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豌豆蚜胚胎免疫染色关键条件的确定：提高组织通透性与降低背景染色

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DOI：

10.3791/53883

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2016年2月2日

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

本文内容

摘要

本文介绍了一种针对蚜虫胚胎的整体免疫染色实验方案，重点阐述了降低背景染色和增强组织通透性的关键条件。这些条件专门针对蚜虫胚胎组织中蛋白质表达的有效检测而优化。

摘要

豌豆蚜虫 Acyrthosiphon pisum，具有已测序的基因组和丰富的表型可塑性，已成为基因组学和发育研究的新兴模式生物。与其他蚜虫一样 A. 豌豆（pisum） 通过孤雌胎生繁殖快速增殖，其中胚胎在卵巢管内的卵室中以流水线方式发育。此前，我们已建立了一套稳定的全装片 原位 杂交以检测蚜虫胚胎中的mRNA表达。然而，在分析蛋白质表达时，已建立的用于孤雌胎生蚜虫卵巢管免疫染色的方案未能产生满意的结果。本文报道了为提高组织通透性并降低背景染色而优化的实验条件，这两者在应用传统方法时均存在问题。优化措施包括：（1）蛋白酶K孵育（1 µg/ml，10分钟），该步骤被证实对中晚期蚜虫胚胎中抗体的渗透至关重要；（2）以地高辛（DIG）标记缓冲系统配套提供的封闭试剂替代常规的山羊血清/牛血清白蛋白；（3）使用甲醇而非过氧化氢（H₂O₂）进行处理。2O2用于灭活内源性过氧化物酶，可显著降低蚜虫组织中的背景染色。这些针对免疫染色优化的关键条件将有助于有效检测蚜虫胚胎中的基因表达产物 A. 豌豆（Pisum） 以及其他蚜虫。

引言

蚜虫是半翅目昆虫，体型较小（1-10 mm），身体柔软。它们利用刺吸式口器刺入植物韧皮部吸取汁液为食。此外，蚜虫依赖一种专性胞内共生细菌Buchnera aphidicola来合成其韧皮部汁液食谱中缺乏的必需氨基酸。蚜虫具有复杂的生活史：在春季和夏季长日照条件下进行孤雌生殖的胎生繁殖；而在短日照条件下则转为有性卵生繁殖，并产下少量越冬卵1,2。次年春季，这些卵孵化产生全为雌性的第一代蚜虫（干母），随后经历多轮孤雌生殖直至秋季。蚜虫的这种周期性孤雌生殖——即在年生活周期中交替进行无性与有性繁殖阶段——被认为是进化上的新颖特征1,2。在孤雌胎生的蚜虫中，胚胎发育发生在卵巢小管（卵巢管）的卵室中；而有性卵生的胚胎则在受精卵中发育。除了繁殖方式的可塑性外，蚜虫还能表现出跨代翅型多型现象：当感受到种群密度过高或捕食者威胁时，无翅的孤雌雌虫可通过胎生方式产生具翅后代，以实现远距离迁飞。豌蚜Acyrthosiphon pisum基因组序列的发表——这是首个基础不完全变态昆虫的基因组序列——使得研究人员能够在分子水平上进一步探究蚜虫的繁殖可塑性、翅型多型现象，以及其他特性，如昆虫与植物的相互作用、病毒传播以及共生关系3。

除了基因组测序之外，要推动豌豆蚜成为成熟的模式生物，还需具备用于研究基因表达与功能的工具4。我们已描述了用于检测蚜虫胚胎中mRNA表达的完整胚胎原位杂交（whole-mount in situ hybridization）的可靠实验方案5-7。通过注射或饲喂双链RNA进行RNA干扰（RNA interference, RNAi）已被用于蚜虫若虫和成虫的基因沉默，但目前尚未见在胚胎中实现稳定基因敲低的条件报道8-10。免疫染色法是一种基于抗体的技术，可用于在RNAi敲低前后检测样品中蛋白质的表达水平，该方法已在豌豆蚜胚胎中成功应用11-13。然而，采用标准免疫染色流程处理豌豆蚜无性胎生胚胎时，组织通透性的提高以及背景染色的消除仍不理想。例如，我们发现抗体在原肠胚形成期胚胎（8–10期）中的组织穿透能力下降，而在具有形态上可识别肢芽的胚胎（13–14期）中，抗体几乎无法穿透。此外，在使用针对生殖系标记蛋白Vasa以及在胚胎体节中表达的Engrailed/Invected蛋白的抗体对无性胎生豌豆蚜胚胎进行染色时，均观察到明显的背景染色现象12,13。实际上，仅使用二抗染色的胚胎中仍能清晰观察到背景信号。

为了在不破坏蚜虫组织完整性的前提下提高通透性，我们仔细滴定了蛋白酶K的浓度，并确定了蚜虫胚胎组织消化的最佳条件。为了避免豌豆蚜中出现非特异性染色，我们筛选了能够有效封闭胚胎并抑制内源性过氧化物酶（POD）活性的化合物，该酶在免疫染色过程中用于信号放大。使用地高辛（DIG）标记缓冲液套装提供的封闭试剂，比传统使用的正常山羊血清（NGS）/牛血清白蛋白（BSA）显著降低了背景染色。此外，发现甲醇抑制内源性POD活性的效果优于过氧化氢（H2O2）。有关这些针对蚜虫胚胎免疫染色的特异性条件的详细信息将在后续章节中描述。

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方案

1. 蚜虫培养

注意：孤雌生殖胎生型豌豆蚜 A. pisum 的实验室品系最初采自中国台湾中部，已在长日照条件下于寄主植物（豌豆 Pisum sativum 或蚕豆 Vicia faba）上连续饲养超过 300 代（每代约 10 天）。

  1. 种子萌发      
    1. 将寄主植物的种子在室温下用自来水浸泡3-5天，每天更换一次新鲜水。
      注：也可将寄主植物种子直接放入湿润土壤中以诱导萌发。
    2. 将10粒正在萌发的种子种植于小花盆（直径9 cm，高7 cm）中的土壤内，在培养室中按16小时光照/8小时黑暗的光周期、20 °C条件下培养。
    3. 开始生长约10天后，将蚜虫转移到高度超过8 cm的植株上。  
  2. 蚜虫转移
    1. 将每盆植物置于1 L的玻璃烧杯内，用毛笔将8只成年蚜虫转移至植株上，然后用透气性覆盖物（如纱布网）密封烧杯，防止蚜虫逃逸。
    2. 在培养室中按16小时光照/8小时黑暗的光周期、20 °C条件下培养蚜虫，每天为每盆植物浇水一次。
    3. 为获得下一代蚜虫，在初次转移蚜虫十天后重复步骤1.1.3-1.2.2。

2. 卵巢的解剖与固定

  1. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）新鲜配制4%多聚甲醛（PFA），作为固定液。
  2. 取一个点样板的孔，加入PFA（约500 µl），将样板置于体视显微镜下低倍镜观察，将一只成年蚜虫浸入PFA中进行解剖。
  3. 用一对镊子夹住蚜虫的头部和腹部，剪开腹部背侧表皮，将卵巢从腹腔中拉出，完成卵巢解剖。
  4. 将三对卵巢置于含有1 ml PFA的1.5 ml离心管中，在室温下固定20分钟。
  5. 用移液器（玻璃或一次性）吸去固定液，然后用含0.2% TritonX-100的1×PBS（PBST）洗涤卵巢，每次10分钟，共洗涤3次。建议在固定和洗涤过程中使用混合/旋转仪进行轻柔振荡（摆动角度：60°（F60）/转速：8 RPM）。

3. 使用蛋白酶K（PK）处理以增加胚胎组织的通透性

注意：蛋白酶K处理适用于从原肠胚带伸长阶段开始的胚胎（发育第11阶段）。对于更早期的胚胎，此步骤为可选。

  1. 用1×PBS将PK储存液（10 mg/ml）连续稀释至工作浓度1 µg/ml。
  2. 将卵巢与1 µg/ml PK溶液（约500 µl）在轻微振荡条件下孵育10分钟。
  3. 倾去PK溶液，随后用700 µl甘氨酸溶液（2 mg/ml）洗涤卵巢，每次5分钟，共洗3次。
  4. 用0.2% PBST洗涤卵巢，每次10分钟，共洗2次。
  5. 在室温下，用固定缓冲液再次固定卵巢，轻轻振荡孵育15分钟。
  6. 弃去上清液，用0.2% PBST洗涤卵巢，每次10分钟，共洗2次。

4. 甲醇孵育以抑制内源性过氧化物酶（POD）活性

注意：对于进行鬼笔环肽染色或对甲醇敏感的抗体表位的胚胎，不适用甲醇孵育步骤。

  1. 用含有不同浓度甲醇的0.2% PBST（v/v：1:3、1:1、3:1）对卵巢进行逐级脱水处理，每个甲醇浓度下孵育10分钟，并轻微振荡。
  2. 用100%甲醇在室温下脱水1小时，轻微振荡。
    注意：将蚜虫组织保存于-20 °C的100%甲醇中一个月后，仍可获得满意的染色结果。
  3. 用含有不同浓度甲醇的0.2% PBST（v/v：3:1、1:1、1:3）对卵巢进行逐级复水处理，每个甲醇浓度下孵育10分钟，并轻微振荡。

5. 抗体染色

  1. 将基于 DIG 的缓冲液套装（DIG-B）中的 10 倍浓度封闭液稀释至 1 倍浓度。
    注意：与由 5%（v/v）正常山羊血清（NGS）和 0.5%（v/v）牛血清白蛋白（BSA）溶于 0.2% PBST 中组成的常规封闭试剂相比，1× DIG-B 封闭液在降低染色背景方面效果更佳。
  2. 将卵巢置于 1× DIG-B 封闭液中，在室温下孵育 2.5 至 4 小时，或在 4 °C 下过夜孵育，同时轻微振荡。
    注意：对于置于 1.5 ml 离心管中的三对卵巢，200 µl 是进行样本封闭和抗体染色的最小体积。
  3. 倒去上清液，更换为含有适当稀释比例一抗的新鲜 1× DIG-B 封闭液。在室温下染色 4 小时，或在 4 °C 下过夜孵育，同时轻微振荡。
    注意：对于本实验所述条件，建议使用以下一抗的最佳稀释比例：（1）ApVas1 抗体：显色染色为 1:500，免疫荧光染色为 1:50；（2）抗-α 微管蛋白抗体：1:500；（3）4D9 单克隆抗体：1:25。
  4. 用 0.2% PBST 洗涤卵巢，每次 15 分钟，共洗涤 4 次。
  5. 将卵巢在 1× DIG-B 封闭液中于室温孵育 1 小时，同时轻微振荡。
  6. 倒去上清液，更换为含有适当稀释比例二抗的新鲜 1× DIG-B 封闭液。在室温下染色 4 小时，或在 4 °C 下过夜孵育，同时轻微振荡。
    1. 使用以下二抗稀释比例：（1）免疫荧光染色：Alexa Fluor 633 山羊抗兔 IgG 或 Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG，稀释比例为 1:500；（2）显色染色：生物素化山羊抗兔 IgG，稀释比例为 1:200。
      注意：生物素化二抗用于基于底物的（显色）检测系统中与亲和素-生物素复合物（ABC）结合，从而显著增强染色信号。
    2. 进行免疫荧光染色时需避光操作，因为二抗对光敏感。
  7. 用 0.2% PBST 洗去二抗，每次 10 分钟，共洗涤 4 次。

6. 细胞核与F-肌动蛋白染色

注意：此步骤仅适用于免疫荧光染色。

  1. 在避光条件下，用含DAPI（2 ng/µl）和Phalloidin-TRITC（100 nM）的0.2% PBST对卵巢染色，室温孵育2小时。
  2. 用0.2% PBST清洗卵巢，每次10分钟，共洗4次。
  3. 将卵巢在封片剂中4 °C轻微振荡孵育过夜。

7. 信号显色

注意：此步骤仅适用于显色染色。

  1. 通过将1 µl试剂A（亲和素）加入98 µl的0.2% PBST中，轻轻吹打混匀，再加入1 µl试剂B（与辣根过氧化物酶偶联的生物素），立即混匀，配制100 µl用于增强信号的亲和素-生物素复合物（ABC）试剂。将混合物在室温下轻度振荡孵育30分钟。
  2. 将卵巢（包括解离的卵室）在试剂A和B的混合液中于室温轻度振荡孵育30分钟。
  3. 用0.2% PBST洗涤去除试剂A和B的混合液，每次10分钟，共洗4次。
  4. 用塑料移液器将浸没在PBST中的卵巢转移至点板的孔中。
  5. 配制3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物溶液：将一片DAB片剂与另一片含尿素过氧化氢的片剂加入1 ml ddH2O中，剧烈涡旋震荡1分钟至完全溶解。
    注：DAB是过氧化物酶的一种沉淀型底物，是免疫染色中常用的显色剂。经过氧化物酶氧化后，产生不溶性棕褐色沉淀。可通过在底物溶液中添加氯化镍（终浓度0.05–0.08%）来增强弱信号。
  6. 吸除点板孔中残留的PBST溶液，立即加入100 µl DAB底物溶液以进行信号显色。
  7. 在体视显微镜下低倍镜观察信号强度。
  8. 通过吸除DAB溶液终止反应，立即用1x PBS重新填充，重复洗涤两次。
  9. 将卵巢转移回1.5 ml离心管中，再用1x PBS或PBST洗涤两次，每次15分钟。 
  10. 将卵巢在基于甘油的封片介质（70%甘油）中于4 °C轻度振荡过夜孵育。

8. 蚜虫胚胎的封片

注意：蚜虫胚胎的厚度随发育阶段的不同而变化。因此，针对早期（生殖区及 0–10 阶段）、中期（11–18 阶段）和晚期胚胎（19–20 阶段）需采用不同的封片策略，如图 2B–D所示。胚胎分期参照 Miura et al.12

  1. 使用塑料滴管将卵巢连同封片介质一起转移至细胞培养皿中，并在体视显微镜下以低倍镜观察样品。
  2. 利用昆虫针剪除与侧输卵管相连的萼片结构，然后用滴管将分离的卵巢管转移至空的玻璃孔中，再用封片介质补足终体积至 50–100 µl。
  3. 用玻璃滴管将卵巢管转移至载玻片上，随后使用昆虫针解剖卵室。
    注意：对于发育阶段超过第6期的胚胎，建议分离卵室；而对于生殖腺体（germaria）以及发育早于第6期的前两个卵室，分离为可选步骤。
  4. 使用玻璃滴管将已解剖的卵室转移至洁净的载玻片上。
  5. 将盖玻片（尺寸：22 × 22 mm）缓慢覆盖在已解剖的生殖腺体或卵室（包含发育阶段为1–10期的胚胎）上，避免产生气泡。
    1. 对于含有发育阶段为11–18期胚胎的卵室，采用单侧盖玻片桥法将其封片于载玻片上，并将另一张盖玻片（尺寸：18 × 18 mm）置于样品上方。
    2. 对于含有发育阶段晚于第19期胚胎的卵室，采用双侧盖玻片桥法将其封片于载玻片上，并将另一张盖玻片（尺寸：18 × 18 mm）置于样品上方。
  6. 用封片介质填充顶部盖玻片下方的空间，防止样品干燥。
  7. 通过轻轻滑动盖玻片，使胚胎缓慢滚动，以获得适合观察的正确方位。
  8. 用指甲油密封盖玻片边缘（包括桥式盖玻片的边缘）。

9. 成像分析

  1. 使用配备微分干涉差（DIC）光学系统和干式物镜（10X、20X、40X）并连接相机的复合显微镜，拍摄整体胚胎的微分干涉差（DIC）图像。根据制造商的说明安装软件，以实现相机与计算机之间的图像传输。
  2. 使用激光扫描共聚焦显微镜14获取荧光标记胚胎的投影图像。按照制造商的说明，使用成像软件进行拍照、z轴层扫和三维投影。
    1. 将载玻片倒置，用10X物镜找到封片的样品，并用细油性笔在样品区域周围画圈。
      注意：这有助于在共聚焦显微镜物镜下搜索时更方便地识别样品。
    2. 在盖玻片顶部滴加一滴镜油，该盖玻片的另一侧应如步骤9.2.1所述已做标记。
  3. 先用40X油浸物镜找到焦平面，然后切换至63X油浸物镜。手动上下调节细焦旋钮，以获取最佳焦平面。
    注意：为观察卵原巢和早期胚胎的结构细节，建议使用40X或更高倍数的物镜。
  4. 在不同激发通道下扫描胚胎，并获取z轴层扫图像。
    注意：对于豌豆蚜组织，建议将每个光学切片的厚度减小至1.5 µm或更薄。

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结果

本研究中，我们对无性繁殖的豌豆蚜胚胎进行了整体免疫染色（图1A）。这些雌性个体通过孤雌生殖和胎生方式产生后代。这些雌性胚胎在卵巢小管（卵管）的卵室内发育（图1B 和 图2A）。在显微镜观察前，解剖得到的卵管是染色的目标组织；然而，为了在显微镜下观察胚胎，需要将卵室分离（图2B-D）。

组织通透性增加

蛋白酶K（PK）处理是提高组织通透性的常用方法，但对于某些模式生物的胚胎（例如） 秀丽隐杆线虫 （线虫）， 黑腹果蝇 （果蝇），以及 Danio rerio （斑马鱼）——此步骤为可选。在豌豆蚜中，蛋白酶K（PK）处...

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讨论

我们确定了在豌豆蚜 A. pisum 中成功进行免疫染色的关键优化条件，该物种是基因组学和发育研究领域新兴的模式生物3,15。通过优化组织通透性和降低背景染色的条件，显著增强了信号的强度和特异性。这些条件在细胞膜打孔和阻断非特异性抗体结合的步骤上，与其他动物模型的免疫染色标准方案有所不同。

用于免疫染色和 原位 杂交过程中，蛋白酶K（PK）消化是提高组织通透性的常用方法之一16-19在蚜虫组织的抗体染色中，我们的结果表明：（1）蛋白酶K消化显著增强了孤雌生殖胎生胚胎在原肠带伸展时期（11–14期）的免疫染色信号图 3B''、C'')，尽管在未经过PK处理的胚胎中仍可见微弱信号（图3B、C）；（2）自katatrepsis期（第15-20阶段）开始，胚胎必须进行PK消化（图 4C、F 和 图6C对于发生孤雌胎生且处于后胚翻转期之前的胚胎，卵室体积不太可能...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢中国台湾果蝇中心的 Chau-Ti Ting 提供单克隆抗体 4D9，感谢台湾大学生命科学学院技术共同服务中心（TechComm）提供的共聚焦显微镜技术支持，感谢 Hsiao-Ling Lu 对稿件的校对，以及 Chen-yo Chung 在拍摄过程中的协助。CC 特别感谢 Charles E. Cook 为本研究提供的战略性建议以及对稿件的关键性修改。本研究得到了科技部（项目编号：101-2313-B-002-059-MY3 和 104-2313-B-002-022-MY3，授予 GWL 和 CC）以及中国台湾大学（项目编号：NTU-CESRP 101R4602D3，授予 CC；103R4000，授予 GWL）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% 过氧化氢（H2O2）Sigma-Aldrich18304用于漂白胚胎中的内源性过氧化物酶。
4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）Sigma-AldrichD9542用于双链DNA标记。有毒。佩戴手套，分装成小份并冷冻保存以减少暴露
4D9 抗engrailed/invected小鼠单克隆抗体发育研究杂交瘤库AB_528224用于标记胚胎发育中的体节。
ApVas1 兔多克隆抗体本实验室N/A用于标记蚜虫胚胎中生殖系特异的Vas1蛋白。该抗体由本实验室制备。 
Austerlitz 昆虫针ENTOMORAVIAN/A用于从卵巢管中分离各个卵室。000号，黑色釉质涂层。 
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich9048-46-8用于阻断抗体的非特异性结合。
连接至复合显微镜的相机佳能EOS 5D用于拍摄蚜虫胚胎图像。
比色法8孔板Kartell Labware357用于蚜虫胚胎染色信号的显色反应。直径95 × 57 mm，孔深2 mm。
配备微分干涉差（DIC）光学系统的复合显微镜Leica MicrosystemsDMR用于拍摄载玻片上封片的蚜虫胚胎。
DIG洗涤与封闭缓冲液试剂盒Sigma-Aldrich (Roche)11585762001用于阻断抗体的非特异性结合。我们将10倍浓度的封闭液稀释为1倍浓度作为封闭试剂。
镊子Ideal-tekN/A用于从蚜虫中解剖卵巢。制造商货号：5 SA。 
玻璃滴管N/AN/A用于将蚜虫卵巢从点滴板转移至离心管。总长150 mm，尖端长度5 3/4"。
甘油Sigma-AldrichG5516用于蚜虫胚胎的透明化和封片。
甘氨酸BioshopN/A用于阻断蛋白酶K（PK）的酶活性。
与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgGInvitrogenA11017用于检测来源于小鼠的一抗。
与Alexa Fluor 633偶联的山羊抗兔IgGInvitrogenA21072用于检测来源于兔的一抗。
智能混匀仪ELMI实验室设备RM-2M用于提高试剂与卵巢之间的充分反应。
激光扫描共聚焦显微镜Leica MicrosystemsSP5用于拍摄载玻片上带有荧光标记的蚜虫胚胎。
甲醇 Burdick and JacksonAH2304用于漂白胚胎中的内源性过氧化物酶。
显微镜载玻片 Thermo scientific10143560用于胚胎封片。SUPERFROST磨边，约76 × 26 mm。
显微镜盖玻片Marienfeld0101030用于将胚胎封在载玻片上。尺寸18 × 18 mm。厚度1号（0.13至0.16 mm）
显微镜盖玻片Marienfeld0101050用于将胚胎封在载玻片上。尺寸22 × 22 mm。厚度1号（0.13至0.16 mm）
小鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体（DM1A）Santa Cruz Biotechnologysc-32293用于标记细胞中α-微管蛋白的分布。
指甲油N/AN/A用于密封盖玻片。
正常山羊血清（NGS）Sigma-AldrichG9023用于阻断抗体的非特异性结合。
多聚甲醛（PFA）VWRMK262159用于固定蚜虫卵巢。
鬼笔环肽-TRITCSigma-AldrichP1951用于标记胚胎中F-肌动蛋白的分布。
磷酸盐缓冲液（PBS）N/AN/A作为蚜虫卵巢的等渗溶液。
塑料滴管N/AN/A用于将蚜虫卵巢从离心管转移至孔板。容量3 ml。 
蛋白酶KMerck124678用于在细胞膜上形成孔洞（打孔），促进抗体进入。 
Pyrex点滴板N/AN/A用于在显微镜下进行蚜虫卵巢的解剖和显色反应。每个凹腔直径22 mm，深度7 mm。 
SIGMAFAST 3,3’-二氨基联苯胺（DAB）片剂 Sigma-AldrichD4168用于底物信号的显色反应。也称为DAB过氧化物酶底物片剂套装。
体视显微镜Leica MicrosystemsEZ4用于蚜虫卵巢的解剖与观察。
吐温-20（Triton-X 100）Sigma-AldrichT8787用于在细胞膜上形成孔洞（打孔）。 
VECTASHIELD Elite ABC试剂盒（兔IgG）Vector laboratoriesPK-6101用于增强信号。包含生物素化的山羊抗兔IgG二抗以及A和B试剂。
VECTASHIELD封片剂Vector laboratoriesH1000用于蚜虫胚胎的透明化和封片。

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