小鼠肠道缺血-再灌注损伤模型

摘要

本文详细描述了小鼠肠道缺血-再灌注的实验操作步骤，该方法可产生可重复的损伤且不导致动物死亡，旨在促进该技术在研究领域内的标准化。此肠道缺血-再灌注损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞和分子机制。

摘要

肠缺血是一种危及生命的疾病，与多种临床状况相关，包括动脉粥样硬化、血栓形成、低血压、坏死性小肠结肠炎、肠移植、创伤和慢性炎症。肠缺血-再灌注（IR）损伤是急性肠系膜缺血的后果，由肠系膜血管血流不足引起，导致肠道损伤。缺血后的再灌注可能进一步加重肠道损伤。IR损伤的机制复杂且尚未完全阐明。因此，实验性小型动物模型对于理解IR损伤的病理生理机制以及开发新型治疗方法至关重要。

本文描述了一种小鼠急性肠道缺血-再灌注（IR）损伤模型，该模型可稳定地引起小肠损伤且不导致动物死亡。通过使用微血管夹暂时阻断肠系膜上动脉的末段及外周侧支循环60分钟，从而在回肠远端区域诱导缺血。损伤后进行1小时或2小时的再灌注，可通过组织学分析观察到稳定且可重复的肠道损伤。微血管夹放置位置的准确性对该操作至关重要。因此，视频片段提供了该技术详细的可视化分步说明。该肠道IR损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞与分子机制。

引言

肠道对血流中断极为敏感，这会导致缺血和上皮损伤。缺血后重新灌注可使组织重新获得氧气，但也可能进一步加重病理损伤。因此，肠道缺血-再灌注损伤与多种疾病相关，包括坏死性小肠结肠炎、小肠移植中的异体移植物排斥反应、腹主动脉瘤手术并发症、心肺旁路术以及炎症性肠病^1,2。肠道缺血-再灌注损伤，尤其是急性肠系膜缺血，是一种危及生命的状况，可导致严重的发病率和死亡率³。

尽管对肠道缺血-再灌注（IR）损伤的理解尚不充分，但认为其与肠道微生物群的变化以及活性氧物质、炎症性细胞因子和趋化因子的产生有关^1,4-6。这会导致先天性和适应性免疫机制的激活，从而促进炎症反应和组织损伤^1,7,8。

动物模型对于理解缺血-再灌注（IR）损伤的机制至关重要，因为它们便于进行基因的获得功能和缺失功能实验。目前已开发出多种IR动物模型，包括完全性血管阻断、低流量缺血以及节段性血管阻断（详见近期一篇综合性综述⁹）。由肠系膜上动脉（SMA）完全性血管阻断引起的肠道缺血，是在大型动物和啮齿类动物中常用且操作简便的IR模型^9-11。然而，肠道不同区域对损伤的易感性存在差异。此外，所使用的麻醉剂、镇痛剂、动脉阻断技术各不相同，且缺血损伤持续时间和恢复时间缺乏统一标准，导致不同研究中损伤程度不一，从而影响了人们对IR生物学机制的系统理解。....

方案

动物实验按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经特鲁多研究所机构动物护理与使用委员会批准。研究使用8至12周龄的C57BL/6小鼠。

1. 手术准备

1. 准备并灭菌手术器械。
2. 准备基于异氟烷的麻醉系统，包括鼻罩和加热垫。确保加热垫未过热（<39 ºC）。
3. 确保异氟烷废气吸附罐放置正确，吸附罐底部的排气口不得被任何方式堵塞或遮挡。在操作前称量废气吸附罐重量，并将重量记录在罐体上。当吸附罐增重超过50 g（约12小时）时，应丢弃该吸附罐。

2. 麻醉

1. 将小鼠置于诱导室中，使用3%异氟烷（1 L/min O₂）进行麻醉。
   1. 通过小鼠无法保持直立、失去有目的的自主运动、角膜反射消失、肌肉松弛以及对反射刺激（如用力捏脚趾或尾巴）无反应来评估麻醉深度。
   2. 通过观察胸壁和腹部运动评估呼吸频率和呼吸模式。在理想麻醉状态下，呼吸频率应约为55–65次/分钟。
   3. 将小鼠从诱导室中取出，并迅速剃除其腹部毛发。
2. 为防止角膜干燥，将温和的眼科软膏涂抹于小鼠眼睛中。
3. 将小鼠放置于加热垫上，并通过鼻罩连接至麻醉系统。确保乳胶鼻罩紧密贴合小鼠头部，且异氟烷无泄漏。
4. 将异氟烷流量降低....

结果

我们优化了小鼠回肠缺血-再灌注（IR）手术的实验方案，以获得可重复的IR诱导性损伤。本节展示了代表性结果。

图1展示了用于诱导回肠缺血的微血管夹位置示例。黑色箭头指示主夹闭夹的位置，用于阻断肠系膜上动脉一级分支。绿色箭头指示附加夹的位置，用于阻断来自侧支血管的血液供应。注意夹闭部位远端被阻断血管的尺寸增大，以及肠管缺血区域的颜色变化。在缺血结束时移除血管夹后，血管恢复血流并逐渐恢复至正常大小。

图2显示了一个组织盒的示例，其中包含从缺血1小时后又再灌注1小时的回肠对照区域和缺血区域制备的瑞士卷。包含一块脾组织以帮助在处理和染色过程中定位对照组和缺血-再灌注（IR）肠道组织。注意对照组织与缺血组织之间的颜色差异。

讨论

肠道缺血-再灌注损伤小鼠模型的建立极大地促进了对组织损伤机制的理解，并有助于开发潜在的治疗策略以最大限度地减少组织损伤^7,9,11,34。本方案的关键步骤包括微血管夹的准确定位、缺血时间的精确控制以及对缺血-再灌注损伤的正确组织学评估。

缺血持续时间对后续上皮损伤至关重要。通常，为在不引起实验小鼠发病或死亡的情况下诱导出可重复的缺血-再灌注（IR）损伤，需进行45-60分钟的缺血，随后进行2-3小时的再灌注。延长缺血时间可能导致上皮完全丧失并增加死亡率。例如，在空肠缺血的猪模型中，60分钟的阻塞导致绒毛上皮部分丧失，而120分钟的阻塞则导致绒毛上皮完全丧失³⁵。值得注意的是，无菌小鼠和基因修饰小鼠可能对IR损伤表现出更高的敏感性，因此在预实验中可能需要优化缺血和再灌注的最佳时间。尽管通常在再灌注后2-3小时评估组织损伤，但分析肠道干细胞动员则需要更长时间（12小时）³⁶。此外，共生微生物群的变化以及TLR/Nod介导的信号通路可显著影响IR损伤的结果^4,8,37-39。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	Sunbeam	E12107-819	替代产品：Braintree Scientific 加热垫
台式科研麻醉机	Vasco	UCAP 0001-0000171	替代产品：Parkland Scientific，V3000PS
鼻罩	Parkland Scientific	ARES500
废气吸收罐及替换滤芯	Parkland Scientific	80000, 80120
诱导室	Surgivet	V711802
异氟烷	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	管制药品，请联系 IACUC
动物毛发剪	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
眼科软膏	Webster	8804604
布托啡诺	McKesson	562766	管制药品，请联系 IACUC
Ketaset（盐酸氯胺酮）	Pfizer	NADA 45-290	管制药品，请联系 IACUC
棉签	Puritan Medical Products	806-WC	使用前需高压灭菌
贝塔碘	Purdue Products	67618-150-17	10% 聚维酮碘
无菌生理盐水溶液	Aspen	46066-807-60	使用前调节至室温
红外线啮齿类动物体温计	BIOSEB	BIO-IRB153
微血管夹，70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	替代产品：WPI 14121，用于 SMA 阻断
微血管夹，40 g	Roboz Surgical	RS6472	替代产品：WPI 14120，用于侧支血管阻断
血管夹施加钳	World Precision Instruments	14189	替代产品：Roboz #RS-5410 或  #RS-5440
Gill's 3 苏木精染液	Thermo Scientific	14-390-17
外科缝合钉，Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
自动缝合钉施用器	Beckton Dickinson	427630
活检泡沫垫	Simport	M476-1
组织包埋盒	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II 组合盖与底座
10% 缓冲福尔马林	Fisher Scientific	245-684
眼科虹膜剪	World Precision Instruments	501263-G SC	替代产品：Roboz RS6816
手术剪	World Precision Instruments	501219-G	替代产品：Roboz RS6814
敷料钳	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	替代产品：World Precision Instruments 1519-G
肝素，无内毒素，300 USP 单位/瓶，50 mg	Sigma	2106
Reflex 伤口缝合钉拆除钳	Roboz Surgical	RS-9263	替代产品：World Precision Instruments：500347
小鼠 C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa 非粘连敷料，3 x 4，无菌	Coviden	1050
Fisherbrand 移液管	Fischer Scientific	13-711-5AM	使用移液管逐滴加入生理盐水