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方法文章

表观遗传重编程作为从成体皮肤成纤维细胞获取胰岛素分泌细胞的一种安全简便方法

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DOI：

10.3791/53880

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2016年3月18日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

本文内容

摘要

本文介绍了一种可将成体皮肤成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞的新方法。该技术基于表观遗传重编程，无需使用逆转录病毒载体，也不需要获得稳定的多能性状态，因此在转化医学应用中具有广阔前景。

摘要

再生医学需要将新的、功能完整的细胞递送至患者体内，以修复退化或受损的组织。当这类细胞难以直接获取时，可通过多种方法获得，其中包括重编程和转分化，这些技术各有其优势与局限性。本文介绍一种将成年成熟成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞的新策略，该细胞被任意命名为表观遗传转化细胞（epigenetic converted cells, EpiCC）。该方法基于对调控细胞命运和分化的表观遗传机制的深入理解而开发。具体而言，第一步采用一种表观遗传修饰剂——5-aza-胞苷（5-aza-cytidine），诱导成年细胞进入“高度可塑”状态；随后利用这一短暂且可逆的表观遗传可塑性窗口，将细胞重新导向另一谱系。该策略被称为“表观遗传细胞转化”，是一种简单而稳健的方法，可实现高效、可控且稳定的细胞跨谱系转换。由于该方案不涉及任何基因转染，无需病毒载体，也不经过稳定的多能性状态，因此在转化医学应用中具有广阔前景。

引言

再生医学的一个基本目标是生成新的功能性细胞，用于修复或替换受损或退化的组织。通过将一种类型的细胞转化为另一种类型，将容易获取的成体细胞重编程为新细胞，是一种极具吸引力的方法，尤其是在所需细胞群体数量稀少或难以获取的情况下。然而，成体细胞具有极高的稳定性。它们通过逐步限制其分化潜能而获得特定的分化状态，一旦达到成熟的终末分化状态，便会稳定地维持这一状态1。

近年来，已开发出多种方案，可通过强制表达一组转录因子实现体细胞重编程为多能性细胞（iPS）2,3。此外，也可通过直接谱系转分化实现细胞转化，即导入单一4或多种转录因子的组合5-7。该策略不经过去分化状态的过渡，但需要特定转录因子的高表达8。

我们近期开发了一种转化方案，该方案基于将成体细胞短暂暴露于胞苷类似物5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza-CR）的去甲基化作用下，后者是一种特征明确的DNA甲基转移酶抑制剂。去甲基化步骤之后立即进行特定的分化方案9-11，从而获得所需的终末表型。该方法能够将成熟、已分化的细胞转化为不同谱系的细胞，并具有显著优势：无需使用病毒载体，也无需转染任何外源性转录因子。同时，该方法避免了获得稳定多能状态及其相关的细胞不稳定性风险。

本文介绍了将成人人类皮肤成纤维细胞转化为具有完全功能的胰岛素分泌细胞的详细方案。然而需要指出的是，该技术已应用于不同类型的细胞，并在引导细胞向多种分化途径转变时取得了积极成果。此外，表观遗传转化已在人类和猪物种中成功应用9-13，也在犬类中得到成功应用（论文已提交），表明该方法具有广泛的效力和稳健性。

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方案

注意：以下所有操作步骤必须在层流罩内的无菌条件下进行。确保所有培养操作均在恒温控制的载物台上进行，并在整个操作过程中将细胞维持在 37 °C。

1. 皮肤成纤维细胞的分离

  1. 准备培养皿包被液
    1. 将0.1 g猪源明胶溶解于100 ml水中（终浓度为0.1%），通过高压灭菌法对溶液进行灭菌。
    2. 向35 mm培养皿中加入1.5 ml无菌的0.1%猪源明胶溶液，室温下静置2小时以完成包被。
      注意：人皮肤活检组织通过局部麻醉下切除前臂前侧无血管区域的皮肤获取，并在使用前保存于添加了2%抗生素-抗真菌溶液的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于+4 °C环境中。
  2. 用新鲜的、添加了2%抗生素-抗真菌溶液的PBS洗涤活检组织。
  3. 将活检组织置于100 mm培养皿中，使用无菌手术刀将其切成约2 mm3大小的组织块。
  4. 在接种组织块前，立即去除包被液的多余部分。
  5. 将5–6个皮肤组织块放入预先包被的35 mm培养皿中。
  6. 配制成纤维细胞培养基：77%高糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、20%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺溶液和2%抗生素-抗真菌溶液。
  7. 在每个组织块上滴加一滴成纤维细胞培养基（通常每块100 µl），于37 °C、5% CO2条件下培养。
  8. 24小时后，在组织块上加入500 µl成纤维细胞培养基，保持湿润，继续在37 °C、5% CO2条件下培养。
  9. 使用移液器至少每48小时更换一次培养基。
  10. 培养6天后，小心移除并弃去组织块。
    注意：6天后，成纤维细胞开始从组织块中迁移出来，并逐渐形成单层细胞。
  11. 更换新鲜培养基，加入2 ml成纤维细胞培养基，继续在37 °C、5% CO2培养箱中进行单层细胞培养。

2. 成纤维细胞培养

  1. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养成纤维细胞，直至细胞融合度达到 80%
  2. 传代时，吸除组织培养皿中的成纤维细胞培养基，用 4 ml 含 1% 抗生素-抗真菌溶液的 PBS 洗涤细胞三次。
  3. 加入一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA 溶液（体积为培养基体积的 10%，含 0.5 g/L 猪胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA），于 37 °C 培养，直至细胞单层开始从组织培养皿底部脱离且细胞解离。
  4. 用 9 份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶活性。无需离心。
  5. 将细胞接种至新的培养皿中（无需明胶包被），在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。根据细胞生长速率，保持 1:2 至 1:4 的传代比例。
  6. 当细胞融合度达到约 80% 时进行传代（通常每周两次）。

3. 成纤维细胞接种用于表观遗传学转化

  1. 向细胞培养皿中加入 0.26 ml/cm2 的 0.1% 猪源明胶（按 1.1 中所述方法配制）。静置 2 小时进行包被。
  2. 在接种成纤维细胞前 10–30 分钟，移除多余的包被液。
  3. 从培养皿中移除成纤维细胞培养基，用含 1% 抗生素-抗真菌溶液的 PBS 洗涤细胞三次。
  4. 加入一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA 溶液（含 0.5 g/L 猪源胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA），体积为原培养基体积的 10%，于 37 °C 孵育，直至细胞单层开始从组织培养皿底部脱离且细胞发生解离。
  5. 用 9 份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶的活性。
  6. 在室温下使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。根据所需细胞浓度 7.8 × 104 个成纤维细胞/cm2，计算重悬细胞所需的成纤维细胞培养基体积。该体积取决于所使用的特定培养腔室类型。
    细胞/µl = 每个小方格平均细胞数 × 90（稀释倍数）× 稀释倍数
  7. 将细胞悬液在室温下以 150 g 离心 5 分钟。弃去上清液，并用先前计算好的体积的成纤维细胞培养基重悬细胞。
  8. 将细胞接种至预先用 0.1% 明胶包被的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时。

4. 使用去甲基化试剂 5-aza-CR 增强细胞可塑性

  1. 第0天
    1. 通过将2.44 mg的5-aza-CR溶解于10 ml高糖DMEM培养基中，制备5-aza-CR储备液。过滤除菌。使用前立即配制5-aza-CR储备液。
    2. 将1 µl的5-aza-CR储备液加入1 ml成纤维细胞培养基中稀释（终浓度为1 µM）。
    3. 为提高细胞可塑性，在细胞接种后24小时（见第3.8节），移除培养基，向接种的成纤维细胞中加入1 µM的5-aza-CR储备液，并在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养18小时。
  2. 第1天
    1. 按照表1所述方法新鲜配制人多能性（HP）培养基。
    2. 经1 µM 5-aza-CR处理后，移除培养基，并用PBS洗涤细胞三次，以确保完全去除5-aza-CR。
    3. 将经5-aza-CR处理的成纤维细胞在37 °C、5% CO2条件下，用HP培养基孵育3小时（恢复期）。
    4. 恢复期结束后，移除培养基，并用PBS洗涤三次。
    5. 为监测5-aza-CR处理效率，此步骤中应观察是否存在形态学变化（详见结果部分）。细胞将失去成纤维细胞典型的细长形态，转变为圆形或椭圆形，体积变小，细胞核增大。
    6. 继续进行胰腺定向分化。

5. 胰腺分化方案

  1. 第1-6天
    1. 按照表2所述配制胰腺基础培养基。
    2. 配制激活素A储存液：将5 µg激活素A重组人蛋白溶解于166.6 µl无菌水中。
    3. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用0.26 ml/cm2的胰腺基础培养基培养经5-氮杂-胞苷（5-aza-CR）处理的成纤维细胞，培养基中添加1 µl/ml激活素A储存液（见5.1.2），持续6天。每天更换培养基。
  2. 第7-8天
    1. 通过将16.6 ml二甲基亚砜（DMSO）加入50 mg全反式维甲酸中，配制维甲酸储存液。
    2. 在37 °C、5% CO2条件下，使用0.26 ml/cm2的胰腺基础培养基培养细胞，培养基中添加1 µl/ml激活素A储存液（见5.1.2）和1 µl/ml维甲酸储存液（见5.2.1），持续2天。每天更换培养基。
  3. 第9-36天
    1. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用0.26 ml/cm2的胰腺基础培养基培养细胞，培养基中添加1%（v/v）胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、2%（v/v）B27和0.1%（v/v）重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）储存液（见表1）。前15天每天更换培养基。
    2. 从第16天开始，每隔一天更换一次培养基，并在显微镜下观察，因为形成的细胞聚集体可能从培养皿底部脱落。

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结果

从皮肤活检样本建立原代培养
将皮肤活检样本切成小片段，并置于明胶预包被的培养皿中。6天后，成纤维细胞开始从组织片段中生长出来，并形成单层细胞（图1A）。细胞呈典型的细长形态，且如预期一样，对成纤维细胞特异性标志物波形蛋白（Vim，图1B）表现出一致的免疫阳性反应。

皮肤成纤维细胞经 5-aza-CR 处理 18 小时后的形态学变化及甲基化模式
为成功实现成纤维细胞向胰岛素分泌细胞的表观遗传转化，我们使用去甲基化试剂 5-aza-CR 来增强其可塑性。将人源成纤维细胞以 7.8 × 104 个成纤维细胞/cm2 的密度接种于预先涂有 0.1% 明胶的培养皿中。接种后 24 小时，细胞用 1 µm 的 5-aza-CR 孵育 18 小时。

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讨论

本文描述了一种将人类皮肤成纤维细胞转化为胰岛素生成细胞的方法，该方法通过短暂暴露于5-aza-CR，随后进行组织特异性诱导方案实现。该策略可实现从中胚层向内胚层相关细胞的转变，无需强制表达转录因子或微小RNA，也无需获得稳定的多能状态，从而避免了细胞稳定性降低及易出错的问题14。

第一步中，通过使用一种合成的表观遗传修饰剂，终末分化的细胞被诱导进入一种短暂且可逆的容许状态，从而提高了细胞可塑性。具体而言，使用了5-aza-CR以引起皮肤成纤维细胞全基因组甲基化的降低。已知5-aza-CR可直接抑制甲基转移酶活性，并阻止新合成DNA中的从头甲基化（de novo methylation）。由于这一作用，该分子此前已被用于重新激活沉默基因，以及改变真核细胞的分化状态15,16。与此一致的是，经5-aza-CR处理后的皮肤成纤维细胞显示出全基因组DNA去甲基化现象（图2A），表明5-aza-CR具备提高本实验所用细胞可塑性的能力。这一结果也与已有观察一致，即5-aza-CR可促进神经球细胞（N...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作由Carraresi基金会和欧洲糖尿病研究基金会（EFSD）资助。GP获得米兰大学博士后奖学金的支持。作者为COST行动FA1201 Epiconcept（表观遗传学与围受精期环境）和COST行动BM1308大型动物模型研究进展共享（SALAAM）的成员。TALB为COST行动CM1406表观遗传化学生物学（EPICHEM）的成员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜氏磷酸盐缓冲液SigmaD5652PBS；用于细胞洗涤和溶液配制
抗生素-抗真菌素溶液SigmaA5955成纤维细胞、HP 和胰腺培养基的组分
100 mm 培养皿Sarstedt83.3902用于成纤维细胞分离
猪明胶SigmaG1890用于培养皿包被
水SigmaW3500用于溶液配制
35 mm 培养皿Sarstedt83.39用于成纤维细胞分离
DMEM，高糖，含丙酮酸Life Technologies41966052用于成纤维细胞培养基
胎牛血清Life Technologies10500064FBS；成纤维细胞和 HP 培养基的组分
L-谷氨酰胺溶液SigmaG7513成纤维细胞、HP 和胰腺培养基的组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液SigmaT3924用于成纤维细胞解离
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDSHycor Biomedical87144细胞计数
5-氮杂胞苷SigmaA23855-aza-CR，用于提高成纤维细胞的可塑性
Ham's F-10 营养混合物Life Technologies31550031用于 HP 培养基
DMEM，低糖，含丙酮酸Life Technologies31885023用于 HP 培养基
KnockOut 血清替代物Life Technologies10828028HP 培养基的组分
MEM 非必需氨基酸溶液Life Technologies11140035HP 和胰腺基础培养基的组分
2-巯基乙醇SigmaM7522HP 和胰腺基础培养基的组分
鸟苷SigmaG6264HP 培养基核苷混合储备液组分
腺苷SigmaA4036HP 培养基核苷混合储备液组分
胞苷SigmaC4654HP 培养基核苷混合储备液组分
尿苷SigmaU3003HP 培养基核苷混合储备液组分
胸苷SigmaT1895HP 培养基核苷混合储备液组分
Millex-GS 0.22 µmMilliporeSLGS033SB用于溶液过滤除菌
FGF-Basic (AA 1-155) 重组人蛋白Life TechnologiesPHG0261bFGF；HP 和胰腺基础培养基的组分
牛血清白蛋白SigmaA3311BSA；胰腺基础培养基的组分
DMEM/F-12Life Technologies11320074用于胰腺基础培养基
B-27 补充剂（不含维生素 A）Life Technologies12587010胰腺培养基的组分
N-2 补充剂Life Technologies17502048胰腺基础培养基的组分
Activin A 重组人蛋白Life TechnologiesPHG9014用于胰腺培养基
视黄酸SigmaR2625用于胰腺培养基
二甲基亚砜SigmaD2650DMSO；用于视黄酸储备液配制
胰岛素-转铁蛋白-硒Life Technologies41400045ITS；用于胰腺终末培养基
抗波形蛋白抗体 Abcamab8069用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:100
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐Sigma32670DAPI；用于免疫细胞化学分析，工作稀释度  1 µg/ml
5-甲基胞苷EurogentecMMS-900P-B用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:500
抗C肽抗体 Abcamab14181用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:100
抗PDX1抗体 Abcamab47267用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:500
Mercodia 胰岛素 ELISA 试剂盒Mercodia10-1113-10用于胰岛素释放检测

参考文献

  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
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