基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。
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摘要
摘要
特定基因的转录是胚胎发育过程中决定细胞命运的关键生物学过程。该过程由转录因子介导，转录因子可结合基因组中的调控区域，包括心脏组成型基因的增强子和启动子。DNA缠绕在组蛋白上，而组蛋白会经历化学修饰。组蛋白的修饰进一步导致基因转录的抑制、激活或处于待命状态，从而在基因转录调控中引入另一层次的精细调节。胚胎干细胞（ES细胞）可在拟胚体（即细胞聚集体）或二维培养条件下重现心脏发育的早期阶段。原则上，这些细胞可提供足够的材料用于染色质免疫沉淀（ChIP）实验，该技术被广泛用于鉴定基因调控区域。此外，人胚胎干细胞为心脏发生研究提供了人类细胞模型。在发育的后期阶段，小鼠胚胎组织可用于研究决定细胞身份所需的特定表观遗传景观。本文中，我们描述了利用胚胎干细胞、拟胚体以及心脏特异性的胚胎区域进行染色质免疫沉淀、连续染色质免疫沉淀，随后进行PCR或ChIP测序的实验方案。这些方案可用于研究心脏基因转录的表观遗传调控机制。
引言
心脏是胚胎中第一个形成并开始发挥功能的器官。心脏由来自第一和第二胚胎心区的多种细胞谱系构建而成1。从受精后的囊胚阶段到心脏成形，胚胎细胞需要做出一系列的细胞命运决定。基因转录以时间和空间依赖的方式受到调控，是胚胎发育过程中细胞命运决定的关键生物学过程。这一过程由特定的转录因子介导，这些转录因子结合基因组内的调控区域，包括心脏组成型基因的增强子和启动子。DNA缠绕在组蛋白上，而组蛋白可发生乙酰化、甲基化、泛素化和/或磷酸化等修饰。组蛋白的修饰会导致基因转录的抑制、激活或处于待命状态，具体取决于组蛋白上哪一个赖氨酸残基被修饰2。
染色质免疫沉淀实验（ChIP）早在多年前就已建立3，目前是用于鉴定修饰组蛋白或转录因子靶标的最广泛应用的技术4。在对组蛋白或转录因子进行免疫沉淀后，其结合的DNA可通过聚合酶链式反应（PCR）扩增或进行测序。ChIP在技术上已取代了更具挑战性的凝胶阻滞实验5。然而，ChIP并不能证明转录因子与DNA之间的直接结合，而这一点正是凝胶阻滞实验的优势所在。另一方面，ChIP与DNA测序相结合，为基因调控研究提供了全新的全基因组视角。
胚胎干细胞（ES细胞）在拟胚体（i.e., 细胞聚集体）或二维培养条件下可重现心脏发育的早期步骤6，原则上可提供足够的材料用于....
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方案
1. DNA-蛋白质交联
- 使用 PBS 中含 1% 甲醛的溶液（用于细胞）或渗透性 PB2 缓冲液中含 1% 甲醛的溶液（用于胚胎组织），在 15 ml 离心管中固定收集的 ES 细胞（常规 ChIP 使用 2 × 106 个细胞，microChIP 使用 2 × 105 个细胞）、由 ES 细胞生成的拟胚体（EBs）以及从 E9.5 小鼠胚胎中分离的心脏组织（房室管、流出道和心室）。将离心管置于摇床上，室温、60 rpm 振荡反应 10 分钟，精确计时。
- 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM 以终止交联反应，并在室温下于摇床上以 60 rpm 振荡孵育 5 分钟。
2. 细胞裂解与染色质片段化
- 将交联的细胞重悬于10 ml 1× PBS中，或胚胎组织重悬于1 ml PB2中，洗涤两次。在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。弃去上清液。
- 向缓冲液 PB1 或 PB2 中加入蛋白酶抑制剂（2 µg/ml 亮抑蛋白酶肽，1 µg/ml 抑肽酶，和 0.1 mM PMSF）表1将第2.1步中获得的细胞沉淀或胚胎组织分别用1 ml PB1或PB2缓冲液重悬。用移液器反复吹打以充分重悬细胞或组织。使用带21号针头的1 ml注射器匀浆细胞或组织。4 °C（置于摇床上）孵育10分钟。
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结果
图1A 首先展示了DNA结合磁珠的制备过程，以及使用不同大小的DNA（1 kb DNA标记物）进行质量控制的结果。向一份体积的样品中分别加入1、2和2.5倍体积（1至3）的磁珠，以纯化高分子量和低分子量的DNA片段。
图1 B、C、D 分别为从小鼠ES细胞、类胚体或心脏胚胎区域（ pooled 25 E9.5心室）提取的全声处理DNA获得的DNA凝胶的典型示例。
当胚胎干细胞向心肌细胞命运分化时，会首先经历一个中胚层-内胚层中间状态，然后进入中胚层状态。这一发育过程包含上皮细胞必须经历上皮-间充质转化的步骤。
图2
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讨论
表观遗传学已成为发育生物学研究中的一个重要领域。长期以来，发育生物学家一直关注一个核心问题：胚胎细胞中的遗传程序如何被激活，从而使细胞在胚胎谱系中获得特定的身份。
近年来，染色质免疫沉淀（ChIP）技术已得到广泛应用，并随着测序分辨率的提高而与DNA测序相结合。该技术已成为以全基因组范围研究细胞或特定胚胎及成体组织表观遗传景观的有力手段。ChIP实验所用的缓冲液和超声处理条件已得到显著优化，使得仅需少量生物样本即可完成实验。这包括通过显微解剖获得的胚胎心脏特定区域，或通过荧光分选细胞（FACS）分离出的表达荧光报告蛋白的细胞。事实上，在异质性细胞群体上进行ChIP实验1314可能导致结果难以解释甚至误导。表观遗传特征标记能够非常精确地反映细胞群体的身份，赋予其特定的分化潜能并决定其命运。因此，使用经过纯化（分选）的细胞群体或显微解剖获得的胚胎组织进行实验至关重要。
我们已在上文描述了为实现这些目标而建立的可靠方案。我们已将这些方案应用于ChIP-PCR、ChIP-on-ChIP
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢资助机构，包括IMI StemBANCC欧洲共同体项目、勒杜克基金会（SHAPEHEART）以及法国国家科研署（Genopath）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲醛 | Sigma | F8775 | 细胞固定 |
| 甘氨酸 | Sigma | G8898 | 交联终止 |
| 抑肽酶 | Fluka | 10820 | 蛋白酶抑制剂 |
| 亮抑蛋白酶肽半硫酸盐 | Sigma | L2882 | 蛋白酶抑制剂 |
| PMSF | Sigma | P7626 | 蛋白酶抑制剂 |
| 蛋白A磁珠 | Life technologies | 10001D | 免疫沉淀 |
| SPRI磁珠 | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA纯化 |
| 蛋白酶K | Life technologies | 25530-015 | 蛋白质消化 |
| DNA BR标准品 | Life technologies | Q32850 | 校准范围 |
| SYBR Green | Molecular Probes | S-11484 | DNA定量 |
| TE缓冲液 | Invitrogen | P7589 | DNA定量 |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | 洗涤 |
| 无DNase和RNase的水 | Life technologies | 10977-035 | 稀释 |
| Axygen离心管 | Axygen | MCT-175-C | ChIP纯化 |
| 抗体 | 公司 | 货号 | ChIP使用浓度 |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | ESC和EBs中使用3 µg，组织中使用1 µg |
参考文献
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet.
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