联合记录小鼠毛囊梭形末梢机械刺激传入输出与神经末梢标记

摘要

介绍了一种简单且新颖的技术，用于记录机械刺激支配小鼠耳部皮肤毛囊的环层小体梭形末梢所引发的传入放电。

摘要

本文介绍了一种新颖的解剖与记录技术，用于监测小鼠耳廓毛发受到机械位移刺激后诱发的传入神经放电。该技术成本低廉，且仅需使用大多数电生理实验室常见的设备或易于购买的材料即可实施。解剖过程简单快捷，机械位移由通用的压电陶瓷片提供，由专有软件控制。同一软件还负责记录和分析电神经图信号输出。诱发神经活动的记录通过商用差分放大器连接火焰抛光的标准玻璃微电极完成。文中提供了若干实用建议，以改善制备质量、刺激条件和记录条件，从而优化记录效果。该系统适用于检测毛囊环层小体梭形末梢的电生理与光学特性，以及药理学和/或遗传学干预后的效应。文中还给出了将电记录与机械刺激及styryl吡啶鎓类活体染料标记相结合的应用实例。

引言

支配哺乳动物毛囊的感觉轴突的梭形终末在毛干上皮周围形成栅栏状排列。其功能是检测其所包绕毛发的机械位移。这些终末包含快适应和慢适应感受器的混合类型，主要在毛发移动时产生短暂的放电活动。即使存在持续的位移，一旦运动停止，其活动也会迅速终止。本文描述了用于研究梭形终末结构与功能相关性的这种小鼠耳廓模型的建立过程。耳廓具有多种研究此类神经末梢的优势特征。首先，耳廓本质上是由两层皮肤背对背贴合而成，中间几乎没有其他组织干扰，便于接触毛囊和神经末梢。皮肤非常薄，且由于坚韧的结缔组织含量极少，易于解剖。神经支配区域易于接近并识别。尽管存在毛囊，但其分布相对稀疏，有利于对单个或少量毛囊进行机械刺激。薄薄的皮下真皮层使得药理学药物和染料能够良好地到达神经末梢，因此特别适合使用荧光显微镜进行成像研究。成像既可在活体神经末梢中进行，也可在固定及进一步组织学处理后实施。

支配毛囊的机械感觉神经元的反应传统上主要在啮齿类动物的触须^1,2中进行研究，其次是在离体皮肤制备标本中研究^3,4。这些研究使我们深入了解了围绕毛干神经末梢处机械感觉生理学的一般原理。触须制备方法能够对单个毛囊的运动实现极为精确的控制。然而，由于其结构复杂，解读其输出信号仍具挑战性，因为触须毛囊至少包含8种解剖结构上不同的机械感觉末梢类型⁵，而将这些形态学类型与特定的电生理反应相对应的问题至今仍存在争议。小鼠皮肤/隐神经制备标本通常采用脱毛状态用于研究触觉和痛觉反应。该制备中毛囊的神经支配相对简单，但由于毛囊密度较高，且三种不同类型的毛囊（针毛、Awl/auchene毛和锯齿状毛）彼此紧密相邻⁶，因此仍难以特异性地研究单个毛囊或单一类型感觉末梢的反应。此外，该制备过程涉及复杂的解剖操作。最后，在触须及其他皮肤制备标本中，当ex vivo制备标本仍处于活体状态时，很难对所涉及的感觉末梢进行可视化观察。因此，即使在表达GFP的小鼠品系中，仍需进行组织切片。或者，还需进一步的组织学/免疫学处理步骤，如固定和/或抗体孵育以进行免疫荧光染色。

因此，我们建立了耳廓制备方法，并利用该方法对有限群体的毛囊传入神经进行了电生理记录，证明了这些梭形末梢存在膜循环现象，其证据是吸收了苯乙烯吡啶盐染料。最后，我们证明该染料并不干扰机械敏感性，表明其不会阻断机械转导通道。本文还展示了简单刺激和分析方案的结果。

方案

小鼠术后 尸体组织采集必须采用经伦理批准的方法。在英国，颈椎脱位是政府批准用于成年小鼠的安乐死方法（列于英国《1986年动物（科学程序）法案》附表1方法及欧盟指令2010/63/EU中）。该立法由阿伯丁大学动物福利与伦理审查委员会在当地执行，该委员会已审查并批准了本方案中所使用的所有操作程序。

注意：这些方法已在Banks的研究报告中使用 等⁷

1. 为电生理实验准备耳朵

1. 解剖前，配制标准的生理盐水（如 Liley's (1956) 溶液），并用 90% O₂/5% CO₂ 气体饱和。Liley's 盐水（单位：mM）的成分为：NaHCO₃ (12)、KCl (4)、KH₂PO₄ (1)、NaCl (138.8)、MgCl₂ (1)、CaCl₂ (2) 和葡萄糖 (11)。
2. 以人道方式处死成年小鼠，注意避免损伤耳部附近的颅骨。本实验中使用 C57/Bl6J 和 MF1 小鼠，但任何标准实验室品系的小鼠均可使用。若需将电生理记录与苯乙烯染料标记相结合，建议使用体重 <25 g 的小鼠，因为在较大个体中染料标记效果较差，通常仅在局部有限区域可见。
3. 使用大剪刀或骨剪将头部剪下。
4. 将头部背侧朝上置于盛有充气 Liley's 溶液的宽底解剖皿中（通常使用直径 50 cm 的培养皿），放置于体视解剖显微镜载物台上。每隔约 10 分钟用充气盐水冲洗或短暂浸没头部一次。
5. 使用弹簧剪和 #3 镊子小心切开并分离外耳（耳廓）基部的皮肤，暴露外耳道（EAM）的软骨。在下颌关节裂隙处识别三叉神经（下颌支，MDV）和耳大神经的分支，这些神经从颅骨穿出，穿过软骨基部，分别支配耳廓皮肤的凹面（前侧）和凸面（后侧）。
6. 在靠近颅骨处，识别两条神经分支从下颌与乳突之间的沟槽穿出的位置。轻轻将耳廓向外牵拉以充分暴露神经长度，并尽可能靠近颅骨处切断神经。
7. 使用弹簧剪将耳廓从头部取下，操作时注意避开已切断神经的远端残端，同时尽量减少带下的耳基部浓密毛囊组织。
8. 将耳廓转移至内衬柔性硅橡胶（PDMS）的培养皿中，皿内充满充气的 Liley's 溶液。在外耳道最狭窄（最靠前）的位置将其剪开，使耳廓展平，前侧皮肤（凹面）朝下，用约 6–8 枚间距均匀的极细昆虫针（直径约 0.2 mm）小心地在边缘固定于 PDMS 上。
9. 完全去除耳廓后侧的皮肤，并使用 #3 镊子进行钝性分离，部分去除耳廓软骨，注意保持前侧皮肤完整无损。
10. 用 #3 镊子夹住细小昆虫针的尖端，轻柔地延展从皮肤与 EAM 软骨之间向后穿出的 MDV 分支（通常为两条）。使用尽可能细的昆虫针将这些分支固定在 PDMS 上，针应刺入其断端附近相连的结缔组织，而非直接刺入神经干本身。
11. 清除神经周围大部分结缔组织，操作时小心避免因过度牵拉或切割造成损伤。

2. 电生理记录装置设置 

1. 使用细小的昆虫针将耳廓皮肤固定在记录室底部涂有PDMS的基底上，针应插在耳廓边缘周围（每只耳约6-8根），并将清理好的神经置于耳基部，靠近两个吸吮电极——其中一个为记录电极（用于采集神经信号），另一个为无关电极（为差分放大器提供中性信号，见⁷）。
2. 对于记录电极，需仔细匹配其开口孔径与内部直径，使其与两根神经的总厚度相适应，以确保神经尽可能紧密且尽可能长地嵌入电极内。
3. 通过连接在另一端的硅胶管，用2 ml 注射器施加轻柔的负压，将神经吸入电极中。确保神经呈直线状，无折叠或弯曲。
4. 通过施加更强的负压，将结缔组织或脂肪组织吸入电极，形成一个紧密封堵神经周围开口的塞子，从而建立高电阻/阻抗的连接。
5. 如有必要，通过负压将生理盐水注入另一个（无关）电极中（也可依靠毛细作用自然填充）。
6. 将相同的记录导线（银或铂）插入记录电极的内孔中，使其接触盐水和神经（记录端），或电极的缩窄并经火焰抛光的末端（无关端）。每个电极分别焊接到双芯屏蔽电缆的不同芯线上。将浴槽（接地）电极（Ag/AgCl小球）放入浴液中，并将其接地至连接记录电极的双芯电缆屏蔽层。
7. 将两个电极的电信号分别输入差分放大器的不同通道，经滤波（带通0.2–2 kHz）后在示波器屏幕上观察。检查通道A（记录）与通道B（无关）的电噪声水平是否相近。在此阶段，若尚未平衡两个电极，可能还无法在通道A中观察到正常的自发动作电位。
8. 通过增加记录电极（通道A）或无关电极（通道B）的阻抗，来校正两电极间背景噪声的差异。可通过进一步将疏松（脂肪）结缔组织吸入任一电极，和/或对50 ml 注射器施加更大的负压来实现。
   1. 以这种方式实现“平衡”后，切换回差分（A-B）记录模式，并在示波轨迹上或轻刷耳廓边缘毛发时寻找自发动作电位（APs）。若未见任何活动（放电），需重新检查神经在记录电极中的紧密程度以及无关电极中疏松结缔组织的密封情况——通常密封越紧密（电阻越高），两电极阻抗越接近，效果越好。经过练习，可达到良好的信噪比（>2:1）。
9. 通过连接计算机的实验室接口和电生理软件记录神经电信号图（electroneurogram）。放电的音频输出非常有用，可通过将神经电信号输入音频放大器及配套扬声器实现。调节阈值至略高于基线噪声水平（以无白噪声“嘶嘶”声为判断依据）。
10. 为增强药物或荧光苯乙烯染料对梭形末梢的通透性，小心剥离耳廓边缘附近的皮下脂肪层，打开一个约5 mm × 5 mm的窗口，暴露真皮层及毛囊基部（图1A、B）。
11. 将约1 mm宽、已清除脂肪的耳部皮肤折叠后用针固定在前缘（如适用，位于刚制备的窗口水平处），在相邻的皮肤层之间留出一个充满生理盐水的清晰间隙。用针或接地的精细镊子轻轻刷动沿折叠边缘伸出的毛发（避免接触皮肤），在示波器上定位动作电位输出最强的区域，并通过音频输出识别特征性的“咔哒”和“爆裂”声。

3. 记录刺激诱发的动作电位

1. 将机械刺激探针——一端为经火焰抛光的10 cm硼硅酸盐玻璃微电极，连接至陶瓷压电驱动器——放置于与皮肤皱褶平行的位置。探针尖端置于距皮肤皱褶约0.5–1 mm处，使其接触毛发但不接触皮肤。通过手动缓慢移动探针尖端以偏转毛发，观察并监听神经放电情况，以确认刺激有效。
2. 使用软件控制对1-3根毛发进行机械刺激例如 每10秒施加一次持续3秒、频率为5 Hz的正弦波刺激（探头位移200–500 µm），记录神经中由刺激诱发的反应。
3. 以10秒间隔给予数次相同的机械刺激序列。优化探针位置以确保可重复性，然后根据实验方案降低刺激频率。例如 将重复间隔从10秒降至30秒。
4. 使用软件区分类似动作电位的活动 例如 使用一个简单的阈值，该阈值设定为高频噪声振幅的约2倍以及最大动作电位的约25%。
5. 将跨过阈值的动作电位计数为“事件”，并量化所产生的动作电位的频率和特征。

4. 记录刺激诱发的放电活动并结合N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物标记

1. 为了检测苯乙烯染料对刺激诱发的传入神经放电及末梢标记的影响，将所选苯乙烯染料的适当浓度加入灌流液中，并继续进行电生理记录。
2. 经过所需的染料孵育时间（通常至少30分钟）后，准备标本以观察毛囊。移除固定针，展开皮肤瓣，暴露透明的真皮区域，以显示末梢标记情况。
3. 用不含染料的生理盐水冲洗去除外部残留染料，共更换三次生理盐水。
4. 在最后一次充氧的无染料生理盐水中孵育10–15分钟，使残留在暴露/外部膜上的染料尽可能渗出。
5. 使用螯合剂（磺丁基化β-环糊精，1 mM，5分钟）在生理盐水中去除仍停留在膜表面但未被内化的残留染料。
6. 将记录室转移至直立式落射荧光显微镜的载物台上，并将记录室与载物台/玻片移动装置连接固定。
7. 使用适合该苯乙烯染料的激发光照射标本。采用10X或25X荧光显微镜物镜观察毛囊的标记情况（图1）。

结果

去除皮下脂肪组织以暴露毛囊后的电生理记录装置如图1A所示。图1B以明场照明方式展示了该暴露区域的一部分，放大倍数更高。将耳廓边缘在此区域向上并向后折叠，可暴露表皮表面。这种操作使折叠边缘处的毛发呈水平方向伸出，为使用钝头探针进行机械刺激提供了理想条件（未显示）。图1C显示，在染料暴露后将耳缘恢复至未折叠状态时，该位置受到刺激的毛囊已被一种stilbene吡啶𬭩染料标记。制备样本的电神经图通常显示，即使在未施加玻璃纤维探针运动的情况下，仍存在持续的动作电位（AP）活动，包括最大幅度的动作电位（图2Ai-iii）。此类活动的发生频率约为每秒10–20次脉冲（“尖峰”轨迹），无明显节律结构或紧张性放电迹象，因为刺激间隔期间的自相关曲线相当平坦。在对毛干施加5 Hz、100 µm的机械刺激期间，总体输出通常上升至每秒20–50次脉冲，即每个正弦周期4–10次。构建周期直方图后可揭示反应的显著同步性（即所谓的“相位锁定”）（图2Bi-iii）。该现象具有良好的可重复性，但反应锁定的波形相位取决于其位置，即振动探针接触毛发时所处的运动时相。本分析采用简单的阈值检测方法（在A(i-iii)的神经图轨迹中以水平线表示）。然而，记录软件的功能通常可更精细地用于区分尖峰大小和形状的特征，从而根据这些特性分离特定传入纤维的反应，实现伪单单位记录分析。

图1：电生理记录装置及N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物对毛囊传入神经末梢的标记。（A）耳廓组织样本用于电生理实验的装置示意图，显示耳廓方向、神经位置、记录电极以及去除脂肪组织后暴露的毛囊神经支配区域。（B）在去除表层脂肪组织至真皮层的区域中，明场照明下可见多个毛囊。深色、通常呈双叶状的结构为皮脂腺。（C）B图方框区域的放大视图，显示通过机械刺激后，使用表层荧光显微镜成像观察到的、由苯乙烯染料N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物标记的两个梭形末梢。引自⁷，经许可使用。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：（A）从小鼠耳廓记录的刺激诱发神经活动。（Ai-iii）来自3个不同实验的示例，显示在标准Liley's生理盐水中记录的耳廓连续神经图。每条记录展示约开始记录5分钟后的一段5秒片段，其中包括对少量毛干施加3秒正弦位移的机械刺激。在整个持续记录期间（通常持续1-2小时），该机械刺激每30秒重复一次。自定义脚本文件标记了超过由水平光标设定阈值的单个事件（脉冲），以及每个正弦周期的起始点（周期）。（Aiv）用于正弦位移的指令信号。（B）刺激诱发脉冲活动的分析。（Bi-iii）根据神经图样本（Ai-iii）分别构建的3°分组的周期直方图，显示假定的梭形末梢对玻璃探针以5 Hz正弦位移机械刺激毛干所产生的反应。注意明显的相位锁定现象，其相位取决于末梢相对于机械探针起始位置的空间位置。（Biv）归一化的探针位移正弦波形；实际振幅约为100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在此，我们开发了一种相对简单的制备方法，该组织可快速分离，毛囊密度较低，且能够实现对少量毛囊的相对选择性机械刺激。该制备易于进行电生理记录和活细胞荧光成像，包括通过染料标记以可视化受机械刺激的毛囊，即对具有明确电生理反应的毛囊进行成像。i.e. 对具有明确电生理反应的毛囊进行成像。尽管我们尚未实施，但该体系似乎也易于将感觉神经进行分束，以实现单单位（单条感觉轴突）记录，并可通过靶向表达GFP以观察感觉末梢终末的形态。

我们采用耳部皮肤制备方法研究了荧光膜染料苯乙烯基吡啶鎓类染料的内化与释放特性⁷一种最初用于研究突触末梢局部囊泡膜再循环的技术⁸在突触中，成像技术也可轻松地与对已识别终末的同步电生理记录相结合^8,9正是在这些早期研究中，我们首次注意到染料也会被机械感受末梢内化¹⁰对于培养中的感觉神经元以及耳蜗毛细胞，吡啶斯蒂里尔染料的大部分标记似乎涉及染料分子通过机械感受通道，并随后阻断这些通道^11,12染料随后标记细胞内膜，且这种标记是不可逆的。然而，在未受到机械刺激的毛细胞中^13,14 以及在完全分化的初级感觉神经末梢中 原位例如肌梭中的Ia类末梢¹⁵以及此处的梭形末梢⁷，苯乙烯染料标记似乎反映了膜的内吞作用，因为标记是可逆的，且不阻断机械感觉反应^7,15,16尽管不能完全排除染料通过通道渗透进入这些末梢的可能性，但根据染料孵育期间持续的放电活动以及标记的可逆性，可以明确判断，在分化末梢中绝大多数的标记 原位 是通过回收囊泡膜的内化作用实现的。因此，这种简单技术可广泛用于对多种机械感受末梢功能进行电生理与光学的联合监测 离体 组织。

与大多数实验技术一样，重复操作和练习是确保可重复性的关键。接下来将描述一些需要特别注意的关键要点。在整个解剖和记录过程中，应持续用完全饱和95% O₂/5% CO₂的生理盐水灌流组织，以最大限度地维持组织的活性和存活。操作过程中需避免毛囊移位，以免刺激感觉末梢放电。可采用连续层流灌流系统，或使用细导管在距离标本较远的位置小心地向浴槽中通入混合气体，也可每20–30分钟小心更换一次溶液，但始终确保标本保持在盐水液面以下。记录用的吸吮电极可通过改造通常用于细胞内记录的硼硅酸盐玻璃微电极制成。首先，使用#3镊子小心折断尖端，使电极内径适合神经匹配，然后在本生灯火焰上进行短暂（<1秒）灼烧抛光处理（见2.4和2.5步骤）。为在记录时获得良好的信噪比，必须使两个电极的电学阻抗（电阻）均达到最大且彼此相等。为此，需注意以下针对两个电极的操作要点。对于记录电极，应确保其内径与神经紧密贴合，并尽可能将较长段的神经吸入电极内。尽量利用神经周围的结缔组织有效封闭电极尖端。或者，也可将一段适当大小、呈锥形的脂肪组织窄端与神经一同吸入电极。随后，通过连接在导管上的50 ml 注射器施加强负压约1分钟，以封闭电极尖端。若电极尖端密封良好，施加强负压只会增强封堵效果，而不会吸入更多液体或神经组织。为避免损伤神经，需确保结缔组织起到缓冲作用，防止神经受到周围材料及EAM软骨的压迫。无关电极的电阻/阻抗应尽可能与记录电极相匹配。可通过仔细灼烧抛光其尖端，使其孔径尽可能小但不完全封闭，以实现这一目标。若仍需增加电阻，可参照记录电极的方法，用脂肪结缔组织封堵无关电极的末端。

电陶瓷材料可在空间和时间上精确控制机械位移。然而，在制作电连接时需格外小心——高温会破坏连接，因此切勿使用热焊料。应使用金属填充的环氧胶，或采用供应商推荐的专用压接式插座，这既能牢固固定，又能实现良好的电连接。使用标准环氧树脂将玻璃刺激探针固定到电陶瓷上。对用于制作膜片钳或尖锐电极以进行电生理记录的标准10 cm × 1.5 mm直径硼硅酸盐玻璃毛细管的一端进行火焰抛光，以最大限度降低对组织造成损伤的风险。若需刺激单根毛囊，应将尖端通过火焰抛光处理至适配单根毛发，并将探针定位，使单根毛发位于开口孔径内，从而实现对单根毛发的精确控制。在使用苯乙烯类染料标记时，通常幼龄动物组织中的标记更为均匀。其具体原因尚不完全明确，但可能反映了幼龄组织所受机械损伤更小，且深层组织清除更为有效。在清除覆盖于毛囊基部、形似发泡聚苯乙烯 的泡沫状层时应彻底，但操作不可过于剧烈，以免损伤神经丛层及其相关的片状末梢。若毛囊运动未引发电反应或仅有微弱反应，且施加苯乙烯染料后主要标记的是皮脂腺（呈黄/白色），毛干基部出现明显自发荧光，而非片状末梢（呈橙/黄色），则表明过度清除已损伤 underlying 组织。最后，在成像前使用染料螯合剂可显著提高最终图像的对比度和图像质量。

该技术可适用于多种后续研究，例如通过将标本与针对候选通道的特异性药理配体共同孵育，或筛选这些通道被基因敲除的小鼠品系，来鉴定介导牵拉诱发反应的机械感受通道。后者还可结合荧光评估，分析基因操作小鼠品系中神经末梢形态发生的任何变化。 例如 表达与 Npy2r 相连的 GFP¹⁷最后一个例子可能是研究类似突触的囊泡（SLVs）的作用⁷ 通过检测SLV转换调节剂（Ca、Mg、α-黑寡妇蜘蛛毒素、谷氨酸受体配体）对牵张诱发反应以及对styryl染料摄取/释放的影响，研究这些柳叶形终末的功能。因此，这一新技术为机械感觉神经科学领域开辟了一系列潜在而富有意义的研究方向。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS - Sylgard 184	道康宁		柔韧、惰性、半透明的固体硅酮聚合物。
3号Dumont镊子	精细科学工具	11231-20
Austerlitz 昆虫针	Fine Science Tools	26002-10	使用极细的针将耳廓制备物牢固地固定在PDMS上，以尽量减少损伤。
交流差分前置放大器	Digitimer	神经学 NL104A	放大传入的传入性电神经图信号。差分记录可最大限度减少外部电噪声和基线漂移。
高通/低通滤波器	Digitimer	神经病学 NL125	信号调节，通过降低无关的电噪声以确保最佳的信噪比。
峰电位触发	Digitimer	Neurolog NL201	设置事件检测器阈值，并在示波器上显示，以反映动作电位检测的有效性。
音频放大器 &和演讲者	Digitimer	Neurolog NL120S	在显微镜下调整机械刺激装置时，通过音频监测感知感觉末梢电活动的存在情况
示波器	Digitimer	PM3380A	我们使用这种旧型号，但任何标准示波器均可满足需求。
压电陶瓷  晶圆	英国南安普顿 Morgan 电子陶瓷公司	PZT507	电生理学/计算机接口
压电陶瓷  电源	自制		0-200 V直流输出，用于驱动陶瓷晶片位移，通过记录/刺激软件和计算机接口可变电子控制输出。我们使用Spike2软件和1401micro计算机接口。
电生理学软件	剑桥电子设计（Cambridge Electronic Design，CED）	Spike2 v7	电生理记录、刺激与数据分析软件
实验室接口	剑桥电子设计（Cambridge Electronic Design，CED）	1401 微米	电生理学接口，位于放大器/滤波器与计算机之间。它输入神经电图信号，同时驱动电陶瓷运动。
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	一种可逆地分布于细胞膜外层的荧光膜探针，主要用于监测囊泡膜的内吞/外吐过程。
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	一种可螯合FM1-43的磺化β-环糊精衍生物& 其他苯乙烯基吡啶染料）从暴露的膜中洗脱，降低背景染色/荧光，从而使内化染料更清晰可见。
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Volocity 3D 图像分析软件	Perkin Elmer	Volocity 6.3	图像采集与分析软件