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方法文章

利用原子力显微镜观察脑组织多聚核糖体

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DOI：

10.3791/53851

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2016年3月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, 2Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

本文内容

摘要

尽管核糖体结构已被广泛表征，多聚核糖体的结构组织仍研究较少。为弥补这一知识空白，本文提供了一种详细的制备方案，用于在空气和液体环境中通过原子力显微镜（AFM）对哺乳动物多聚核糖体进行精确成像。

摘要

翻译机器 即， 多聚核糖体（polysome）或称多核糖体，是细胞中体积最大、结构最复杂的细胞质分子机器之一。多聚核糖体由核糖体、mRNA、多种蛋白质及非编码RNA共同组成，是实现翻译调控的整合性平台。然而，尽管核糖体已被广泛研究，多聚核糖体的整体组织结构仍缺乏系统性的深入理解。因此，亟需开展大量工作以阐明多聚核糖体的组织模式及其可能蕴含的新型翻译调控机制。原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）是一种扫描探针显微技术，可实现纳米级分辨率的三维成像。与电子显微镜（electron microscopy, EM）技术相比，AFM的主要优势之一在于其可在空气和溶液环境中获取数千幅图像，使样品无需染色和固定处理，即可维持在接近生理状态的条件下进行观察。本文介绍了一种从小鼠脑组织中精确纯化多聚核糖体并将其沉积于云母基底的详细实验方案。该方案支持在空气和液体环境中利用AFM对多聚核糖体进行成像，并实现其三维结构重建。作为冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术的有力补充，该方法可便捷地用于多聚核糖体的系统性分析及其组织结构的研究。 多聚核糖体，翻译调控，原子力显微镜，核糖体，mRNA，三维成像，小鼠脑，云母基底，冷冻电镜

引言

蛋白质的合成是细胞中最消耗能量的过程1,2。因此，蛋白质丰度主要在翻译水平而非转录水平上受到调控，这一点并不令人意外3,4,5。多聚核糖体是将mRNA信息转化为功能性蛋白质产物的基本大分子组分。迄今为止，多聚核糖体被公认为多个翻译调控机制汇聚的大分子复合物6-13。尽管已有数百项关于核糖体结构的研究14-16，但对翻译动态过程及多聚核糖体拓扑结构的分子层面深入理解仍受到有限关注。因此，天然多聚核糖核蛋白复合物的组织方式及其对翻译的潜在影响仍是较为模糊的问题。多聚核糖体可能隐藏着尚未被发现的有序且具有功能性的组织模式，这种模式或许可类比于核小体和表观遗传调控在转录领域所发挥的作用。事实上，验证这一引人入胜的假说需要进一步的研究和新的技术手段。在这方面，结构生物学技术与原子力显微镜有望协同合作，揭示基因表达调控的新机制，正如先前在核小体研究中所取得的成果一样17,18。

自从核糖体被发现以来14-16，其结构在原核生物中已被广泛表征19,20，酵母21 以及最近在人类中的研究22，提供了蛋白质合成基础机制的分子描述。多聚核糖体最初被发现位于内质网膜上，形成典型的二维几何结构14如前所述，多核糖体组装并未像核糖体结构那样持续受到广泛关注。过去，多核糖体主要通过透射电子显微镜（EM）技术进行研究。直到最近，冷冻电镜（cryo-EM）技术才实现了对纯化多核糖体的三维重构 体外 翻译系统23-26，人细胞裂解液27 或在细胞中28这些技术为多聚核糖体中核糖体-核糖体的排列结构提供了更为精细的信息23, 26-28 以及对小麦胚芽多聚核糖体中相邻核糖体接触表面的初步分子描述24因此，冷冻电镜断层成像技术能够以分子分辨率揭示核糖体-核糖体相互作用，但其后续处理与重构分析极为复杂，需要大量计算资源进行数据处理。此外，要获得核糖体-核糖体相互作用的分子细节，必须依赖高分辨率的核糖体参考图谱，而此类高分辨率参考核糖体目前仅在少数物种中获得。重要的是，冷冻电镜断层成像技术无法检测游离RNA。因此，需要开发新的技术手段以全面理解翻译机器的组织结构。

除了冷冻电镜（cryo-EM）外，原子力显微镜（AFM）也被用作直接成像低等真核生物29-33和人类27中多聚核糖体的有力工具。与电镜相比，AFM无需对样品进行固定或标记。此外，AFM可在接近生理条件下进行检测，并能够明确识别核糖体和裸露的RNA链27。单个多聚核糖体的成像可相对快速完成，以纳米级分辨率获取数千幅图像，且后期处理工作量远小于冷冻电镜所需的复杂而繁重的后期处理与重构分析。因此，AFM的数据处理与分析无需昂贵的工作站和高计算能力。该技术可高通量地获取多聚核糖体的形态、形态学特征（如高度、长度和宽度）、核糖体密度、游离RNA的存在情况以及每个多聚核糖体上的核糖体数量等信息27。因此，AFM是一种强大且与电镜技术互补的方法，可用于描绘多聚核糖体的结构27。

本文介绍了一个从纯化到数据分析的完整流程，其中应用原子力显微镜（AFM）对小鼠脑组织中的多聚核糖体进行成像与分析。该方案重点阐述了多聚核糖体的纯化步骤以及将其精确沉积在用于AFM成像的云母基底上的方法。除了可使用AFM领域常用软件轻松实现的传统颗粒分析外，本文还介绍了一种名为RiboPick的ImageJ34插件，用于统计每个多聚核糖体中的核糖体数量27, 35。

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方案

获取小鼠组织的操作方法已获得意大利特伦托大学动物保护机构（OPBA）批准，批准编号为04-2015，依据2014年第26号立法法令第31条。所有小鼠均饲养于意大利特伦托大学综合生物学中心（CIBIO）的模式生物设施内。

注意：为避免样本 RNA 降解，配制所有缓冲液时应使用经 DEPC 处理的水，以最大限度减少 RNase 污染。

1. 从全脑制备多聚核糖体

  1. 采集脑组织（15 分钟）
    1. 以 CO₂ 处死野生型 C57BL/6 小鼠品系2 窒息5分钟36小心地将脑组织从颅骨中解剖出来36将组织放入1.5 ml离心管中，立即置于液氮中，随后于-80 °C保存至使用。
  2. 裂解液的制备（30 分钟）
    1. 在液氮中使用研钵和研杵研磨整个脑组织。
    2. 将约25 mg粉末转移至预冷的微量离心管中，并立即（避免粉碎组织解冻）加入0.8 ml裂解缓冲液（见 表1）并通过快速吹打25次使细胞破裂。
    3. 在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 1 分钟，使细胞碎片沉淀。
    4. 将上清液转移至新的微量离心管中，冰上放置15分钟。
    5. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 5 分钟，使细胞核和线粒体沉淀。
    6. 将上清液转移至新的微量离心管中。
    7. 将上清液于 –80 °C 保存，最多可保存 6 个月，或立即使用。
  3. 蔗糖梯度制备与离心（2小时30分钟）
    1. 用无RNase水（焦碳酸二乙酯处理水（DEPC水）或商用无RNase水）和3% H2O2/DEPC H2O溶液。
    2. 将试管置于冰上，并在每根试管底部加入5.5 ml冰冷的50%蔗糖溶液（参见 表1 对于蔗糖溶液，需将15%蔗糖溶液逐滴缓慢加入，滴加时应靠近界面处，以保持清晰的界面，直至试管完全充满。当试管完全充满后，用橡胶塞封闭管口，以避免气泡形成。
    3. 在低温室内，轻轻将离心管水平放置，并保持该状态2小时。此后，缓慢将离心管恢复至垂直位置，并置于冰上。此时梯度已准备就绪，可直接使用。或者，可使用常规梯度制备器制备15–50%蔗糖梯度。
    4. 在低温房间中，小心地从梯度顶部移除1.0 ml液体，并将细胞质裂解液逐滴加至蔗糖上即， 步骤1.2中获得的上清液
    5. 小心将离心管放入摆桶转子的吊桶中。使用超速离心机在4 °C、180,000 x g条件下离心100分钟。   
    6. 离心后，将离心管保留在离心桶中，在 4 °C 下静置 20 分钟，以使梯度稳定。
  4. 蔗糖梯度分离（2 小时）
    1. 小心地从超速离心转子中取出一根超速离心管，并将其安装在密度梯度分级系统收集装置的收集位置上。使用紫外/可见光检测器在260 nm波长下监测吸光度，收集1 ml的组分（参见 图1 上图将收集的组分置于冰上保存。
    2. 准备30–40 μl的目标组分分装样品，分装后置于冰上，随后储存于-80 °C备用。避免使用经过两次以上冻融循环的分装样品或蔗糖组分（参见 图1 下图).

2. 原子力显微镜样品制备（3 小时）

  1. 使用胶带剥离云母片。
  2. 用DEPC水清洗云母片3-4次，并将其放入一个小培养皿中。然后用空气干燥表面。
  3. 在云母表面覆盖200 μl的1 mM NiSO4，室温孵育3分钟。
  4. 移除镍溶液，然后用空气干燥表面。将含有云母的培养皿置于冰上，后续所有步骤均在4 °C下进行。
  5. 将1.4.2步骤中获得的样品分装在冰上解冻，并轻轻将全部样品逐滴加到云母表面。使用100-200 μl的枪头，将样品均匀铺展在整个云母表面。将样品在冰上孵育3分钟。
  6. 逐滴加入200 μl冷的AFM缓冲液（见表1）覆盖云母片，并在冰上孵育1小时。
  7. 液体中成像
    1. 小心移除AFM缓冲液，用200 μl冷的AFM缓冲液清洗云母片3-4次，以去除多余的蔗糖。然后用冷的洗涤液（见表1）清洗云母片3次，使云母表面保留少量微升量的溶液。
    2. 转至第3步（图像采集）。
  8. 空气中成像
    1. 小心移除AFM缓冲液，用200 μl冷的AFM缓冲液清洗云母片3-4次，以去除多余的蔗糖。然后用冷的洗涤液（见表1）清洗云母片3次，并用滤纸吸去多余水分。
    2. 将培养皿盖部分打开，置于通风橱内让样品自然干燥。2小时后关闭培养皿，室温保存。样品可在2-3小时后进行测量，且可长期稳定保存数年。

3. 图像采集（热稳定后每张图像15分钟）

注意：固定在云母表面的多聚核糖体可在空气或液体中使用交流模式进行成像。

  1. 使用双面胶带将云母片固定在样品台上。
  2. 按照制造商的说明将样品台插入原子力显微镜（AFM）载物台。若在液体中成像，应尽可能将样品温度维持在低于25 °C，以提高多核糖体随时间的稳定性。
  3. 选择适用于交流（AC）成像的悬臂梁，并按照制造商的说明将其安装到探针 holder 上。此处，在空气中成像时使用力常数为2–20 N/m的悬臂梁，液体中成像时使用力常数约为0.1 N/m的悬臂梁。
  4. 调节激光光斑在悬臂梁上的位置，并将四象限探测器信号归零。
  5. 选择合适的驱动频率，并以10–20 nm的振幅驱动悬臂梁。
  6. 使探针接近样品，直至探针与样品表面接触。
  7. 选择2×2 μm的扫描区域，采集至少512×512像素的图像（像素宽度 < 4 nm），选择实时背景扣除模式和20–25 nm的Z尺度。
  8. 检查图像，寻找在空气中成像时高度为10–15 nm、在液体中成像时高度为25–30 nm、宽度在25–30 nm范围内的圆形物体。调整设定点和反馈参数，直至观察到清晰的物体。在质量良好的样品中，背景应相对平坦，偶见一些高度为2–4 nm的物体（见图2A和B）。
  9. 如果图像质量良好（如步骤3.8所述），则在不同样品区域采集多幅（至少十幅）2×2微米的扫描图像。
  10. （可选）如有必要，对选定的多核糖体进行高分辨率成像（见图2C）。
  11. 应用软件校正（平面扣除和逐行校正算法）对AFM图像进行处理，以消除任意倾斜和漂移效应。

4. 数据分析（每张图像30分钟）

  1. 在 ImageJ 中导出图像（可选：应用比例因子），优先使用无损压缩格式， 例如， TIFF 格式（参见 图3A).
  2. 使用 ImageJ 宏工具集 RiboPick.ijm（需复制到 ImageJ 的 macro/toolset 子目录中）对多聚核糖体中的核糖体进行计数（参见 图3B）并计算样本的统计学特性（参见 图3C).
    1. 开始使用以下方法加载图像 <读取图像> 启动程序的工具。
    2. 使用标准 ImageJ 拾取核糖体中心 <点选择> 工具（按住 Shift 键并单击鼠标左键可多选核糖体）。标记所选的核糖体 <标记核糖体> 工具。核糖体坐标将显示在自定义文本窗口中。
    3. 重复步骤4.2.2中所述操作，向同一多聚核糖体添加更多核糖体。
    4. 使用以下方法去除标记错误的核糖体 <撤销上一次选择> 工具（仅针对当前多聚核糖体，从最后添加的核糖体开始依次向前移除）。
    5. 当多聚核糖体完成时，使用 <新多聚核糖体> 工具。随着多聚核糖体数量作为叠加图像添加到图片上，文本窗口会同步更新。
    6. 使用 <保存结果并关闭> 写入核糖体坐标文件（使用图像的默认单位）以及一张总结所挑选的核糖体和多聚核糖体的 PNG 图像。原始图像在未保存的情况下被关闭。

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结果

小鼠全脑蔗糖梯度多聚核糖体分析

可以通过多核糖体分析法从细胞裂解液中纯化多核糖体，该方法根据大分子的重量和大小进行分离。通过多核糖体分析，将来自培养细胞或组织（如本示例）的胞质裂解液上样至线性蔗糖梯度中，并通过超速离心处理，根据沉降系数将游离RNA与40S和60S亚基、80S核糖体以及多核糖体分离开来（图1 上图）。通过检测样品在254 nm处的吸光度并收集各组分，可分离出富含核糖体或含有不同数量核糖体的多核糖体的蔗糖组分。收集的组分可用于原子力显微镜（AFM）成像，并分装后于-80 °C保存（图1 下图）。

通过原子力显微镜在空气中观察小鼠脑组织中的天然多核糖体揭示了核糖体之间的紧密相互作用

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讨论

由于DNA结构被证实对描述转录过程至关重要，而染色质的组织形式推动了我们对基因表达转录调控的理解，因此分析多聚核糖体的结构与组织形式对于深入理解翻译过程及其调控机制具有重要意义。

通过所述方案，可在平面上获得密度适宜且温和固定的多聚核糖体，适用于原子力显微镜（AFM）成像。在这些条件下使用便捷制备的样品，每小时可获取近50个多聚核糖体，可用于进一步分析与表征。此外，室温下保存超过一年的干燥样品经证实仍适用于成像。

要成功利用本方案获得多聚核糖体图像，需注意以下几个关键步骤：使用组织在解剖后立即进行速冻并保存于 -80 °C，以最大限度减少 RNA 降解；裂解缓冲液中应含有环己酰亚胺和 RNase 抑制剂，以防止核糖体从 mRNA 上解离；在样品沉积到云母片上的过程中，所有孵育步骤均需在冰上进行；在准备用于空气中原子力显微镜（AFM）成像的样品时，需在环己酰亚胺存在下，用缓冲液和无 RNase 的水对云母片上的样品进行充分洗涤。最后一点尤为重要。如果图像中出现高度大致正确但宽度在 100–1,000 nm 之间的平滑表面，则明确...

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披露

作者在本文中无任何竞争性经济利益，也无可披露的内容。

致谢

本研究由意大利特伦托自治省资助的AXonomIX研究项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
环己酰亚胺Sigma01810裂解液制备
DNase IThermo Scientific89836裂解液制备
RiboLock RNase抑制剂Life technologiesEO-0381裂解液制备
DEPCSigma40718裂解液制备
Triton X-100SigmaT8532裂解液制备
DTTSigma43815裂解液制备
脱氧胆酸钠SigmaD6750裂解液制备
微量离心机 Eppendorf5417R裂解液制备
蔗糖SigmaS5016蔗糖梯度制备
超速离心机Beckman CoulterOptima LE-80K蔗糖梯度离心
超速离心机转子Beckman CoulterSW 41 Ti蔗糖梯度离心
聚丙烯离心管Beckman Coulter331372蔗糖梯度离心
密度梯度分馏系统 Teledyne Isco67-9000-176蔗糖梯度分馏
AFMAsylum ResearchCypher多聚核糖体可视化

参考文献

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多聚核糖体纯化脑组织蔗糖梯度云母沉积核糖体成像纳米级分辨率冷冻电镜互补翻译调控多聚核糖体结构
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