方法文章

后生转换为安全和简单的方法来获得成人皮肤成纤维细胞胰岛素分泌细胞

DOI：

10.3791/53880

⸱

2016年3月18日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里，提出了一种允许将成人皮肤成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞的新方法。该技术基于表观遗传转化，不涉及使用逆转录病毒载体，也不涉及获得稳定的多能状态。因此，它在转化医学应用中非常有前途。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

再生医学需要将新的、功能齐全的细胞输送给患者，以修复退化或受损的组织。当这种细胞不容易获得时，可以使用不同的方法获得它们，其中包括重编程和反分化，具有不同技术特有的优点和局限性。这里描述了一种将成年成熟成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞的新策略，任意指定为表观遗传转化细胞 （EpiCC）。该方法是基于对控制细胞命运和分化的表观遗传调控机制的日益理解而开发的。特别是，第一步使用表观遗传修饰剂，即 5-氮杂胞苷，将成体细胞驱动到"高度允许"状态。然后，它利用这个短暂且可逆的表观遗传可塑性窗口，将细胞重新定位到不同的谱系。该方法被称为"表观遗传细胞转化"。这是获得高效、受控和稳定的细胞谱系间开关的一种简单而稳健的方法。由于该方案不涉及使用任何基因转染，不含病毒载体，不涉及稳定的多能状态，因此在转化医学应用中极具前景。

引言

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再生医学的一个基本目的是一种可用于修复或替换受损新，功能细胞的产生，退化的组织。重塑容易获得的成人细胞进入新的，通过从一种细胞类型转换到另一个，是一个特别有吸引力的方法，特别是当所需要的细胞群不丰富或难以进入。然而，成体细胞是相当稳定的。他们通过自己的选择逐渐限制获得他们分化 ​​状态，一旦他们达到成熟的终端专业化，他们稳定地保持它1。

在过去几年中的一些协议已被开发，即使重新编程到的体细胞（IPS）的多能性通过的一组转录因子2,3的强制表达来实现。另外，电池的转换可以通过直接的血统转获得，引进了4单或转录的组合因子5-7。这种策略不涉及通过去分化状态的转变，但需要高表达的特异性转录因子8。

最近，我们开发了一种基于成人细胞的短暂暴露于胞苷类似物的5-氮杂胞苷（5-氮杂CR）充分表征的DNA甲基转移酶抑制剂的去甲基化性质的转换协议。去甲基化步骤之后紧接着一个特定分化方案9-11，它允许以获得所需的终端的表型。这种方法能够成熟，分化的细胞转换成不同谱系的细胞，并具有相当大的优势，以避免同时使用病毒载体和任何外源性转录因子的转染。此次收购一个稳定的多能状态的，以及相关的易感性增加细胞的不稳定也是可以避免的。

具体协议，允许成人皮肤成纤维细胞转化为全功能胰岛素分泌细胞是这里提出。然而，值得注意的是，该技术已被应用到不同类型的细胞，并产生积极的结果，解决向各种分化途径的细胞时。此外，后生转化已经成功在人类和猪物种9-13以及在狗中使用（手稿提交），表明该方法的广泛有效性和鲁棒性。

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方案

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注意:下面描述的所有的程序必须在无菌条件下层流罩下进行。确保所有培养过程在其整个处理上恒温控制的阶段进行，并维持细胞在37℃。

1.皮肤成纤维细胞分离

  1. 准备培养皿涂料解决方案
    1. 将0.1g猪明胶的在100ml水中（最终浓度0.1％）。用消毒液高压灭菌。
    2. 加入1.5毫升无菌0.1％猪的明胶为35 mm的培养皿。等待2小时，大衣，保持它们在室温下。
      注意:人的皮肤活检通过在局部麻醉下切除从前臂的前方面的无血管区域收集并存储在在+ 4℃下补充有2％抗生素抗真菌溶液，使用前的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
  2. 洗涤切片用新的PBS补充有2％antibi耳真菌溶液。
  3. 在100毫米培养皿地方活检切成用无菌手术刀约2mm 3的片段。
  4. 除去涂布溶液过量之前立即镀片段。
  5. 放置5-6皮碎片进入预涂35毫米培养皿。
  6. 制备成纤维细胞的培养基:77％的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖，20％胎牛血清（FBS），1％L-谷氨酰胺溶液和2％抗生素抗真菌溶液。
  7. 在37℃下在5％CO 2在每个片段（通常为100微升每片段）和培养它们添加成纤维介质的液滴。
  8. 24小时后，加入500微升的成纤维细胞培养基中过度的片段以保持湿润，在37℃在5％CO 2。
  9. 改变用吸管至少每48小时的培养基。
  10. 孵化后第6天，小心地取出组织碎片和丢弃它们。
    注:6天之后，成纤维细胞先从生长出组织碎片，并开始以形成细胞单层。
  11. 刷新介质，加2 ml成纤维细胞的培养基，继续细胞单层培养在37℃下在5％CO 2培养箱中。

2，成纤维细胞培养

  1. 在37℃下培养的成纤维细胞在5％CO 2，直到80％汇合
  2. 用于传代，从组织培养皿抽吸成纤维细胞的培养基。洗涤细胞三次用4ml的PBS补充有1％抗生素 - 抗真菌溶液。
  3. 加的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.5克/升的猪胰蛋白酶和0.2g / L EDTA）的薄层（培养基体积的10％），在37℃下孵育直至单层细胞开始从组织的底部分离培养皿和细胞分离。
  4. 稀释细胞悬浮液以9份的成纤维细胞的培养基中和胰蛋白酶作用。离心是没有必要的。
  5. 板细胞在新的培养皿（用出明胶），在37℃，5％CO 2培养箱培养。保持1之间的通路比:2和1:4，这取决于生长速度。
  6. 当细胞达到约80％汇合，他们通过（通常每周两次）。

3.成纤维细胞为电镀表观遗传转化

  1. 添加0.26毫升/ 0.1％猪的明胶厘米2（在1.1的介绍准备），以细胞培养皿。等待2小时，外套。
  2. 除去之前电镀的成纤维细胞的涂布溶液过量10-30分钟。
  3. 从培养皿中取出成纤维细胞培养液中。洗涤细胞三次，用PBS补充有1％抗生素 - 抗真菌溶液。
  4. 加的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.5克/升的猪胰蛋白酶和0.2g / L EDTA）的薄层（培养基体积的10％），在37℃下孵育直至单层细胞开始从组织的底部分离培养皿和细胞分离。
  5. 稀释细胞悬液，用9份fibrobl的AST培养基中和胰蛋白酶作用。
  6. 算在室温下在显微镜下使用计数室的细胞。计算成纤维细胞培养基的所需体积重悬细胞，以得到7.8×10 4的成纤维细胞/ cm 2的细胞浓度。这将取决于所使用的特定类型的腔。
    细胞/μL=每小格×90（倍频系数）×稀释电池的平均数量
  7. 在150克，在室温下5分钟离心细胞悬浮液。除去上清，重悬细胞与成纤维细胞培养基的先前计算的体积。
  8. 板单元上0.1％明胶预涂覆菜肴和培养它们在37℃，5％CO 2培养箱24小时。

4.增加细胞可塑性使用德甲基化剂5-氮杂CR

  1. 0天
    1. 通过在10毫升的DMEM高糖中介溶解2.44毫克5-氮杂CR的制备5-氮杂CR原液嗯。通过过滤消毒。制备5-氮杂CR库存即将使用前。
    2. 稀释1微升5氮杂CR原液在1 ml成纤维细胞培养基中（终浓度1μM）的。
    3. 为了增加细胞的可塑性，细胞电镀（子目3.8）24小时后，从接种的成纤维细胞除去培养基，并在37℃，5％CO 2培养箱中添加1μM的5-氮杂CR原液并培养18小时。
  2. 1天
    1. 如表1中所述制备的新鲜人多能干（HP）平台。
    2. 用1μM-5-氮杂 - CR温育后，除去培养基并洗涤细胞三次，用PBS以确保5-氮杂CR被漂洗掉。
    3. 孵育-5-氮杂- CR处理的成纤维细胞用3小时（恢复期）中于37℃下在5％CO 2的HP介质。
    4. 恢复期后，除去培养基，用PBS洗涤三次。
    5. 为了监测5-氮杂CR处理的效率，为您在这个步骤f或形态变化的存在（在结果部分详细说明）。细胞失去成纤维细胞的典型的细长的形态，并获得一个圆形或椭圆形，成为尺寸小，与细胞核增大。
    6. 胰腺癌的分化继续。

5.胰腺分化协议

  1. 1-6天
    1. 如表2中所述制备胰腺癌基础培养基。
    2. 准备激活素原液:溶于5微克166.6微升无菌水激活素A的重组人蛋白。
    3. 培养-5-氮杂- CR在5％CO 2培养箱中处理的成纤维细胞0.26毫升/厘米胰腺癌基础培养基的2，补充有1微升/ ml激活素A原液（见5.1.2）6天，在37℃。改变中的日常。
  2. 7-8天
    1. 通过加入16.6毫升二甲基亚砜（DMSO）中的至50mg视黄ACI的制备视黄酸原液ð。
    2. 在胰腺癌基础培养基0.26毫升/厘米2培养细胞补充有1微升/毫升，在37℃激活素A原液（见5.1.2）和1μl/ ml的视黄酸储备溶液（见5.2.1）2天Ç在5％CO 2。改变中的日常。
  3. 9-36天
    1. 0.26毫升/厘米2胰腺癌基础培养基的培养细胞的补充有1％（体积/体积）胰岛素转铁硒（ITS），2％（V / V）B27和0.1％（体积/体积）重组人FGF基本（bFGF）的储备溶液（ 见表1）在37℃在5％CO 2培养箱中。每天改变介质的第15天。
    2. 从向前16天，刷新介质隔日，在显微镜下，由于形成聚集体细胞可以从培养皿的底部脱离。

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结果

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从皮肤活检原代培养的建立
皮肤切片切成小碎片，并放置在明胶预涂覆的菜肴。 6天后，成纤维细胞开始生长出组织碎片和形成的细胞单层（ 图1A）。细胞显示典型的细长的形状，正如预期的那样，显示的均匀免疫阳性的成纤维细胞特异性标记波形蛋白（Vim的， 图1B）。

形态学变化和甲基化皮肤成纤维细胞的图案之后18小时暴露于5-氮杂CR
以获得的成纤维细胞的一个成功的后生转化成胰岛素分泌细胞，我们使用脱甲基化剂，5-氮杂CR增加了它们的可塑性。人成纤维细胞以7.8×10 4的成纤维细胞/ cm 2的浓度接种于0.1％明胶预涂覆的菜肴。播种后二十四小时，将细胞瓦特ERE用1微米-5-氮杂 - CR 18小时温育。

在这个处...

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讨论

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本手稿描述了一种方法，其允许人皮肤成纤维细胞转化成产生胰岛素的细胞，通过瞬时和短暂暴露于5-氮杂CR，随后组织特异性诱导方案。这种方法允许中胚层内胚层到相关细胞的开关，无需转录因子或小分子RNA的强制表达，也不是收购一个稳定的多能状态中，使细胞更不稳定，容易出错14。

在第一步骤中，细胞可塑性增加由于在终末分化细胞诱导瞬态，可逆允许状态的合成后生改性剂。特别是，5-氮杂CR以便引起在皮肤成纤维细胞的全球甲基减少使用。 5-氮杂CR被称为直接抑制甲基转移酶活性，并防止从头甲基化在新合成的DNA。由于它的作用，这种分子以前已经用来激活沉默的基因，以及修改的真核细胞15,16的分化状态。与此相一致，张贴5-氮杂CR皮肤成纤维细胞表现出全球DNA去甲基化（ 图2A），表明以增加在用于本实验的细胞可塑性-5-氮杂-CR能力。这也是在与5-氮杂CR便于在神经球细胞（NSCs）17的高可塑性相关标记物Oct-4的表达的观察一致。然而，有趣的是要注意，交5-氮杂CR皮肤成纤维细胞恢...

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披露

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作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

致谢

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这项工作是由Carraresi基金会和欧洲基金会糖尿病研究学会（EFSD）的资助。 GP是由米兰大学的博士后奖学金支持。作者是成本行动FA1201 Epiconcept成员:表观遗传学和围孕期环境和COST行动BM1308共享大型动物模型的进步（SALAAM）。 TALB是COST行动CM1406后生化学生物学（EPICHEM）的成员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水SigmaD5652PBS;用于细胞洗涤和溶液制备
抗生素抗真菌溶液SigmaA5955成纤维细胞、HP 和胰腺培养基的成分
100 mm 培养皿Sarstedt83.3902用于成纤维细胞分离
猪明胶SigmaG1890用于培养皿包衣
水SigmaW3500用于溶液制备
35 mm 培养皿Sarstedt83.39用于成纤维细胞分离
DMEM、高葡萄糖、丙酮酸Life Technologies41966052用于成纤维细胞培养基
牛血清Life Technologies10500064FBS;成纤维细胞和 HP 培养基的组分
L-谷氨酰胺溶液SigmaG7513成纤维细胞、HP 和胰腺培养基的组
胰蛋白酶-EDTA 溶液SigmaT3924用于成纤维细胞解离
KOVA GLASSTIC 载玻片 10 带网格Hycor Biomedical87144细胞计数
5-氮杂胞苷SigmaA23855-氮杂-CR，用于增加酶细胞成纤维细胞中的可塑性
Ham's F-10 营养混合物Life Technologies31550031适用于 HP 培养基
DMEM、低葡萄糖、丙酮酸Life Technologies31885023适用于 HP 培养基
KnockOut 血清替代Life Technologies10828028HP 培养基的成分
MEM 非必需氨基酸溶液Life Technologies11140035HP 和胰腺基础培养基的成分
2-巯基乙醇SigmaM7522HP 和胰腺基础培养基的成分
鸟苷SigmaG6264HP 培养基的核苷混合储备成分
腺苷SigmaA4036HP 培养基的核苷混合储备成分
胞苷SigmaC4654HP 培养基的核苷混合储备成分
尿苷SigmaU3003HP 培养基的核苷混合储备成分
胸苷SigmaT1895HP 培养基的核苷混合储备成分
Millex-GS 0,22 µmMilliporeSLGS033SB用于
FGF-Basic （AA 1-155） 重组人蛋白Life TechnologiesPHG0261bFGF 溶液的灭菌;HP 和胰腺基础培养基
血清白蛋白SigmaA3311BSA 的成分;胰腺基础培养基的成分
DMEM/F-12Life Technologies11320074用于胰腺基础培养基
B-27 补充剂 不含维生素 ALife Technologies12587010培养基
的成分 N-2 补充剂Life Technologies17502048胰腺基础培养基的成分
激活素 A 重组人蛋白Life TechnologiesPHG9014用于胰腺培养基
视黄酸SigmaR2625用于胰腺培养基
二甲基亚砜SigmaD2650DMSO;用于 视黄酸原液制备
胰岛素-转铁蛋白-硒Life Technologies41400045ITS;用于胰腺最终培养基
抗波形蛋白抗体 Abcamab8069用于免疫细胞化学分析。工作稀释度 1：100
4′，6-二脒基-2-苯吲哚二盐酸盐Sigma32670DAPI。用于免疫细胞化学分析。工作稀释度 1 和微;g/ml
5-甲基胞苷EurogentecMMS-900P-B用于免疫细胞化学分析。工作稀释度 1：500
抗 C 肽抗体 Abcamab14181用于免疫细胞化学分析。工作稀释度 1：100
抗 PDX1 抗体 Abcamab47267用于免疫细胞化学分析。工作稀释度 1：500
Mercodia 胰岛素 ELISAMercodia10-1113-10用于胰岛素释放检测
胎分 牛的 胰腺

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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