缺乏，我们在这里提出了一种详细的制备方案，用于通过原子力显微镜 （AFM） 在空气和液体中对哺乳动物多核糖体进行准确成像。

摘要

平移机械， 即核糖体或多聚核糖体是细胞中最大和最复杂的细胞质机械之一。多核糖体，核糖体，mRNA的，几种蛋白质和非编码RNA形成的，代表集成，其中平移控制发生平台。然而，尽管核糖体已被广泛研究，多核糖的组织仍然缺乏全面的了解。因而很多努力，需要以阐明多核糖体组织和可嵌入的翻译控制的任何新颖的机制。原子力显微镜（AFM）是一种类型的扫描探针显微镜的，允许在纳米级的分辨率采集3D图像。相比电子显微镜（EM）技术，原子力显微镜的主要优点之一是，它能够获得几千无论在空气中和溶液的图像，使该样本被接近生理条件下维持，而无需任何染色和固定的亲cedures。这里，对从鼠脑和它们对云母基板沉积多核糖的准确纯化的详细协议进行说明。该协议允许在空气和液体多核糖成像AFM和它们重建为三维物体。为了补充低温电子显微镜（冷冻电镜），该方法可以方便地用于系统的分析多核糖体和研究他们的组织。

引言

蛋白质的合成是在细胞^1,2-最耗能的过程。因此，并不奇怪，蛋白质丰度主要控制在翻译，而不是转录水平^3,4,5。多核糖体是转换的mRNA信息为功能蛋白质读数基波高分子组分。多聚核糖体是迄今公认的大分子复合物，几个平移控制收敛^6-13。尽管数百对核糖体结构^14-16研究，详细的分子见解翻译的动态和多聚核糖体的拓扑结构遇到了兴趣有限。因此，原生多聚核糖核蛋白复杂的组织结构及其在翻译的潜在影响仍然是相当模糊的问题。多聚核糖体可能隐藏还是未知数有序和职能部门，潜在的镜像什么核小体和后生CONTROLS已经代表了转录领域。事实上，这样一个有趣的假设的调查需要更多的研究和新的技术途径。在此行中，结构的技术和原子力显微镜可以卓有成效协作解开的新机制，用于控制基因表达的，类似于什么是为核小体^17,18来实现的。

由于核糖体^14-16的发现，它的结构已被广泛表征在原核生物^19,20，酵母²¹以及最近在人^22，在蛋白质合成的基础上提供的机制的分子描述。多核糖体进行初始确认在内质网的膜，从而形成典型的2D几何机构^14。正如前面提到的，多聚核糖体装配一直没有固定利率，作为核糖体结构的对象。在过去，多聚核糖体已基本上由TR研究ansmission EM为基础的技术。只是在最近，冷冻电镜技术，使纯化多聚核糖体的三维重建体外翻译系统^23-26，人类细胞裂解液²⁷或²⁸的细胞。这些技术提供了有关在多核糖体^23，26-28和在小麦胚芽多核糖体²⁴相邻的核糖体的接触表面进行初步分子描述的核糖体的核糖体组织更精致的信息。因此，冷冻电镜断层扫描允许与分子细节核糖体的核糖体相互作用的公开内容，但它是由大量的后处理的负担，并重建分析需要大量的计算资源进行数据处理。此外，为了得到核糖体的核糖体相互作用的分子细节，核糖体的高度解决地图是必需的，并且这种参考核糖体仅可用于几种。重要的是，冷冻电镜断层扫描是无法检测无RNA。 Theref矿石，需要新的技术来全面了解机器翻译的组织。

旁冷冻电镜，原子力显微镜也已在低等真核生物^29-33和人类²⁷用作用于多核糖体的直接成像的有用工具。相比EM，AFM不需要样品固定或标签。此外，测量结果可以在接近生理条件，并具有明确确定两个核糖体和裸RNA链²⁷上的唯一的可能性来进行。能够相对快速地执行单个多核糖体的成像，在纳米分辨率的小的后处理工作获得成千上万的图像相比，广泛和重后处理和重建分析通过冷冻电镜显微术所需的。因此，AFM数据处理和分析，也不需要昂贵的工作站和高计算能力。因此，该技术收集多核糖体的形状信息，形态特征（如高度，长度和宽度），核糖体密度的无RNA的存在和每多核糖体²⁷的核糖体比冷冻电镜更高的吞吐量的数量。在这样的方式，AFM代表了一个强大的和互补的方式来EM技术来描绘核糖^27。

在这里，我们提出了一个完整的管道从净化到AFM应用到图像和分析小鼠大脑多聚核糖体的数据分析。该协议的重点是净化问题上用于原子力显微镜成像云母基材多聚核糖体的精确沉积。除了 ​​可与通过AFM社区使用的通用软件容易地进行常规颗粒分析，一个ImageJ的³⁴插件 ​​，称为RiboPick，提出用于计数每多核糖体^27，35的核糖体的数目。

方案

用于获取小鼠组织中的做法是由身体特伦托大学的动物保护（OPBA）（意大利）批准，协议没有。 04-2015，每art.31因为法令没有。二千〇一十四分之二十六。所有小鼠均保持在特伦托大学中心综合生物学（CIBIO），意大利的模式生物设施。

注意:为避免样品的任何RNA的降解，用准备DEPC处理过的水中所有的缓冲区最大限度地减少RNase污染。

1.全脑多核​​糖体的制备

1. 收集脑组织（15分钟）
   1. 安乐死用CO ₂窒息野生型小鼠品系C57BL / 6 5分钟^36。小心从头骨³⁶解剖大脑出来，所述组织置于1.5ml试管，并立即将其放置在液氮中。储存在-80℃直到使用。
2. 裂解物的制备（30分钟）
   1. 使用粉碎全脑组织液氮下用研钵和研杵。
   2. 转移约25mg粉末的冷的离心管，并立即通过快速上下吹打25倍（以避免粉碎组织的解冻）添加0.8毫升裂解缓冲液（ 见表1）的和破坏细胞。
   3. 离心管以12,000rpm xg离心1分钟，在4℃以沉淀细胞碎片。
   4. 将上清转移到新的微量离心管中，并保持该管在冰上15分钟。
   5. 离心管以12,000rpm xg离心5分钟，在4℃以沉淀细胞核和线粒体。
   6. 将上清转移到新的离心管中。
   7. 储存在-80℃的上清液为最多6个月或立即使用它。
3. 蔗糖梯度制备和离心（2小时，30分钟）
   1. 用无RNase水（焦碳酸二乙酯处理的水（用DEPC水）或商业）洗涤超速离心管广泛的ð3％H ₂ O ₂ / DEPC H ₂ O解决方案。
   2. 置于冰上的管中并在每个管（参见，蔗糖溶液表1）的底部添加5.5冷的50％的蔗糖溶液。小心逐滴添加15％的蔗糖溶液滴，力求贴近相间，以便保持一个尖锐相间，直到管被完全填充。当管被完全填充，用橡胶塞将其关闭，以避免气泡形成。
   3. 在寒冷的房间轻轻水平放下管子，并保持在此位置2小时。在此时间后，慢慢伸直管放回竖直位置，并把它们在冰上。梯度现在准备好被使用。可替代地，使用常规的梯度前制备15-50％的蔗糖梯度。
   4. 在寒冷的房间从渐变的顶部取出仔细1.0毫升和覆盖一滴蔗糖下降与胞浆裂解液（即 STE得到的上清液p 1.2）。
   5. 小心地将管放入水平转头的水桶。使用超速离心机离心100分钟梯度180,000 xg离心在4℃下。
   6. 离心分离后，离开管子自己水桶20分钟，4℃，让梯度稳定。
4. 蔗糖梯度分馏（2小时）
   1. 小心地从超速离心机转子删除一个超速离心管并将其安装密度梯度分馏系统的集热设备。收集1毫升级分监测吸光度在用UV / VIS检测器（参见图1上图 ）260纳米。置于冰上收集到的馏分。
   2. 制备30-40微升感兴趣的级分的等分试样，在-80℃，直到使用它们存储之前保持他们在冰上。不使用行多于两个冻融循环等份或蔗糖级分（ 见图1中的下图 ）。

2.样品制备原子力显微镜（3小时）

1. 使用磁带，剥去云母片。
2. 用DEPC水冲洗云母片3-4次，并把它变成一个小的培养皿中。然后用空气干燥的表面上。
3. 覆盖用200μl1mM的硫酸镍₄的云母并在室温下孵育3分钟。
4. 除去镍溶液中，然后用空气干燥的表面上。通过将培养皿在冰上云母进行在4℃以后所有的步骤。
5. 在冰上解冻1.4.2获得等份，轻轻用在云母滴添加所有样品下降。使用100-200微升尖，传播云母的整个表面上的样品。在冰上孵育样品3分钟。
6. 覆盖一滴云母片下降用200μl冷缓冲区的AFM（ 见表1）和孵育在冰上1小时。
7. 成像液
   1. 仔细缓冲区AFM捞出洗净云母片3-4时s的200微升冷缓冲区AFM以去除多余的蔗糖。然后洗云母片用冷水洗涤液的3倍（ 见表1），同时保留的解决方案的一些微升覆盖的云母表面。
   2. 进入3点（图像采集）。
8. 成像在空气中
   1. 小心地取出缓冲区AFM和用200μl冷缓冲区AFM洗云母3-4次以除去过量的蔗糖。然后，洗云母用冷洗涤溶液3倍（ 见表1），并使用纸排出多余的水。
   2. 保留样品的化学罩与培养皿部分开放的顶部下干燥。 2小时后，收于RT培养皿和存储。测量样品后2-3小时，因为它们是稳定多年。

3.图像采集（热稳定后，每幅影像15分钟）

注意:固定在云母多核糖体可在空气中或在液体中进行成像，使用AC模式。

1. 附加云母使用双面胶带的样本保持器。
2. 插入以下制造商的指示在AFM中阶段的样品架。当显像液中，如果可能的话，尝试在温度低于25℃以保持样品，以增加在时间上多核糖体的稳定性。
3. 选择适用于交流成像的悬臂，它安装在刀片保持器下面的制造商的指示。在这里，使用悬臂用武力2-20牛顿/米的空中成像和液体成像约为0.1牛顿/米之间不变。
4. 调整在悬臂激光点和零的象限检测器的信号。
5. 选择一个适当的驱动频率并且具有10-20纳米的振幅驱动该悬臂。
6. 接近样品直至前端的表面接合。
7. 选择2×2微米的扫描区域，至少获得512×512像素的图像（像素宽度<4海里），选择一个实时背景减除模式和20-25纳米的Z比例。
8. 检查ŧ他图像寻找在范围25-30纳米的空气和25时30纳米液体和宽度取得时特征10和15毫微米之间的高度圆形物体的存在。调整设定值和反馈参数，直到尖锐物体可视化。背景应显示良好的样品中的相对平坦的，具有一定的2-4纳米的高度的物体（参见图2A和B）。
9. 如果图像看起来不错（如点3.8所示），收购在不同的采样区域的几个（至少十）的2x2微米扫描。
10. （可选）。如果有必要，获取选定多聚核糖体的高分辨率的图像（ 见图2C）。
11. 应用软件更正（平面减法和行由行校正算法）来纠正AFM图像去除任意倾斜和漂移的影响。

4.数据分析（每幅影像30分钟）

1. preferent:在ImageJ的（应用比例因子可选）导出图像ially使用无损压缩格式， 例如，在TIFF格式（ 见图3A）。
2. 使用ImageJ的宏工具集RiboPick.ijm（在ImageJ的宏/工具集子目录被复制）来计算在多核糖体的核糖体（参见图3B），并计算样品的统计特性（ 见图3C）。
   1. 启动加载使用<读取图像>工具，初始化程序的图像。
   2. 挑选的标准ImageJ的<点选择>工具（Shift +左键点击允许核糖体的多选）核糖体中心。马克与<马克核糖体>工具选择的核糖体。核糖体坐标将出现在自定义文本窗口。
   3. 添加更多的核糖体为相同的多核糖体重复在点4.2.2所示的过程。
   4. 删除使用<撤消最后挑>工具（开始从最后添加的核糖体取出到第一个错误标记的核糖体212;在当前的多核糖体只）。
   5. 当完成多聚核糖体，使用<新建多聚核糖体>工具。作为多核糖号添加作为覆盖到图像，文本窗口被更新。
   6. 使用<减结果，并靠近>写核糖体坐标文件（用于图像的默认单位），并且总结了拾取核糖体和多核糖PNG图像。原始图像被关闭没有被保存。

结果

整个小鼠大脑的蔗糖梯度多聚核糖分析

有可能从由多核糖体分析，其中根据它们的重量及尺寸分离大分子细胞裂解物纯化核糖。与多核糖体分析，从培养的细胞或组织，如在本实施例获得的细胞质裂解物，装载到一个线性蔗糖梯度和加工通过超速离心根据其沉降系数以分开40S和60S亚基，80S核糖体和多核糖体游离的RNA（ 图1上图）。在254nm样品和馏分收集的吸光度使在核糖体或核糖具有不同数目每转录的核糖体的富集的蔗糖级分的分离。的级分可以被收集，等分为原子力显微镜成像并储存在-80℃（ 图1下面板）。

从AFM在空气中观察到小鼠大脑本地多聚核糖体露出紧核糖体的相互作用

讨论

由于DNA的结构被证明是至关重要来形容转录和染色质组织提高了我们的基因表达的转录调控认识的过程，它分析多聚核糖体的组织和结构，提高真实的理解是必不可少的翻译及其调控。

所描述的协议中，轻轻地固定在一个平面上的多核糖体的最佳密度，适于原子力显微镜成像被获得。使用具有方便制备的样品这些条件下，每小时近50多核糖体可以被收购，准备作进一步的分析和表征。此外，存储在RT干燥的样品已经被证明是适合于后一年以上成像。

为了成功地获得我们的协议核糖体的图像，还有一些关键的步骤:使用已立即正确dissectio后快速冷冻组织n和储存在-80℃下，以尽量减少RNA降解;使用裂解缓冲液含有环己酰亚胺和RNase抑制剂，以避免由mRNA核糖体解离;云母样品沉积过程中进行冰上孵育所有;并准备对空气原子力显微镜成像的样本时，要广泛地洗上与放线菌酮存在缓冲区和RNase自由水云母样品。最后一点是特别重要的。如果图像似乎包含光滑的表面大约在合适的高度，但100-1000纳米宽，这是一个不好洗样品的明确指示（通常核糖体/多聚核糖体仍然可以观察到淡淡的，嵌入的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放线菌	Sigma	01810	裂解物
DNAseI	Thermo Scientific	89836	裂解物
RiboLock RNAse 抑制剂	Life technologies	EO-0381	裂解物制备
DEPC	Sigma	40718	裂解物制备
Triton X100	Sigma	T8532	裂解物的制备
DTT	Sigma	43815	裂解物的制备
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750	裂解物的制备
微量离心机	Eppendorf	5417R	裂解物制备
蔗糖	Sigma	S5016	蔗糖梯度制备
超速离心机	Beckman Coulter	Optima LE-80K	蔗糖梯度离心
超速离心机 转子	Beckman Coulter	SW 41 Ti	蔗糖梯度离心
Polyallomer 管	Beckman Coulter	331372	蔗糖梯度离心
密度梯度分馏系统	Teledyne Isco	67-9000-176	蔗糖梯度分级分离
AFM	Asylum Research	Cypher	多核糖体可视化