小鼠肠道缺血-再灌注损伤模型

摘要

本文详细描述了小鼠肠道缺血-再灌注的实验操作步骤，该方法可产生可重复的损伤且不导致动物死亡，旨在促进该技术在研究领域内的标准化。此肠道缺血-再灌注损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞和分子机制。

摘要

肠缺血是一种危及生命的疾病，与多种临床状况相关，包括动脉粥样硬化、血栓形成、低血压、坏死性小肠结肠炎、肠移植、创伤和慢性炎症。肠缺血-再灌注（IR）损伤是急性肠系膜缺血的后果，由肠系膜血管血流不足引起，导致肠道损伤。缺血后的再灌注可能进一步加重肠道损伤。IR损伤的机制复杂且尚未完全阐明。因此，实验性小型动物模型对于理解IR损伤的病理生理机制以及开发新型治疗方法至关重要。

本文描述了一种小鼠急性肠道缺血-再灌注（IR）损伤模型，该模型可稳定地引起小肠损伤且不导致动物死亡。通过使用微血管夹暂时阻断肠系膜上动脉的末段及外周侧支循环60分钟，从而在回肠远端区域诱导缺血。损伤后进行1小时或2小时的再灌注，可通过组织学分析观察到稳定且可重复的肠道损伤。微血管夹放置位置的准确性对该操作至关重要。因此，视频片段提供了该技术详细的可视化分步说明。该肠道IR损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞与分子机制。

引言

肠道对血流中断极为敏感，这会导致缺血和上皮损伤。缺血后重新灌注可使组织重新获得氧气，但也可能进一步加重病理损伤。因此，肠道缺血-再灌注损伤与多种疾病相关，包括坏死性小肠结肠炎、小肠移植中的异体移植物排斥反应、腹主动脉瘤手术并发症、心肺旁路术以及炎症性肠病^1,2。肠道缺血-再灌注损伤，尤其是急性肠系膜缺血，是一种危及生命的状况，可导致严重的发病率和死亡率³。

尽管对肠道缺血-再灌注（IR）损伤的理解尚不充分，但认为其与肠道微生物群的变化以及活性氧物质、炎症性细胞因子和趋化因子的产生有关^1,4-6。这会导致先天性和适应性免疫机制的激活，从而促进炎症反应和组织损伤^1,7,8。

动物模型对于理解缺血-再灌注（IR）损伤的机制至关重要，因为它们便于进行基因的获得功能和缺失功能实验。目前已开发出多种IR动物模型，包括完全性血管阻断、低流量缺血以及节段性血管阻断（详见近期一篇综合性综述⁹）。由肠系膜上动脉（SMA）完全性血管阻断引起的肠道缺血，是在大型动物和啮齿类动物中常用且操作简便的IR模型^9-11。然而，肠道不同区域对损伤的易感性存在差异。此外，所使用的麻醉剂、镇痛剂、动脉阻断技术各不相同，且缺血损伤持续时间和恢复时间缺乏统一标准，导致不同研究中损伤程度不一，从而影响了人们对IR生物学机制的系统理解。表1总结了小鼠IR研究中的这些不一致性。采用较短缺血时间（30–45分钟）最大的局限在于，其恢复窗口难以观察到实验组与对照组之间的显著差异。上皮的轻度损伤可能在再灌注后1小时内即被修复，因此可能需要采用特异性的病理学指标才能检测到上皮重建的差异。相反，过长时间的缺血损伤（如100分钟）可能导致上皮完全剥脱，使上皮无法再生，从而增加死亡率并延长恢复时间。因此，本文详细描述了一种在小鼠中建立肠道IR的实验方法，该方法可产生可重复的损伤，且不导致动物死亡，旨在推动本领域内该技术的标准化。该肠道IR损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞与分子机制。

方案

动物实验按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经特鲁多研究所机构动物护理与使用委员会批准。研究使用8至12周龄的C57BL/6小鼠。

1. 手术准备

1. 准备并灭菌手术器械。
2. 准备基于异氟烷的麻醉系统，包括鼻罩和加热垫。确保加热垫未过热（<39 ºC）。
3. 确保异氟烷废气吸附罐放置正确，吸附罐底部的排气口不得被任何方式堵塞或遮挡。在操作前称量废气吸附罐重量，并将重量记录在罐体上。当吸附罐增重超过50 g（约12小时）时，应丢弃该吸附罐。

2. 麻醉

1. 将小鼠置于诱导室中，使用3%异氟烷（1 L/min O₂）进行麻醉。
   1. 通过小鼠无法保持直立、失去有目的的自主运动、角膜反射消失、肌肉松弛以及对反射刺激（如用力捏脚趾或尾巴）无反应来评估麻醉深度。
   2. 通过观察胸壁和腹部运动评估呼吸频率和呼吸模式。在理想麻醉状态下，呼吸频率应约为55–65次/分钟。
   3. 将小鼠从诱导室中取出，并迅速剃除其腹部毛发。
2. 为防止角膜干燥，将温和的眼科软膏涂抹于小鼠眼睛中。
3. 将小鼠放置于加热垫上，并通过鼻罩连接至麻醉系统。确保乳胶鼻罩紧密贴合小鼠头部，且异氟烷无泄漏。
4. 将异氟烷流量降低至1.5%，并皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg），以防止疼痛级联反应的增强。
5. 用浸有聚维酮碘外科溶液的无菌棉签擦拭手术区域皮肤，随后用70%乙醇擦拭。

3. 手术

1. 使用手术剪在腹部正中线处做一长度为3-5 cm的剖腹切口。用生理盐水浸湿的无菌不粘敷料覆盖手术区域。用生理盐水浸湿的棉签分离盲肠和回肠，并暴露肠系膜上动脉。
2. 为便于夹闭血管，使用精细虹膜剪在肠系膜上动脉周围的肠系膜上制造小切口。操作时，用敷料钳轻轻提起肠管，在预定夹闭位置两侧的肠系膜上动脉旁剪开（图1A）。然后在夹闭前，在预定夹闭部位滴加少量无菌生理盐水。
   注意：进行假手术时，请按手术步骤执行至3.2步，但不施加血管夹。相反，按照3.6步骤所述，持续滴加温热生理盐水以保持组织湿润，维持1小时。之后继续进行第4.1步。
3. 使用微血管夹（70 g力度）及施夹器夹闭肠系膜上动脉的一级分支，以形成一段位于盲肠附近的5-7 cm长的缺血性回肠区域（图1B）。尽管血管位置相对恒定，但小鼠之间可能存在轻微差异（见图1示例）。因此，通常需要使用2或3个血管夹（见图1A、D、E中黑色箭头所示夹子位置）。
   注意：使用高质量的血管夹。高压夹可能损伤血管并阻碍再生，而低压夹（<30 g）可能无法完全阻断血流。
4. 在血管上跨置两个微血管夹（40 g力度），以阻断肠道侧支血流 ，从而界定缺血肠段的范围（图1）。必须阻断侧支血管，以防止邻近血管供血（见图1A、D、E中绿色箭头所示夹子位置）。
5. 可选：滴加肝素溶液（6 USP单位/ml）以防止血液凝固。将0.5 ml肝素溶液逐滴加至分离出的肠段。
6. 用预热至37 °C的生理盐水浸湿无菌不粘敷料，轻轻覆盖于手术区域。确保敷料在整个操作过程中保持湿润。
7. 在整个过程中维持1-1.5%异氟烷麻醉，持续缺血60分钟。若缺血操作正确，缺血区域约30分钟后将变为酒红色。注意，夹闭远端的血管在缺血期间会扩张（图1右侧面板），表明夹闭成功。
8. 在缺血阶段密切监测小鼠状态。持续向覆盖手术区域的不粘敷料 滴加生理盐水。
9. 通过移液器在组织上滴加20 μl Gill's 3苏木精溶液标记缺血区域的边缘，以便后续从同一只小鼠中分别采集缺血组织及相邻健康组织进行比较（图1E右侧面板）。

4. 再灌注阶段

1. 缺血结束时，在夹闭区域滴加少量生理盐水，使用动脉夹施加器轻柔地移除微血管夹。然后用浸有生理盐水的棉签轻柔地将肠管推回腹腔内。移除非粘附性敷料，使用9 mm不锈钢伤口夹关闭腹壁和皮肤。若再灌注时间超过3小时，应在皮肤上使用伤口夹前，先用可吸收的薇乔缝线缝合腹壁。
2. 将小鼠置于加热的洁净笼中，根据实验设计维持所需的再灌注时间（30分钟、60分钟、120分钟或180分钟）。
3. 至少每30分钟检查一次动物，以确保其状态稳定。

5. 小肠的剖检与采集

1. 在再灌注后所需时间点，通过过量 CO₂ 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
2. 打开腹腔，收集缺血性肠组织用于进一步分析。同时采集损伤组织邻近的健康正常组织作为内部对照，以排除任何对损伤的全身性反应。
   注意：此对照比假手术对照小鼠更为合适，因为假手术小鼠不会经历缺血-再灌注（IR）损伤所引发的全身性反应。
3. 使用装有灌胃针头并充满生理盐水的 30 ml 注射器冲洗肠内容物，然后纵向切开肠道。若需获取肠道样本用于基因表达分析，可纵向切取一段 1.5 mm 的组织片段，其余部分用于组织学分析。
4. 进行组织学分析时，使用一对镊子将肠道卷成瑞士卷状（Swiss roll）。
5. 为保持卷曲形态，将肠道组织置于活检泡沫垫之间，并放入组织包埋盒中（图 2）。将包埋盒置于 10% 缓冲福尔马林溶液中。
6. 在福尔马林中固定组织至少 24 小时。随后更换为 70% 乙醇继续固定 24 小时。可在室温下长期保存于 70% 乙醇中。
7. 石蜡包埋，切片厚度为 5 µm，按照标准方案进行苏木精-伊红染色（图 3）。

6. 评分

1. 按照表2中总结的方法对小鼠缺血-再灌注损伤进行评分，并选择合适的评分方法。
2. 可选：将视野分为四个区域，因为损伤严重程度在不同区域存在差异。
3. 根据盲法获得的评分结果，计算每个区域的平均等级。
4. 使用Kruskal-Wallis检验比较不同病例组与对照组之间以及损伤组织与未损伤组织之间的等级，随后进行Dunn's多重比较检验。

结果

我们优化了小鼠回肠缺血-再灌注（IR）手术的实验方案，以获得可重复的IR诱导性损伤。本节展示了代表性结果。

图1展示了用于诱导回肠缺血的微血管夹位置示例。黑色箭头指示主夹闭夹的位置，用于阻断肠系膜上动脉一级分支。绿色箭头指示附加夹的位置，用于阻断来自侧支血管的血液供应。注意夹闭部位远端被阻断血管的尺寸增大，以及肠管缺血区域的颜色变化。在缺血结束时移除血管夹后，血管恢复血流并逐渐恢复至正常大小。

图2显示了一个组织盒的示例，其中包含从缺血1小时后又再灌注1小时的回肠对照区域和缺血区域制备的瑞士卷。包含一块脾组织以帮助在处理和染色过程中定位对照组和缺血-再灌注（IR）肠道组织。注意对照组织与缺血组织之间的颜色差异。

讨论

肠道缺血-再灌注损伤小鼠模型的建立极大地促进了对组织损伤机制的理解，并有助于开发潜在的治疗策略以最大限度地减少组织损伤^7,9,11,34。本方案的关键步骤包括微血管夹的准确定位、缺血时间的精确控制以及对缺血-再灌注损伤的正确组织学评估。

缺血持续时间对后续上皮损伤至关重要。通常，为在不引起实验小鼠发病或死亡的情况下诱导出可重复的缺血-再灌注（IR）损伤，需进行45-60分钟的缺血，随后进行2-3小时的再灌注。延长缺血时间可能导致上皮完全丧失并增加死亡率。例如，在空肠缺血的猪模型中，60分钟的阻塞导致绒毛上皮部分丧失，而120分钟的阻塞则导致绒毛上皮完全丧失³⁵。值得注意的是，无菌小鼠和基因修饰小鼠可能对IR损伤表现出更高的敏感性，因此在预实验中可能需要优化缺血和再灌注的最佳时间。尽管通常在再灌注后2-3小时评估组织损伤，但分析肠道干细胞动员则需要更长时间（12小时）³⁶。此外，共生微生物群的变化以及TLR/Nod介导的信号通路可显著影响IR损伤的结果^4,8,37-39。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	Sunbeam	E12107-819	替代产品：Braintree Scientific 加热垫
台式科研麻醉机	Vasco	UCAP 0001-0000171	替代产品：Parkland Scientific，V3000PS
鼻罩	Parkland Scientific	ARES500
废气吸收罐及替换滤芯	Parkland Scientific	80000, 80120
诱导室	Surgivet	V711802
异氟烷	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	管制药品，请联系 IACUC
动物毛发剪	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
眼科软膏	Webster	8804604
布托啡诺	McKesson	562766	管制药品，请联系 IACUC
Ketaset（盐酸氯胺酮）	Pfizer	NADA 45-290	管制药品，请联系 IACUC
棉签	Puritan Medical Products	806-WC	使用前需高压灭菌
贝塔碘	Purdue Products	67618-150-17	10% 聚维酮碘
无菌生理盐水溶液	Aspen	46066-807-60	使用前调节至室温
红外线啮齿类动物体温计	BIOSEB	BIO-IRB153
微血管夹，70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	替代产品：WPI 14121，用于 SMA 阻断
微血管夹，40 g	Roboz Surgical	RS6472	替代产品：WPI 14120，用于侧支血管阻断
血管夹施加钳	World Precision Instruments	14189	替代产品：Roboz #RS-5410 或  #RS-5440
Gill's 3 苏木精染液	Thermo Scientific	14-390-17
外科缝合钉，Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
自动缝合钉施用器	Beckton Dickinson	427630
活检泡沫垫	Simport	M476-1
组织包埋盒	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II 组合盖与底座
10% 缓冲福尔马林	Fisher Scientific	245-684
眼科虹膜剪	World Precision Instruments	501263-G SC	替代产品：Roboz RS6816
手术剪	World Precision Instruments	501219-G	替代产品：Roboz RS6814
敷料钳	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	替代产品：World Precision Instruments 1519-G
肝素，无内毒素，300 USP 单位/瓶，50 mg	Sigma	2106
Reflex 伤口缝合钉拆除钳	Roboz Surgical	RS-9263	替代产品：World Precision Instruments：500347
小鼠 C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa 非粘连敷料，3 x 4，无菌	Coviden	1050
Fisherbrand 移液管	Fischer Scientific	13-711-5AM	使用移液管逐滴加入生理盐水