需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控

8.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53874

⸱

2016年6月3日

 ,  , 
1INSERM UMR-910, Faculté de Médecine, Université Aix-Marseille, 2Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center, Johannes Gutenberg University

本文内容

摘要

基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。

摘要

特定基因的转录是胚胎发育过程中决定细胞命运的关键生物学过程。该过程由转录因子介导，转录因子可结合基因组中的调控区域，包括心脏组成型基因的增强子和启动子。DNA缠绕在组蛋白上，而组蛋白会经历化学修饰。组蛋白的修饰进一步导致基因转录的抑制、激活或处于待命状态，从而在基因转录调控中引入另一层次的精细调节。胚胎干细胞（ES细胞）可在拟胚体（即细胞聚集体）或二维培养条件下重现心脏发育的早期阶段。原则上，这些细胞可提供足够的材料用于染色质免疫沉淀（ChIP）实验，该技术被广泛用于鉴定基因调控区域。此外，人胚胎干细胞为心脏发生研究提供了人类细胞模型。在发育的后期阶段，小鼠胚胎组织可用于研究决定细胞身份所需的特定表观遗传景观。本文中，我们描述了利用胚胎干细胞、拟胚体以及心脏特异性的胚胎区域进行染色质免疫沉淀、连续染色质免疫沉淀，随后进行PCR或ChIP测序的实验方案。这些方案可用于研究心脏基因转录的表观遗传调控机制。

引言

心脏是胚胎中第一个形成并开始发挥功能的器官。心脏由来自第一和第二胚胎心区的多种细胞谱系构建而成1。从受精后的囊胚阶段到心脏成形，胚胎细胞需要做出一系列的细胞命运决定。基因转录以时间和空间依赖的方式受到调控，是胚胎发育过程中细胞命运决定的关键生物学过程。这一过程由特定的转录因子介导，这些转录因子结合基因组内的调控区域，包括心脏组成型基因的增强子和启动子。DNA缠绕在组蛋白上，而组蛋白可发生乙酰化、甲基化、泛素化和/或磷酸化等修饰。组蛋白的修饰会导致基因转录的抑制、激活或处于待命状态，具体取决于组蛋白上哪一个赖氨酸残基被修饰2。

染色质免疫沉淀实验（ChIP）早在多年前就已建立3，目前是用于鉴定修饰组蛋白或转录因子靶标的最广泛应用的技术4。在对组蛋白或转录因子进行免疫沉淀后，其结合的DNA可通过聚合酶链式反应（PCR）扩增或进行测序。ChIP在技术上已取代了更具挑战性的凝胶阻滞实验5。然而，ChIP并不能证明转录因子与DNA之间的直接结合，而这一点正是凝胶阻滞实验的优势所在。另一方面，ChIP与DNA测序相结合，为基因调控研究提供了全新的全基因组视角。

胚胎干细胞（ES细胞）在拟胚体（i.e., 细胞聚集体）或二维培养条件下可重现心脏发育的早期步骤6，原则上可提供足够的材料用于染色质免疫沉淀（ChIP）。此外，人胚胎干细胞代表了一种人类心脏发育的细胞模型，尽管其成心肌潜能依赖于其表观遗传特征7。在发育的后期阶段，小鼠胚胎组织可用于研究细胞命运决定所需的特定表观遗传景观。然而，基因组的转录具有时间和细胞类型特异性8，因此基因转录的表观遗传调控必须在特定局部区域中进行研究。本文中，我们描述了利用胚胎干细胞、拟胚体以及心脏特异性的胚胎区域进行染色质免疫沉淀（ChIP）、连续染色质免疫沉淀（sequential ChIP）后接PCR或测序的实验方案。这些方案可用于研究心脏基因转录的表观遗传调控机制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. DNA-蛋白质交联

  1. 使用 PBS 中含 1% 甲醛的溶液（用于细胞）或渗透性 PB2 缓冲液中含 1% 甲醛的溶液（用于胚胎组织），在 15 ml 离心管中固定收集的 ES 细胞（常规 ChIP 使用 2 × 106 个细胞，microChIP 使用 2 × 105 个细胞）、由 ES 细胞生成的拟胚体（EBs）以及从 E9.5 小鼠胚胎中分离的心脏组织（房室管、流出道和心室）。将离心管置于摇床上，室温、60 rpm 振荡反应 10 分钟，精确计时。
  2. 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM 以终止交联反应，并在室温下于摇床上以 60 rpm 振荡孵育 5 分钟。

2. 细胞裂解与染色质片段化

  1. 将交联的细胞重悬于10 ml 1× PBS中，或胚胎组织重悬于1 ml PB2中，洗涤两次。在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。弃去上清液。
  2. 向缓冲液 PB1 或 PB2 中加入蛋白酶抑制剂（2 µg/ml 亮抑蛋白酶肽，1 µg/ml 抑肽酶，和 0.1 mM PMSF）表1将第2.1步中获得的细胞沉淀或胚胎组织分别用1 ml PB1或PB2缓冲液重悬。用移液器反复吹打以充分重悬细胞或组织。使用带21号针头的1 ml注射器匀浆细胞或组织。4 °C（置于摇床上）孵育10分钟。
  3. 在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  4. 将沉淀重悬于300 µl相应的SB缓冲液中（表1加入蛋白酶抑制剂，在洁净的无RNA酶、无DNA酶且无热原的离心管中孵育，以防止DNA降解。冰上孵育15至30分钟。
  5. 在 4 °C 下使用超声破碎仪对样品进行超声处理，以剪切染色质，超声程序参见下述列表 表2 根据后续应用调整每种材料的超声处理时间（即，PCR 或测序）。用于 PCR 的剪切后 DNA 片段大小应约为 500 bp，用于测序的应约为 300 bp。
  6. 在 4 °C 条件下，以 6,000 x g 离心超声处理的细胞裂解液 10 分钟，将上清液（染色质）转移至洁净的 1.5 ml 离心管中，弃去沉淀。
  7. 将染色质溶液（上清液缓冲液B）用纯水稀释10倍，取1.5 µl使用纳米分光光度计测定光密度。利用以下公式计算蛋白质浓度（µg/µl）：1.55 × OD 280 - 0.76 × OD260.
缓冲液用途成分适用材料
A透化PB1 : 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0.5 % NP40所有材料
PB2 : 15 mM HEPES pH 7.6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 60 mM KCl, 0.5% TRITON X-100胚胎组织
B裂解/超声SB1: 1 % SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8ESC
SB2: 50 mM HEPES-KOH pH 7.9 ; 140 mM NaCl; 1 mM  EDTA; 0.1% 脱氧胆酸钠; 0.1 % SDSEBs
SB3: 15 mM HEPES pH 7.6, 15 mM NaCl ; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA ; 1% TRITON-X100, 0 .1% SDS, 0.5% 月桂酰肌氨酸胚胎组织
CChIP 缓冲液150 mM NaCl ; 50 mM Tris-HCl pH 7.5 ; 5 mM EDTA ; 0.5 % NP40 ; 1% TRITON-X100所有材料
DDNA/蛋白洗脱D1 : 1 % SDS; 100 mM NaHCO3
D2: 50 mM Tris pH 7.6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
EDNA结合磁珠制备E : 20 % PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA

表1. 染色质免疫沉淀（ChIP）缓冲液。

材料超声处理程序
胚胎干细胞15 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭
类胚体30 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭
胚胎组织21 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭

表2. 超声处理程序。

3. 免疫沉淀与洗涤

  1. 用缓冲液 C 洗涤 Protein A 偶联磁珠 3 次。取 100 µl 磁珠加入洁净的 1.5 ml 离心管中，加入 1 ml 缓冲液 C（表 1）。将离心管置于磁力架上，静置 1 分钟后吸除上清液。重复此洗涤步骤两次。
  2. 在洁净的 1.5 ml 离心管中，将针对修饰组蛋白或转录因子的抗体（浓度见 表 3）与 20 µl 已洗涤的 Protein A 偶联磁珠混合，并加入 1 ml 含蛋白酶抑制剂的缓冲液 C。将样品置于旋转仪上，4 °C、40 rpm 条件下孵育至少 2 小时。
  3. 用 1 ml 缓冲液 C 洗涤抗体-磁珠复合物 3 次（操作方法见步骤 3.1）。
  4. 准备两个离心管，一个加入 150 µg 染色质和抗体-磁珠复合物，另一个加入 150 µg 染色质和 20 µl 已洗涤的磁珠；每管各加入 1 ml 含蛋白酶抑制剂的缓冲液 C，4 °C、40 rpm 条件下在旋转轮上孵育过夜。
    注意：染色质的浓度必须至少为 300 µg，方可用于转录因子的免疫沉淀或连续染色质免疫沉淀（sequential ChIP）。
标准 浓度 (ng/µl)体积 (µl)总DNA浓度 (ng)
A10.0110.0
B5.0015.00
C2.5012.50
D1.2511.25
E0.62510.625
F0.312510.3125
G0.15610.156
H0.010.0

表3. 标准品浓度。

4. DNA 洗脱、交联逆转与蛋白酶 K 消化

  1. 将样品置于磁力架上，收集含有未结合抗体的染色质上清液。
    注意：此步骤可将样品迅速在液氮中冷冻，并于 -80 °C 保存。染色质可用于使用其他抗体的其他免疫沉淀实验。每份样品用 1 ml 缓冲液 C 洗涤 3 次（操作方法如前所述）。
  2. 向洗涤后的 ChIP 材料中加入 150 µl 缓冲液 D1 或 D2（若需进行连续 ChIP，请参见表 1），并在加热块中于 50 °C 孵育 20 分钟，以洗脱抗体结合的蛋白质。
  3. 从加热块中取出离心管，将样品置于磁力架上，将上清液转移至新的 1.5 ml 离心管（经认证无 RNase、DNase 和热原）中，并弃去磁珠。
  4. 将上清液用于连续 ChIP 实验，加入 1 至 3 µg 的第二种抗体，并用两倍体积的缓冲液 C 稀释；或通过加入 5 M NaCl 使终浓度达到 200 mM，进行交联逆转。
  5. 在洁净的 1.5 ml 离心管（经认证无 RNase、DNase 和热原）中准备一份输入（input）染色质样品，取与 IP 样品相同量的染色质（150 µg），最终体积为 150 µl 的无 RNase 和 DNase 水。加入 5 M NaCl 至终浓度为 200 mM，并于 65 °C 孵育过夜。
  6. 次日，从加热块中取出样品，加入 EDTA 至终浓度为 12.5 mM，加入蛋白酶 K 至终浓度为 250 µg/ml，于 ChIP 样品中在加热块中 55 °C 消化 2 小时。

5. 使用DNA结合磁珠进行DNA提取

  1. 磁珠的准备
    1. 将磁珠置于室温下至少30分钟，充分涡旋混匀。磁珠易沉降，因此移液时需迅速操作。取1 ml磁珠转移至洁净的1.5 ml离心管中（经认证无RNase、DNase和无热原）。
    2. 置于磁力架上，静置2–3分钟使溶液澄清，弃去上清液。从磁力架上取下，加入1 ml 0.5 M EDTA，短暂涡旋混匀。
    3. 重复步骤5.1.2两次，最后弃去上清液。
    4. 从磁力架上取下，加入1 ml缓冲液E，缓慢重悬磁珠。将全部混合液（磁珠悬浮于缓冲液E中）转移至50 ml缓冲液E中。置于摇床上，室温下缓慢混合1小时。
    5. 按照下述纯化方案，使用三种实验条件测试DNA结合磁珠的效果：50 µl磁珠/50 µl DNA（1体积/1体积）、100 µl磁珠/50 µl DNA（2体积/1体积）以及125 µl磁珠/50 µl DNA（2.5体积/1体积）。将纯化后的DNA在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以检测片段大小（图1A）。
  2. DNA纯化
    1. 向每个DNA样品（约170 µl）中加入425 µl（2.5体积）DNA结合磁珠。通过反复吹打（约10次）缓慢重悬，并在室温下孵育10分钟。
    2. 置于磁力架上5分钟，吸除上清液并弃去（保持在磁力架上）。
    3. 在磁力架上的离心管中加入600 µl新鲜配制的80%乙醇，静置1分钟，吸除上清液并弃去，再重复此步骤一次。
    4. 短暂离心5秒（微量离心机），将离心管放回磁力架，去除最后残留的乙醇液滴。室温下干燥1分钟。
    5. 加入20 µl无DNase和RNase的水进行DNA洗脱。从磁力架上取下后涡旋混匀样品。
    6. 室温孵育3分钟，然后将样品置于磁力架上。将洗脱的DNA吸出并转移至新的离心管中（经认证无RNase、DNase和无热原）。
    7. 将输入样品中的DNA在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以检测DNA片段大小（图1B）。

6. 使用荧光检测仪器进行DNA定量

  1. 将1 μg DNA（1 kb ladder）用蒸馏水进行系列稀释，共制备7个稀释梯度，并设一个无DNA对照点（稀释梯度详见表3）。
  2. 配制足量的PCR Green I染料溶液，用于所有样品（纯化DNA及标准稀释液A-H）：将Green染料在1x TE缓冲液中稀释10,000倍。
  3. 在毛细管比色皿中，向10 µl 1x绿色染料混合液中各加入1 µl DNA样品（纯化DNA及标准稀释液A-H），于荧光计中在488 nm波长下检测。无DNA对照组中加入1 µl 1x TE缓冲液。
  4. 使用图形分析软件绘制标准曲线，并确定DNA样品在ng/µl范围内的相对浓度。此后DNA即可用于PCR扩增或构建测序文库。

7. PCR

  1. 引物选择
    1. 设计目标引物以检测感兴趣的基因组区域。利用 UCSC 基因组浏览器设计用于扩增基因增强子区域的引物。进一步结合 GEO 数据集中可用的 H3K4me1 或 p300 ChIP-seq9 数据来预测增强子区域。
  2. PCR
    1. 使用实时荧光定量 PCR 仪进行 PCR 反应，共 45 个循环（95 °C 8 秒，60 °C 8 秒，72 °C 8 秒），反应体系为 25 μl 含绿色染料的混合液，加入 2 ng DNA 和 0.5 μl 引物混合液（20 μM 储存液）10。
  3. 富集分析
    1. 假设最多有 1% 的核小体被免疫沉淀，据此计算绝对富集度11。
    2. 若 10 ng 免疫沉淀（IP）样品相较于 0.1 ng 输入 DNA 显示更高的富集，则认为该基因组区域存在富集。
    3. 将结果表示为：在对输入样本进行归一化并以非特异性对照样本校正后，相对于非富集区域的富集倍数。
    4. 将输入 DNA 的稀释倍数视为 100（稀释因子，DF）。
    5. 使用以下公式对输入样本进行归一化：2-ΔCt  × 100%，其中 -ΔCt = Ct[IP] - Ct[Input × DF]。
    6. 使用以下公式对对照进行校正：(ΔCt[IP] - ΔCt[NS])，其中 NS 为非特异性对照样本（无抗体 IP 或 IgG IP）。
    7. 样本的富集倍数计算为 2-ΔΔCt。提供一个包含所有计算步骤及公式的文件，仅需输入各 PCR 样本数据即可，有助于结果分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图1A 首先展示了DNA结合磁珠的制备过程，以及使用不同大小的DNA（1 kb DNA标记物）进行质量控制的结果。向一份体积的样品中分别加入1、2和2.5倍体积（1至3）的磁珠，以纯化高分子量和低分子量的DNA片段。

图1 B、C、D 分别为从小鼠ES细胞、类胚体或心脏胚胎区域（ pooled 25 E9.5心室）提取的全声处理DNA获得的DNA凝胶的典型示例。

当胚胎干细胞向心肌细胞命运分化时，会首先经历一个中胚层-内胚层中间状态，然后进入中胚层状态。这一发育过程包含上皮细胞必须经历上皮-间充质转化的步骤。

图2

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

表观遗传学已成为发育生物学研究中的一个重要领域。长期以来，发育生物学家一直关注一个核心问题：胚胎细胞中的遗传程序如何被激活，从而使细胞在胚胎谱系中获得特定的身份。

近年来，染色质免疫沉淀（ChIP）技术已得到广泛应用，并随着测序分辨率的提高而与DNA测序相结合。该技术已成为以全基因组范围研究细胞或特定胚胎及成体组织表观遗传景观的有力手段。ChIP实验所用的缓冲液和超声处理条件已得到显著优化，使得仅需少量生物样本即可完成实验。这包括通过显微解剖获得的胚胎心脏特定区域，或通过荧光分选细胞（FACS）分离出的表达荧光报告蛋白的细胞。事实上，在异质性细胞群体上进行ChIP实验1314可能导致结果难以解释甚至误导。表观遗传特征标记能够非常精确地反映细胞群体的身份，赋予其特定的分化潜能并决定其命运。因此，使用经过纯化（分选）的细胞群体或显微解剖获得的胚胎组织进行实验至关重要。

我们已在上文描述了为实现这些目标而建立的可靠方案。我们已将这些方案应用于ChIP-PCR、ChIP-on-ChIP

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢资助机构，包括IMI StemBANCC欧洲共同体项目、勒杜克基金会（SHAPEHEART）以及法国国家科研署（Genopath）

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
甲醛 SigmaF8775细胞固定 
甘氨酸SigmaG8898交联终止
抑肽酶Fluka10820蛋白酶抑制剂
亮抑蛋白酶肽半硫酸盐SigmaL2882蛋白酶抑制剂
PMSFSigmaP7626蛋白酶抑制剂
蛋白A磁珠 Life technologies10001D免疫沉淀
SPRI磁珠Thermo Scientific15002-01DNA纯化
蛋白酶KLife technologies25530-015蛋白质消化 
DNA BR标准品 Life technologiesQ32850校准范围 
SYBR GreenMolecular ProbesS-11484DNA定量
TE缓冲液 InvitrogenP7589DNA定量
PBX 1xLife technologies14190-094洗涤
无DNase和RNase的水Life technologies10977-035稀释
Axygen离心管AxygenMCT-175-CChIP纯化
抗体 公司货号ChIP使用浓度
H3K27acAbcamab4729ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg
H3K4me1DiagenodeC15410194 (pAb-194-050)ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg
H3K36me3DiagenodeC15410058 (pAb-058-050)ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg
H3K9me2DiagenodeC15410060 (pAb-060-050)ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg
H3K4me3DiagenodeC15410030 (pAb-030-050)ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg
H3K27me3DiagenodeC15410069 (pAb-069-050)ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg

参考文献

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749(2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

DNA A
胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。