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建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

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DOI：

10.3791/53884

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2016年10月14日

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1Department of Surgery and Translational Medicine (DCMT), University of Florence, 2Neurofarba Department, University of Florence, 3Department of Traumatology and General Orthopedics, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi

本文内容

摘要

最近研究发现，骨肉瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）与其发病机制相关。本文介绍了从常规骨肉瘤（OS）患者活检组织获得的原代细胞培养物中分离CSCs的方法，该方法基于CSCs在非黏附条件下生长的能力。

摘要

目前针对骨肉瘤（OS）的治疗手段虽已取得进展，延长了癌症患者的生命，但一旦发生转移，患者的五年生存率仍然较低。癌症干细胞（CSC）理论认为，肿瘤内部存在一类具有干细胞特性的细胞亚群，能够维持肿瘤的持续生长并抵抗多种药物的化疗作用。因此，为了推动靶向治疗的发展，彻底清除这一特定细胞亚群并降低患者的发病率与死亡率，亟需更深入地理解OS的生物学特性与发病机制。分离CSC、建立CSC的细胞培养体系并研究其生物学行为，是增进对OS生物学与发病机制认知的重要步骤。目前已有多种方法可实现从OS活检组织中建立人源性OS-CSCs，其中包括在非黏附条件下构建三维干细胞培养体系的技术。在此类条件下，CSC能够通过子代干细胞形成悬浮的球形克隆，这些克隆被称为"细胞球"。本文介绍一种从OS活检组织获得的传统OS原代细胞培养物中建立CSC培养体系的方法，并详细描述分离与鉴定CSC所需的多个传代步骤。

引言

肉瘤是一类起源于胚胎中胚层的异质性罕见恶性结缔组织肿瘤1。其不同类型包括骨肉瘤和软组织肉瘤。骨肉瘤是一组相对少见的原发性肿瘤，包含多个亚型，其中骨肉瘤（OS）是骨最常见的原发性肿瘤之一。OS是一种间叶源性恶性肿瘤，具有显著的临床、组织学和分子异质性2, 3。遗憾的是，OS主要发生于儿童和年轻成人4, 5，占儿童期骨肉瘤常见组织学亚型的60%6, 7。OS通常累及骨骼中骨生长迅速的区域（例如，长骨的干骺端）。在组织学上不同的OS亚型中，传统型OS（也称为髓内型或中心型OS）恶性程度高，占比达80%8。这80%包括60%的传统成骨细胞型OS、10%的软骨母细胞型OS和10%的成纤维细胞型OS6, 8-10。其他OS亚型包括未分化型、血管扩张型、富含巨细胞型和小细胞型OS。尽管在OS的治疗中联合手术与化疗已取得进展，但预后仍然不佳，无转移患者的长期生存率仅为65-70%11, 12。远处复发常表现为肺转移，较少情况下为远处骨转移或局部复发13。转移灶通常对常规治疗耐药，这也是在诊断时已存在转移的患者10年无病生存率仅为约30%的原因14, 15。

与正常组织一样，肿瘤组织由多种不同类型的细胞异质性组成。肿瘤内的细胞似乎对应着不同发育阶段的细胞。在任何正常组织中，都存在一群具有自我更新能力的细胞亚群，从而为组织稳态提供前体细胞和成熟细胞。类似地，癌症也由处于不同发育阶段、具有不同增殖能力和致瘤潜能的异质性细胞群体构成。其中一部分癌细胞被称为癌症干细胞（Cancer stem Cells, CSCs），它们是一类能够自我维持的细胞亚群，具有独特的自我更新能力，并可维持肿瘤的恶性潜能，进而产生构成肿瘤主体的各类细胞谱系16。20世纪90年代，关于急性髓系白血病的研究首次提供了癌症干细胞亚群存在的有力证据17, 18。此后，CSCs已从大量实体瘤中被成功分离出来，成为癌症研究中最受关注的课题之一19。CSCs可能起源于正常干细胞，因某些基因发生突变而导致正常干细胞转化为癌变细胞20-23。多个转化性突变以及与微环境的相互作用，也可能促使 健康的前体细胞和成熟细胞获得典型的CSC特征，即自我更新能力和无限增殖潜能。关于这一转化过程存在多种假说：健康的前体细胞、健康的成熟细胞以及癌细胞均可能去分化为干细胞，通过激活与自我更新相关的基因而获得类似干细胞的表型24-28。尽管近年来已有诸多研究，但CSCs的起源至今仍未完全明确。

肿瘤干细胞（CSCs）的一个显著特征是其对多模式治疗（包括手术联合多种药物化疗）具有抵抗能力。近期研究表明，CSCs还可能获得对细胞毒性化疗药物的耐药性。这种耐药性的可能机制包括ATP结合盒（ABC）多药耐药转运蛋白的过表达。即， MDR1 和 BCRP1）、化疗药物代谢酶（如醛脱氢酶1（ALDH1））的过表达，和/或细胞周期动力学的改变30-33所有上述概念的直接结果是，只有当肿瘤干细胞亚群被完全清除时，癌症治疗才会有效；而即使有单个肿瘤干细胞存活，也可能导致局部复发或远处转移。

在人类肉瘤34，尤其是骨肉瘤35，或其他任何骨与软组织肿瘤中发现肿瘤干细胞（CSCs），具有重要的临床意义，因为它可能解释为何许多治疗在初期看似有效，但患者后期仍会复发。因此，未来对抗传统骨肉瘤的希望在于，基于对OS-CSCs亚群的分子特征分析及CSC生物学研究，开发出针对OS-CSCs 的新型特异性靶向治疗策略。

1992年，Reynolds 及其同事在研究成年哺乳动物大脑中是否存在某些干细胞亚群时，开发出一种方法，用于分离疑似具有干细胞特性的细胞36, 37。该方法基于这些细胞在非黏附条件下培养时能够形成球形克隆的特殊能力。2005年，Gibbs 及其同事采用类似技术研究了骨肉瘤中的一群具有干细胞特性的细胞亚群38。为了从不同类型传统骨肉瘤的原代细胞培养物中分离和鉴定骨肉瘤干细胞（OS-CSCs），我们决定将该技术应用于骨肉瘤细胞系。

本文介绍了球体形成实验的一种改良方法，称为“"肉瘤球实验"”，可用于从来源于常规骨肉瘤（OS）患者活检组织的有限原代细胞系中分离骨肉瘤干细胞（OS-CSCs）。同时，我们还描述了用于验证该实验所分离细胞系干样肿瘤干细胞（CSC）表型的全部技术：1）检测多能性胚胎干细胞（ESCs）特征性基因及CSC标志物CD133基因的表达水平；2）集落形成单位（CFU）实验；3）在适当的诱导分化条件下，评估这些细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能；4）通过免疫荧光染色和流式细胞术分析间充质干细胞（MSCs）表面标志物（i.e., CD44、CD105和Stro-1）的表达；5）评估这些细胞的ALDH活性。

方案

本文所述使用人体组织的所有实验均经当地伦理委员会批准（Rif. N. 141/12）。在AOUC已从捐献者处获得采集组织样本以及使用和储存样本的知情同意。

1. 培养前准备

  1. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、100 IU/ml青霉素和100 µg/ml链霉素来制备生长培养基（GM）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌GM。将GM在4 °C下保存，最长可保存1个月。
  2. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加20% FBS、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和3 mg/ml II型胶原酶来制备胶原酶培养基（CM）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌CM。将CM在-20 °C下保存，最长可保存1个月。
  3. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加40% FBS、100 IU/ml 青霉素、100 µg/ml链霉素和6.5%二甲基亚砜（DMSO）来制备细胞冻存培养基（FM）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌FM。将FM在4 °C下保存，最长可保存1个月。
  4. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加20% FBS、100 IU/ml青霉素和100 µg/ml链霉素来制备集落形成单位（CFU）检测培养基（CFUM）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌CFUM。将CFUM在4 °C下保存，最长可保存1个月。
  5. 通过将400 mg胰蛋白酶、200 mg EDTA和1,000 mg无水D(+)-葡萄糖溶解于1,000 ml不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）中来制备胰蛋白酶溶液。
    注意：使用0.22 µm滤膜将新鲜配制的胰蛋白酶-EDTA溶液分装至25 cm2培养瓶中，每瓶50 ml，于-20 °C冷冻保存，最长可保存3个月。解冻后的滤膜灭菌分装液可在4 °C下储存，且活性不会丧失。
  6. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加10% FBS、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和10 ng/ml bFGF（25 µg/ml储备液）来制备干细胞生长培养基（SCGM）。使用0.22 µm滤膜过滤SCGM，并在4 °C下保存，最长可保存2周。
  7. 通过在4 °C条件下将甲基纤维素（MC）溶解于超纯H2O中3天来制备2%甲基纤维素溶液。待MC完全溶解后，进行高压灭菌，并在4 °C下保存。
    注意：MC灭菌后会凝固。为使其恢复液态，需在4 °C下储存。
  8. 制备肉瘤球生长培养基（SGM）。该培养基需新鲜配制（使用前不超过2周），通过向2倍浓度的Coon's改良Ham's F12培养基中添加100 IU/ml青霉素、100 µg/ml人bFGF（25 µg/ml储备液）、20 nM孕酮（10 µM储备液）、100 µM腐胺、30 nM亚硒酸钠（30 µM储备液）、25 µg/ml转铁蛋白（25 mg/ml储备液）、20 µg/ml胰岛素（20 mg/ml储备液）和10 ng/mL人EGF（10 µg/mL储备液）来完成。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌SGM。在4 °C下保存，最长可保存2周。
  9. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加10% FBS（南美来源）、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、10 nM地塞米松（100 µM储备液）、0.2 mM L-抗坏血酸磷酸钠（1 M储备液）、10 mM β-甘油磷酸钠（5 mg/ml储备液）和1 µg/ml钙黄绿素（200 µg/ml储备液）来制备成骨培养基（OM）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌OM。在4 °C下保存。
    注意：地塞米松储备液应保存在液氮中以维持其活性。每2周需新鲜配制OM，以保持地塞米松的活性，从而维持培养基的分化潜能。
  10. 通过将1.66 mg NH4Cl、0.2 mg K2HPO4和0.007 mg EDTA溶解于200 ml蒸馏水 (dH2O)中来制备红细胞裂解缓冲液（ELB）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌ELB。在4 °C下保存。
  11. 通过向Coon's改良的Ham's F12培养基中添加10% FBS（南美来源）、 100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、1 µM地塞米松（1 mM储备液）、1 µM牛胰岛素（10 mM储备液）、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）（500 mM储备液）和100 µM吲哚美辛（200 mM储备液）来制备成脂培养基（AM）。使用0.22 µm滤膜过滤并灭菌AM。在4 °C下保存。
    注意：地塞米松储备液应保存在液氮中以维持其活性。每2周需新鲜配制AM，以保持地塞米松的活性，从而维持培养基的分化潜能。
  12. 在DPBS中制备2%牛血清白蛋白（BSA）溶液（BSA/DPBS）。将10 g BSA溶解于500 ml DPBS中，并将储备液分装至50 ml锥形管中，每管50 ml。在-20 °C下保存。
  13. 在化学通风橱中，将多聚甲醛稀释于DPBS中，制备4%多聚甲醛（PFA）的DPBS溶液（PFA/DPBS）。将储备液分装至50 ml锥形管中，每管50 ml。在4 °C下保存。

2. 建立骨肉瘤原代细胞培养及有限细胞系（OSA）

注意：原始骨肉瘤细胞培养物取自佛罗伦萨AOUC Careggi医院“骨科肿瘤与重建科”（Unità Ortopedia Oncologica e Ricostruttiva）收集的传统骨肉瘤活检新鲜样本。所有活检样本均通过穿刺抽吸或手术切除肿瘤小部分组织获得（图1A、B），立即置于添加了100 IU/ml青霉素和100 µg/ml链霉素（pH 7.4）的培养基中，并运送至实验室进行处理。所有所述操作均在超净工作台内无菌条件下进行。

  1. OS细胞的分离
    1. 将活检组织置于含少量生长培养基（GM）的100 mm培养皿中。使用无菌采血针和Perry镊子将骨肉瘤（OS）组织样本剪切成尽可能小的碎片（0.5 – 1 mm）图2A, B) .
    2. 用10 ml CM覆盖组织碎片以进行酶消化（图2B）并孵育 3 小时 在37 °C，5% CO₂2 孵育箱中。用移液器轻轻吸出组织碎片悬液，转移至15 ml锥形管中，立即离心（400 × g，5分钟），使碎片沉淀。
      注意： 离心后，如果活检组织富含红细胞，可在组织碎片上观察到由红细胞组成的红色沉淀。因此，在进行机械分散前，需用红细胞裂解缓冲液处理样本。通过抽吸弃去上清液，加入5 ml ELB。
    3. 将沉淀物碎片悬浮1分钟，然后以400 × g离心2分钟。用抽吸法去除上清液。加入5 ml GM，使用10 ml血清移液管（内径1.5 mm）机械分散碎片 Ø10 - 20 次。
    4. 在 400 × g 条件下离心悬浮液 5 分钟。用移液法吸除上清液，将细胞沉淀用 10 ml GM 重悬，然后将所得细胞悬液转移至 100 mm 培养皿中。将培养皿置于 37 °C，5% CO₂2 在培养箱中孵育，每3天将生长培养基（GM）更换为新鲜的完全生长培养基。
      注意： 通常，通过针吸获得的骨肉瘤（OS）组织样本体积较小，且含有骨碎片，这些骨碎片无法通过胶原酶消化有效降解。因此，在去除上清液后，应尝试用移液器反复吹打沉淀物中的碎片，以分离骨组织中的细胞。
  2. 传代培养
    注意：     为建立骨肉瘤细胞系，当细胞达到约融合状态时，将其从培养容器中取出，稀释后接种于新的培养板中以促进进一步生长。该传代培养过程通过称为胰蛋白酶消化的酶解方法完成。
    1. 用移液管吸除培养基。为解离细胞单层，加入 2 - 3 ml 胰蛋白酶，室温下进行 （最大 18 - 20） °C），轻轻振荡一次，立即吸除胰蛋白酶。重复两次。将细胞在37 °37°C 下孵育 3 - 4 分钟，直至细胞开始脱落。
      注意： 经验丰富的操作者可通过将培养皿置于光线下观察，当略显浑浊的单层细胞出现细小孔洞时，即可判断胰蛋白酶消化效果良好。也可使用倒置显微镜监测该解离过程；建议初学者采用此方法。
    2. 通过加入10 ml GM终止胰酶反应，并用移液器充分吹打洗涤培养皿以脱离所有细胞。取1 ml细胞悬液转移至新的100 mm培养皿中，加入9 ml GM（细胞按1/10比例传代）。
      注意： 剩余的细胞悬液可用于细胞扩增（转移至另一个100 mm培养皿），可进行冷冻保存（见第2.3节），或进行计数后接种于实验用培养皿或孔板中，用于增殖检测或其他用途（见下文）。
  3. 骨肉瘤原代培养物与OSA的冷冻保存
    注意： 将一个汇合的100 mm培养皿冻存至4–5个冻存管中。冷冻保存过程必须迅速进行，因为二甲基亚砜（DMSO）在非冷冻温度下对细胞具有毒性，尽管它可在冷冻过程中保护细胞膜。
    1. 通过胰蛋白酶消化法将细胞培养物从单层中解离（参见第2.2节），在400 × g离心5分钟使细胞成团，吸除上清液，然后迅速将细胞沉淀重悬于FM中。
    2. 每支冷冻管分装 1 ml 该悬浮液。立即将装有悬浮液的冻存管放入含有 2-丙醇夹层的冻存盒中，并立即于 -80 ℃ 保存 °C O/N。次日将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
  4. 解冻骨肉瘤细胞系和原代培养物
    1. 从液氮储存中取出OS细胞系，将冻存管置于37℃水浴中快速解冻 °C. 将冻存管中的内容物转移至15 ml锥形管中，加入约10 ml生长培养基（参见第2.3节以去除DMSO）。通过抽吸去除上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml生长培养基中。将细胞悬液接种至100 mm培养皿中，在37℃培养箱中培养。 °C，5% CO2 培养箱

3. 分离骨肉瘤干细胞的肉瘤球检测法

注意：本实验在 OSA 上进行。实验持续时间取决于细胞形成球状克隆（肉瘤球）的能力，时间范围为 7、14、21 和 28 天。

  1. 建立肉瘤球检测
    1. 提前准备好血细胞计数板腔室和所有试剂。
    2. 通过抽吸去除培养基，并用胰蛋白酶消化法将细胞从单层上解离（见第2.2节）。充分混匀细胞悬液，用移液器吹打以分散任何团块，使用20 µL移液器吸头吸取10 µL。
    3. 立即将10 µL细胞悬液转移至血细胞计数板腔室边缘，挤出悬液，使其通过毛细作用吸入盖玻片下方。
    4. 在相差显微镜下观察血细胞计数板腔室。选择10倍物镜，聚焦于腔室的网格线上。利用分格区域（由三条平行线界定）和单个网格线辅助，计数位于该1 mm2区域内的细胞。
    5. 测定细胞浓度，并应用以下公式计算：1 ml = n*104/z（n：所有计数的1 mm2方格中细胞总数；z：计数的1 mm2方格数量）。计算所需细胞悬液体积，以每孔接种40,000个细胞，共6孔超低吸附培养板，总计接种240,000个细胞。
      注意：为确保接种准确数量的细胞，应额外多接种一孔。因此，总接种细胞数应为280,000个。
    6. 在25 cm2培养瓶中加入50%的2% MC，配制35 ml SGM（即SGM-MC）。配制SGM总体积时，需额外预留5 ml，以便多接种一孔。
    7. 将计算好的细胞悬液体积加入培养瓶中的SGM-MC中，用移液器轻轻混匀以分散任何团块。将细胞接种至6孔超低吸附培养板中，并使用倒置显微镜观察接种后细胞的形态。
    8. 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。每隔3天，向每孔加入新鲜的bFGF和EGF等分试样，以补充生长因子浓度。每孔加入2 µL bFGF和5 µL EGF，使两者的终浓度均维持在10 ng/mL。
  2. 肉瘤球的分离
    注意：在第7、14、21和28天监测肉瘤球检测的进展情况 ，以确定何时需要分离形成的肉瘤球。
    1. 在超净工作台内准备好所有试剂和设备（图3A, B）。将直径为25 mm、孔径为40 µm的网状滤膜放入膜过滤器支架中，组装过滤装置；通过高压灭菌进行消毒（图4A-E）。
    2. 对于每个孔，使用带有1,000 µL吸头的无菌移液器，将含有肉瘤球的培养基转移至装有无菌膜过滤器支架的注射器中。完全移除含有肉瘤球的培养基后，加入5 ml GM清洗孔板，以确保将所有肉瘤球 转移至注射器中。使用显微镜确认是否已回收全部肉瘤球。若未完全回收，则重复此步骤。
    3. 仅依靠重力、不施加压力，使用膜过滤器支架过滤悬液，以防止损伤肉瘤球，并避免肉瘤球穿过滤膜造成损失。用无菌玻璃巴斯德移液器轻轻操作，去除气泡。
      注意：有时膜过滤器支架中的气泡会导致过滤堵塞。
    4. 向注射器中加入10 ml GM，使其在无压力条件下过滤，以清洗过滤装置，确保去除单个细胞。将过滤装置从注射器上拆下，放入培养皿中。
    5. 使用Perry镊子从膜过滤器支架中取出网状滤膜，并在60 mm培养皿中轻轻晃动镊子，使肉瘤球从滤膜缠结中释放出来。然后将滤膜放入一个孔中，通过显微镜观察确认滤膜上是否仍有肉瘤球缠结。若仍有肉瘤球缠结在滤膜上，则按步骤3.2.4所述进行另一次清洗。
    6. 使用显微镜观察已释放的肉瘤球。将释放的肉瘤球置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。对6孔超低吸附培养板的每一孔重复上述所有步骤。

4. 骨肉瘤-肿瘤干细胞系

注意：OS-CSCs 是通过将细胞重新接种并再次培养于小尺寸 60 mm 培养皿中的单层培养条件下，使其脱离超低吸附环境后，由表现出贴壁扩增能力的骨肉瘤球（sarcospheres）获得的。

  1. OS-CSC 培养物
    1. 当细胞在60 mm培养皿中贴壁生长至约90%融合时，进行传代培养以促进进一步生长。重复步骤2.2.1以建立骨肉瘤干细胞（OS-CSC）培养体系。
    2. 通过加入4 ml SCGM终止消化，并用移液管充分吹打洗涤培养皿以脱离所有细胞。将细胞悬液转移至新的100 mm培养皿中，加入6 ml SCGM。当OS-CSCs达到90%融合度时，重复步骤2.2进行传代培养。
      注意： 对于 体外 为表征分离的 OS-CSCs 的干细胞样表型，可将细胞接种于不同类型的培养板中进行分析。
    3. 通过冻存保存已建立的OS-CSC细胞系（重复第2.3节的所有步骤）。通过重复第2.4节的所有步骤，复苏冻存的OS-CSCs。

5. 体外分析以表征OS-CSCs：

  1. 免疫荧光实验的细胞准备
    注意： 当细胞在24孔板的每个孔中达到适当的汇合度时，用多聚甲醛固定细胞。汇合度取决于实验类型。
    1. 将OS-CSCs接种于24孔板中，以研究其表面间充质干细胞（MSC）特性 通过免疫荧光检测标志物。当每个孔中的细胞达到50–60%融合度时，用移液法吸除干细胞生长培养基（SCGM），并在24孔板中用DPBS洗涤两次。
    2. 在化学通风橱中，加入500 µ向每个孔中加入含4% PFA的DPBS。室温孵育10分钟。移除PFA/DPBS，并用超纯水洗涤3次2O. 将24孔板置于通风橱中晾干。
  2. 间充质干细胞标志物的免疫荧光检测
    注意： 使用针对 CD44、Stro-1 和 CD105 的抗体，对经 4% PFA/DPBS 固定的骨肉瘤干细胞（OS-CSCs）进行免疫荧光染色，可用于研究 OS-CSCs 的间充质干细胞样表型。以下方法为作者常规使用。
    1. 在化学通风橱中，向经4% PFA/DPBS固定的细胞中加入500 µ向每个孔中加入 0.2% Triton X-100/DPBS。将细胞在 37℃ 下孵育°C 下孵育 30 分钟。用 DPBS 轻柔洗涤细胞 3 次。加入 300 µ将 L RNase 用 2% BSA/DPBS 按 1/1,000 比例稀释后加入细胞，37℃孵育 °C，30 分钟
    2. 轻柔洗涤细胞3次 用 2% BSA/DPBS 处理。对细胞进行间充质干细胞标志物染色。仅向选定作为每种抗体阳性对照的孔中加入一抗。
      1. 加入300 µL 抗-CD105 以 2% BSA/DPBS 按 1/10 比例稀释，300 µL 抗-CD44 用 2% BSA/DPBS 按 1/10 比例稀释，300 µL 抗 Stro-1 以 2% BSA/DPBS 按 1/10 比例稀释，仅使用 200 µ向每个抗体的阴性对照孔中加入 L 2% BSA/DPBS。
      2. 在4℃的湿润环境中孵育细胞 °C O/N。用 DPBS 洗涤孔 3 次，然后 用 2% BSA/DPBS 洗涤两次。
    3. 加入特异性二抗以显色一抗。
      1. 加入300 µL 抗兔 IgG（驴抗兔 IgG [H + L]），用 2% BSA/DPBS 按 1:100 稀释后，加入选定用于 CD44 和 CD105 的阳性及阴性对照孔中。每孔加入 300 µL FITC 抗小鼠 Ig（FITC-兔抗小鼠 IgG [H + L]）用 2% BSA/DPBS 按 1:100 稀释后加入选定用于 Stro-1 阳性与阴性对照的各孔中。将细胞于室温避光孵育 60 分钟。用 DPBS 洗涤各孔 6 次。
    4. 向300微升含有MSC标志物阳性细胞的样本中加入细胞骨架肌动蛋白染色剂以进行染色 µL鬼笔环肽按1/100稀释 用 2% BSA/DPBS 将每孔接种的细胞进行间充质干细胞标志物免疫荧光染色。
    5. 在室温下孵育细胞 40 分钟。用 DPBS 洗涤孔板 3 次，然后用超纯 dH₂O 洗涤 2 次。2O. 完成上述免疫荧光染色后，进行细胞核复染。配制10 μg/mL的碘化丙啶溶液-5 M 在 DPBS 中（储存液 1.5 × 10-3 M）在通风橱中进行。
      1. 加入200 µ向每个按上述方法染色的孔中加入 L 碘化丙啶溶液，在室温下孵育细胞 2 - 3 分钟，用超纯水洗涤孔板两次2O.
        注意： 重复第5.1节中的所有步骤 5.2 在HCT8细胞系上，这是一种用作阴性对照的原代连续性分化结肠癌细胞系。
  3. 成骨分化检测
    注意：     成骨分化持续 20 d。
    1. 将OS-CSCs以1 × 10的细胞密度接种于24孔板中4 细胞/厘米²2 在 SCCGM 中培养细胞，直至每孔细胞汇合度达到 80 - 90%。
    2. 通过将干细胞生长培养基（SCGM）更换为成骨诱导培养基（OM）来启动成骨分化。使细胞在OM中生长，并每3至4天更换一次培养基。在培养10天时终止成骨分化实验，以检测碱性磷酸酶（ALP）的存在。
    3. 用4% PFA/DPBS固定细胞（见第5.1节）。通过ALP的细胞化学染色以及使用茜素红S染色检测羟基磷灰石，评估成骨细胞表型。
    4. ALP 细胞化学染色
      注意： 在开始染色前，立即在化学通风橱中配制染料混合液。
      1. 将40 mg 快速蓝BB或快速红紫LB盐溶解于50 ml Tris-HCl中， pH 9 （溶液A）。将5 mg 萘酚-AS-MX 磷酸钠盐溶解于1 ml DMSO 中（溶液B）。将溶液B全部加入溶液A中，充分混匀，得到溶液C。用DPBS洗涤细胞两次。
      2. 加入500 µ向每个孔中加入1 ml溶液C，并在37℃孵育 °C 和 5% CO2每10分钟在显微镜下观察细胞，以监测染色过程的进展。
      3. 当ALP阳性细胞呈现深染色（使用Fast Blue BB盐时为蓝色，或使用Fast Red Violet LB盐时为红色）时停止染色，通常在30分钟内发生。用超纯dH₂O洗涤细胞3次。2O，以去除溶液C的所有残留物。如果染料有沉淀物存在，用无水乙醇快速洗涤细胞一次。
      4. 在完成碱性磷酸酶染色后，按照步骤5.2.5和5.2.5.1所述进行细胞核复染。
    5. 茜素红S细胞化学染色
      注意： 实验开始前准备好染料混合物。
      1. 配制 2% 茜素红 S（将 2 g 茜素红 S 溶于 100 ml 超纯 H2O). 加入 2.5% NH3 至2%茜素红S，调节pH至6.0。将2%茜素红S溶液于4℃保存 °C. 用DPBS洗涤细胞一次。
      2. 仅将茜素红 S 加入细胞中数秒钟。
      3. 用超纯 dH₂O 清洗孔板2O 用于控制染色程度；若透明质酸（HA）沉积物着色不深，重复步骤 5.3.5.2。当 HA 沉积物呈现深红色时停止染色，通常在数分钟内发生。洗涤孔板 使用超纯 dH₂O2O.
  4. 脂肪细胞分化
    注意： 检测持续时间取决于骨肉瘤干细胞系，可维持14至30天。
    1. 将OS-CSCs以1 × 10的细胞密度接种于24孔板中4 细胞/厘米²2 在SCGM中培养细胞，直至每孔细胞融合度达到80–90%。通过将SCGM更换为AM启动成脂分化，继续在AM中培养细胞，并每周更换AM两次。
    2. 当脂滴囊泡可见时，终止成脂分化实验。通过油红O染色及苏木精核复染对成脂表型进行评估。
    3. 细胞核的苏木精复染
      注意：实验开始前请先配制染料混合液。
      1. 配制5%苏木精溶液，称为Emallume Carazzi39. 将溶液于 4 ℃ 保存 °C. 加入Emallume Carazzi，仅作用2分钟。用超纯dH₂O洗涤孔板。2O.
  5. 集落形成单位（CFU）实验
    注意： 该实验必须设置三个重复。
    1. 将OS-CSCs以450个细胞/cm²的密度接种于100 mm的培养皿中2 在CFUM中。将细胞在37°C，5% CO2 在培养箱中培养4周，每周更换两次CFUM。
    2. 用甲苯胺蓝对集落形成单位（CFUs）进行染色。使用倒置显微镜计数着色的集落。根据以下公式计算CFU效率：（形成的集落数/接种的细胞数）×100。
  6. ALDH 活性分析
    注意： 使用ALDH活性比色法检测试剂盒对两条OS-CSC细胞系以及作为阴性对照的有限传代成纤维细胞系进行了ALDH活性评估。该试剂盒通过在450 nm处测定吸光度来定量ALDH酶活性。所有实验均重复三次。
    1. 通过胰蛋白酶消化法将细胞培养物从单层中解离（参见第2.2节）。在400 × g离心5分钟以沉淀细胞。遵循制造商的说明书。
  7. 流式细胞术分析：
    注意： 单细胞悬液是实现流式细胞术样本最佳染色的必要条件。每种待检测的抗体均需制备单细胞悬液。通过胰酶消化法将细胞从单层培养状态解离（参见第2.2节）。
    1. 将细胞悬液置于锥形管中，使用布氏计数板进行细胞计数，以400 × g离心细胞，然后重悬于适量分离缓冲液中，以获得终浓度为1 × 10⁶个细胞/mL的细胞悬液。5 细胞/毫升
    2. 将细胞悬液在 4 ℃ 下以 5 分钟离心 °C. 弃去上清液，并用分离缓冲液洗涤沉淀。重复此步骤两次。
    3. 对细胞进行间充质干细胞标志物染色（即CD44、CD105 和 Stro-140.
    4. 在流式细胞仪中分析呈阳性染色的细胞悬液。在1天内分析标记的样品。将这些样品在4℃下孵育 °C，直至分析。
  8. RT-PCR
    1. RNA的提取与分离
      1. 向OS-CSCs的冷冻细胞沉淀样品中加入1 ml裂解试剂，通过反复吹打沉淀数次，在离心管中直接裂解细胞。
      2. 在 4 ℃ 条件下以 12,000 x g 离心 1 分钟 °C. 轻轻移除上清液。将上清液转移至新离心管中，加入 200 µL 氯仿，盖紧管盖。剧烈振荡试管 15 秒，室温孵育 5 分钟。
      3. 在 4 ℃ 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟 °C. 混合物会分离成三个不同的相，RNA 仅存在于无色的上层水相中。
      4. 特别小心地移除水相，并将该相转移至新管中以进行RNA提取。加入500 µ向含有水相的离心管中加入 L 异丙醇。用手轻轻摇动离心管。在室温下孵育样品 10 分钟。在 4 ℃ 条件下以 12,000 x g 离心 10 分钟 °C.
        注意： 样品离心后，可见管壁及管底形成凝胶状沉淀的RNA。
      5. 从离心管中移除上清液，注意保留管底的RNA沉淀。向管中加入1 ml 75%乙醇。用手轻轻涡旋振荡管子数秒，然后在4℃条件下以7500 × g离心5分钟。 °C.
      6. 弃去乙醇，将RNA沉淀在空气中干燥。沉淀干燥后，用无RNase的水（10 - 50）重新悬浮RNA沉淀。 µL）通过反复吹打溶液数次。
      7. 通过分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光度，确定RNA的产量和纯度。在标准1%琼脂糖凝胶上评估总RNA的完整性。将RNA于-80℃保存。 °C.
    2. 逆转录聚合酶链式反应
      1. 使用逆转录试剂盒，从500 ng RNA样品中合成第一链cDNA。将RNA样品置于冰上解冻，试剂盒中所需的溶液于室温解冻。按照制造商提供的操作步骤进行cDNA合成。
    3. 半定量反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
      1. 使用 1 进行所有 PCR µ每个样品以 24 μL 最终反应体系中的 cDNA 作为模板 µL. 使用下表所列的引物序列 表1 用于扩增 Nanog、Oct 3/4、SOX2 和 CD133 基因。
      2. 使用1.8%琼脂糖凝胶电泳分离RT-PCR产物，溴化乙锭染色后，在紫外光下拍照。

结果

通过针吸活检或手术切除少量肿瘤组织获得的骨肉瘤（OS）样本（图1A, B）允许仅分离一个OSA，前提是严格按照方案部分所述进行处理。图2A, B）。遗憾的是，从活检组织中分离得到的细胞数量较少，回收率范围为30–50%。回收率取决于活检组织的类型和尺寸（图5A, B）。这些细胞必须经过精确处理。因此，原代培养物需要大约一个月的时间才能在100 mm培养皿中达到汇合状态。在此之后，从两个标记为OSA5和OSA6的骨肉瘤样本中获得成骨肉瘤细胞（OSA）。图6A、B）。然后需要对原代细胞系进行传代培养，以获得足够数量的细胞用于表征分析，并对细胞系进行冻存。在第3代rd 传代培养时，当两种骨肉瘤原代细胞系均达到汇合状态，将其接种于6孔超低吸附培养板中进行肉瘤球形成实验。选用此类培养板的原因在于其可使细胞保持悬浮状态，避免干细胞因贴壁而发生分化，抑制依赖贴壁生长的细胞分裂，并最终减少细胞对基质的黏附。因此，该培养条件可为肿瘤细胞创造一种应激环境，这对于筛选肿瘤干细胞（CSCs）至关重要。实验开始24小时后，细胞呈现彼此分离的状态（图7）。在监测实验进程7天后，已开始形成微小的球形克隆，肉眼可见。图8。在第28天，可观察到每个孔中已形成多个较大的球形克隆（图9A, B在肌球囊培养28天后，可分离这些大型球形克隆。 图10 展示从6孔超低吸附培养板中分离肌球体并在贴壁条件下重新培养的步骤。 图11 显示分离后漂浮的球形克隆。在正常贴壁培养板中接种的大型球形克隆在分离后表现出贴壁扩展（图12A, B）。从单个肌球体扩增出的细胞可能是具有干细胞样表型的癌细胞。因此，在分离后很可能获得了骨肉瘤干细胞（OS-CSCs）。这些细胞被命名为OSA5-CSCs和OSA6-CSCs（图13A、B).

此时，有必要对上述获得的两条OS-CSC细胞系进行干细胞样表型的鉴定。干细胞样表型的鉴定分析在第4代细胞上进行。th OS-CSC细胞系的类球体分离后的传代培养。两个细胞系OSA5-CSCs和OSA6-CSCs均对间充质干细胞表面标志物（CD105和CD44）呈强阳性反应（图14A、B 和 图15A、B），而对间充质干细胞表面标志物Stro-1呈中等程度阳性 （图16A，B））。我们的观察结果已通过使用商业化的分化结肠癌细胞系 HCT8 获得的阴性结果得以证实（图14C，图15C，图16C在HCT8细胞系中，这些表面标志物的特异性和非特异性染色均完全缺失。

为了评估两种骨肉瘤肿瘤干细胞（OS-CSCs）的间充质干细胞（MSC）表型，我们还进行了流式细胞术分析。两种OS-CSC细胞系均高表达CD44和CD105。然而，两个细胞系中仅有1.14%的细胞表达Stro-1。因此，该结果证实了免疫荧光染色所显示的Stro-1呈中等程度表达。相比之下，OSA5-CSCs中有99.62%的细胞表达CD44，其中87.38%表达CD105；OSA6-CSCs中有99.88%的细胞表达CD44，其中95.79%表达CD105。此外，两个细胞系均不表达CD45（CD45-）。

我们通过RT-PCR检测了3种胚胎干细胞标志物（Nanog、Oct 3/4、Sox2）以及另一种肿瘤干细胞标志物CD133基因的表达。结果表明，这些基因在两种OS-CSC细胞系中均有表达（图17）。成脂和成骨分化实验显示，分离得到的两种OSA-CSC细胞系均具有向成骨细胞（图18A - D 和 图19A - D）以及脂肪细胞（图20A - D）分化的潜能。

此外，菌落形成单位（CFU）实验（图21）显示，OSA5-CSCs 的克隆形成效率为 13%，OSA6-CSCs 为 14%，克隆形成效率良好。近年来多项研究表明，ALDH 活性高水平是多种癌症的特征之一。该参数可作为肿瘤干细胞的标志物，并与不良预后相关。ALDH 活性检测结果显示，两种 OS-CSC 细胞系均具有较高的 ALDH 活性（图22），而在本实验中作为阴性对照的成纤维细胞系中，ALDH 活性处于可定量检测的最低水平。

显示培养基中细胞生长比较的样品A和B的培养皿实验。
图1. 骨肉瘤活检样本示例。（A）通过针吸活检获得的样本。（B）通过手术切除部分肿瘤获得的活检样本。请点击此处查看该图的放大版本。

使用镊子进行细胞培养操作（A）和显微镜图像显示样品细节（B），实验室实验。
图 2. 骨肉瘤样本的机械解离。（A）使用 Perry 镊子和采血针对样本进行切割破碎。（B）碎片悬浮于 CM 中（箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

用于蛋白质纯化的色谱装置，带有注射器和试管架；实验方法。
图3. 分离肌球体所需的设备与耗材。（A）细胞分离所需的所有设备。1. 带有无菌膜过滤器支架的无菌注射器；2. 两种不同的培养基：GM 和 SCGM；3. 一支无菌玻璃巴斯德移液管。（B）安装在支架上的注射器细节图，显示膜过滤器支架。 请点击此处查看该图的放大版本。

滤器组装过程；实验室过滤组件及装置；显微可见细节。
图4. 过滤装置。 组装过滤装置所需的多个组件（A）（箭头所示为网状滤器）。网状滤器40 µm孔径的相差显微观察（箭头所示为一个孔）（B）。原始放大倍数：10X。已组装完成的过滤装置（C - D）。已灭菌的过滤装置（E）。 请点击此处查看该图的高清版本。

细胞培养对比；显微镜图像；左侧：细胞生长密集，右侧：细胞脱落。
图5. 传统骨肉瘤的原代细胞培养。 高级别骨肉瘤原代细胞培养的相差显微观察。在（A）中可见多个明亮的骨碎片，而在（B）中存在多个小而圆形且悬浮的红细胞。原始放大倍数：10X。标尺长度：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞培养比较；成纤维细胞的显微镜图像，高密度与低密度分析。
图6. 传统骨肉瘤有限细胞系（OSA）。 （A）OSA5 和（B）OSA6。相差显微镜观察。原始放大倍数：10X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示出芽的酵母细胞显微图像，突出细胞分裂和群体生长。
图 7. OSA5 和 OSA6 的肉瘤球体形成实验。 实验开始后 24 小时，细胞呈漂浮状态且彼此分离（箭头指示细胞位置）。采用相差显微镜观察。原始放大倍数：20X。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜下的晶体形成；放大图像，箭头指示形成的结构。
图8. OSA5 和 OSA6 在第7天的肉瘤球体检测。 检测开始7天后，可观察到多个被单个细胞包围的小型球状克隆。这些肉瘤球体（部分由箭头指示）呈悬浮于培养基中或轻微沉降至孔底的状态。采用相差显微镜观察。原始放大倍数：20X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞簇和结构的显微镜图像，可能显示聚集或生长模式。
图9. OSA5 和 OSA6 在第28天的肉瘤球体实验。 培养28天后，在每个OSA细胞系OSA5（A）和OSA6（B）的培养板各孔中均观察到多个较大的琥珀色肉瘤球体。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞培养实验，展示实验室中蛋白质纯化流程的建立。
图10. 肉瘤球分离的传代过程。 从6孔超低吸附培养板中分离肌球囊并将其在贴壁条件下重新培养的步骤如图所示。 （A） 用于分离所需的所有设备： 1. 一个6孔超低吸附板，每孔中均形成肌球状体，2. 带网状滤器的注射器，3. 移液器，4. 1,000 µL 无菌枪头，5. 2 把无菌 Perry 镊子，6. 2 种不同的培养基，7. 无菌巴斯德吸管，8. 培养皿。B) 收集肌球体。使用移液枪和无菌吸头收集每个孔中的培养基 1,000 µL 尖端。 (C) 用注射器收集悬浮液。将收集的悬浮液转移至注射器中，以利用膜过滤器支架开始自然过滤过程。D) 自然过滤。（E）将膜滤器从注射器上拆下。当所有悬液过滤完毕后，将滤器拆开并放入培养皿中；F) 拆卸膜过滤器支架。肉瘤球存在于网状过滤器支架内网状过滤器的孔隙中，因此必须使用Perry镊子将其取出。G，H) 从膜滤器上移除肌球囊。 请点击此处以查看此图的放大版本。

微生物显微镜图像；突出显示细胞结构和荧光可视化。
图11. 肉瘤球的分离。 分离得到的肉瘤球漂浮在60 mm培养皿的培养基中。采用相差显微镜观察。原始放大倍数：40X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜下的细胞生长比较；实验显示样品A和B的结构差异。
图12. 分离后的肉瘤球。 OSA5（A）和OSA6（B）细胞系在分离后48小时，重新接种并在贴壁条件下以单层形式再培养，开始贴壁扩增时的肉瘤球形态。采用相差显微镜观察。原始放大倍数：20X。标尺长度：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

干细胞培养显微镜图像；A：未刺激；B：分化启动。
图13. 分离后第7天的肉瘤球。OSA5（A）和OSA6（B）细胞系来源的肉瘤球在分离后第7天重新接种并在贴壁条件下以单层培养时，表现出贴壁生长和扩增。采用相差显微镜观察。原始放大倍数：20X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示细胞形态的荧光显微镜图像；成纤维细胞中绿色的肌动蛋白纤维，红色的细胞核。
图14. CD105的免疫荧光染色。 OSA-CSC细胞系OSA5-CSCs（A）和OSA6-CSCs（B）以及作为阴性对照的连续细胞系HCT8（C）中CD105的免疫荧光染色结果。激光共聚焦显微镜（LSCM）常规颜色显示：CD105为绿色，细胞骨架为红色。原始放大倍数：10X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜下的细胞；免疫染色方法，显微镜图像 A-C，细胞结构
图15. CD44的免疫荧光染色。 对OSA-CSC细胞系OSA5-CSCs（A）和OSA6-CSCs（B）以及连续培养细胞系HCT8（C）进行CD44免疫荧光染色，其中HCT8用作阴性对照。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）以常规颜色显示：CD44为绿色，细胞骨架为红色。原始放大倍数：10X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜；用标记物标记的细胞培养物；红色和绿色荧光标签。
图16. Stro1的免疫荧光染色。 对OSA-CSC细胞系OSA5-CSCs（A）和OSA6-CSCs（B）以及作为阴性对照的连续细胞系HCT8（C）进行Stro-1的免疫荧光染色。激光共聚焦显微镜（LSCM）采用常规颜色显示：Stro-1为绿色，细胞骨架为红色。原始放大倍数：10X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示蛋白水平的Western印迹分析：Nanog、Oct3/4、Sox2、CD133、Beta-Actin。
图17. 核心胚胎干细胞标志物及CD133基因的表达。 RT-PCR结果显示OSA5-CSCs（A）和OSA6-CSCs（B）中Nanog、Oct3/4、Sox2及CD133的表达情况。请点击此处查看该图的放大版本。

OSA5、OSA6-CSCs 分化过程、显微镜图像、0-10天、细胞变化分析。
图18. 成骨分化检测——ALP染色。 通过Fast Blue BB法进行ALP细胞化学染色，检测OSA5和OSA6-CSCs在诱导0天（A, B）和诱导10天后（C, D）的成骨分化情况。蓝色显示ALP阳性细胞，红色为碘化丙啶复染的细胞核。图像为明场与荧光显微镜下的合并观察结果。原始放大倍数：20X。标尺长度：100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

癌干细胞在0天和20天的显微镜图像，显示随时间推移的细胞变化。
图19. 成骨分化检测 - HA。 通过茜素红S对羟基磷灰石（HA）进行细胞化学染色，在诱导0天（A, B）和20天后（C, D）观察成骨分化情况。细胞呈蓝/灰色对比，颗粒状的HA沉积物呈红色。采用相差显微镜观察。原始放大倍数：40X。标尺长度：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

OSA5-CSCs 和 OSA6-CSCs 分化，0 天和 14 天，细胞形态学分析，显微镜图像。
图 20. 成脂分化实验。 通过油红 O 细胞化学染色检测诱导 0 天（A, B）和 14 天（C, D）后的成脂分化情况。红色显示脂质囊泡（较大的囊泡由黑/红箭头指示；较小的囊泡由白/黑箭头指示）；蓝色/紫色为苏木精复染的细胞核。明场观察。原始放大倍数：40X。标尺长度：100 µM。 请点击此处查看该图的放大版本。

细菌在琼脂平板上的菌落生长；微生物实验；培养分析；培养皿。
图 21. 菌落形成单位（CFU）检测。 经甲苯胺蓝染色的 OSA-CSC 细胞系的菌落形成单位（CFU）检测结果。请点击此处查看该图的放大版本。

显示细胞中ALDH活性的柱状图；OSA5-CSC高于OSA6-CSC；统计分析。
图22. ALDH活性检测。 ALDH比色法检测到两种OS-CSC细胞系（OSA5-CSC和OSA6-CSC）中均具有较高的ALDH活性，而在有限增殖的成纤维细胞系FIB中则未检测到该活性。误差线：SD。**：与FIB相比，p < 0.001；*：与FIB相比，p < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。

基因寡核苷酸序列 (5¹-3¹)扩增子大小 (bp)Tₐ (°C)
Nanog正向引物                反向引物CCCAGCTGTGTGTACTCAAT GGTTCAGGATGTTGGAGAGTT8760
Oct 3/2正向引物                反向引物GGGAGGAGCTAGGGAAAGA TCCTTCCTTAGTGAATGAAGAACT7760
Sox2正向引物                反向引物TGCAGTACAACTCCATGACC  GGACTTGACCACCGAACC12555
CD133正向引物                反向引物CCAGAAGCCGGGTCATAAAT  ATTCACTCAAGGCACCATCC12756
bp，扩增子大小的碱基对；Tₐ，退火温度

表1. Nanog、Oct 3/4、Sox2 和 CD133 的引物序列详细列表，包含扩增片段大小和退火温度

讨论

CSC 具有多种特性，使其能够在肿瘤组织中被识别出来。基于这些特性，例如由于 ATP 结合盒多药耐药外排转运蛋白的过表达28, 32, 33，或由于解毒酶（如 ALDH）表达上调32而获得对细胞毒性化疗药物的耐药性，以及特定表面标志物（如 CD133、CD44、CD34、CD90 等）的表达30, 34, 35, 41，目前已开发出多种分离 CSC 的不同方法42-44。其中一种技术是成球实验，该方法基于 CSC 在非贴壁条件下生长的能力。

组织干细胞和肿瘤干细胞形成球体的能力最早由Reynolds等人在鉴定神经干细胞的研究中描述。37随后，Gibbs 等人38 利用这些研究，我们开始从实体瘤中分离肿瘤干细胞（CSCs），特别是从骨肉瘤中分离。我们决定采用吉布斯（Gibbs）所展示的成球实验方法 等 从常规骨肉瘤活检获得的OSA细胞系中分离出肿瘤干细胞（CSCs）。我们对原始方法进行了改进，以优化本实验的结果，并提高其在其他癌细胞系中的可重复性。在建立成球实验时，我们验证了每孔接种40,000个细胞是确保实验初期细胞保持分离状态的有效做法。这一操作至关重要，可避免球形克隆来源于细胞聚集，而非单个CSC在非贴壁条件下特有且独有的增殖成球能力。该能力正是本实验的一个关键核心环节。

我们还证实，为了获得良好的球体形成率，每3天 更换一次生长因子即可，无需如原始方法所述每天更换。在本研究中，我们还建立并详细描述了一种良好的方法，用于分离在非黏附条件下培养时形成的球状克隆。该步骤在本实验中至关重要，因为必须尽可能完整地分离出每个孔中形成的所有球体，同时避免对其造成损伤。此外，仅分离球体而避免混入单个细胞也非常重要，因为单个细胞可能在整个实验过程中保持悬浮状态。为克服这些关键问题，我们开发了一种特殊的分离方法，如上所述，该方法在肿瘤干细胞（CSC）分离中取得了良好的效果。显然，并非所有形成的球体都能被完全回收，但损失比例极低。实际上，我们还可以在球体长大后（约形成 100–200个细胞）使用孔径为40 µm的滤网进行分离。

这种分离可阻止类球体形成，但允许单细胞、甲基纤维素残留物以及最小的类球体通过滤膜。该去除步骤按照方案中所述，通过充分过滤完成。

此外，通过40 µm的筛网筛选出最大的球形克隆，同时丢失较小的球形克隆，可富集具有最强球形克隆形成能力且干性更强的肿瘤干细胞（CSCs）。上述所有改进均旨在优化实验方法，帮助研究CSC的研究人员理解并重现球形克隆形成实验原始方法中最关键的步骤。

关于这些研究中的 体外 分离CSCs的方法，本研究旨在展示这种改良的成球实验如何成为从OSA细胞系中分离CSCs的有效方法。对原始方法的改进以及所描述的详细分离技术提高了其效率。在较短时间内即可获得足量的CSCs，并可用于多项实验。因此，能够快速验证干细胞样表型，特别是研究表征OS-CSCs的双重干细胞样表型。因此，这种改良的实验方法可能是分离CSCs并研究其生物学特性的有效技术。未来，该方法经过进一步优化后，也可能用于从其他通过罕见实体瘤活检获得的有限癌细胞系中分离CSCs。

从骨肉瘤（OS）等罕见实体瘤中分离出肿瘤干细胞（CSCs）的可能性，不仅有助于推进对该特定癌症的研究，还可拓展至对不同类型癌症的研究，以开发更优的分离方法，并为未来研究这一重要细胞亚群的生物学特性奠定基础。因此，正如本研究所做的那样，通过深入研究CSC的生物学特性来改进其分离方法至关重要，最终目标是发现分子靶点，并开发出针对这一特定细胞亚群的高度特异性抗癌疗法——该细胞亚群很可能负责维持原发肿瘤、导致肿瘤复发以及在多个器官中引发转移。对CSC生物学特性的研究对于寻找能够有效治疗某些预后极差癌症的疗法也具有重要意义，例如在新辅助治疗后生存率仍然很低的骨肉瘤（OS）。

披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本研究由 ITT（托斯卡纳肿瘤研究所）2010 年资助项目支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含钙杜氏磷酸盐缓冲液2+ 和 Mg2+ （DPBS）LONZABE17-513F_
杜氏磷酸盐缓冲液  无钙2+ 和 Mg2+ （DPBS）LONZABE17-512F_
猪胰蛋白酶 1:250BD Difco215310溶剂：DPBS。储存浓度：粉末
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）Sigma-AldrichE4884溶剂：DPBS。储存浓度：粉末
产气荚膜梭菌胶原酶Sigma-AldrichC0130溶剂：缓冲液，pH 7.4。储存浓度：粉末
二甲基亚砜（DMSO）BDH Chemicals-VWR10323_
Ham/F-12 营养混合物Sigma-AldrichF6636溶剂：超纯 dH₂O2O. 储备液浓度：粉末
2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐Sigma-Aldrich49752溶剂：DPBS。储存浓度：5 mg/mL
β二钠盐五水合甘油磷酸酯Sigma-Aldrich50020溶剂：DPBS。储存浓度：1 M
胰岛素，人重组Sigma-Aldrich91077溶剂：0.1 M NaOH。储备液浓度：10 mM
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma-AldrichI5879溶剂：DMSO。储备液浓度：500 mM
吲哚美辛Sigma-AldrichI7378溶剂：DMSO。储备液浓度：200 mM
地塞米松Sigma-AldrichD4902溶剂：DMSO。储备液浓度：  1 mM / 100 µM. 用液氮保存以维持生物活性
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524_
南美洲胎牛血清 EUROCLONEECS0180L_
青霉素-链霉素（PEN-STREP）10,000 U/mLLONZADE17-602E_
甲基纤维素Sigma-Aldrich274429溶剂：超纯 dH₂O2O. 储存液浓度：2%
腐胺二盐酸盐Sigma-AldrichP5780溶剂：超纯 dH₂O2O. 储备液浓度：粉末
脱铁转铁蛋白 Sigma-AldrichT-1147溶剂：DPBS。储存浓度：25 mg/mL
人表皮生长因子（EFGF）Sigma-AldrichE5036溶剂：DPBS，pH 7.4。储存浓度：10 µg/mL
碱性成纤维细胞生长因子 人Sigma-AldrichF0291溶剂：DPBS + 0.2% BSA。储存浓度：25 µg/mL
亚硒酸Sigma-Aldrich211176溶剂：DPBS。储存浓度：30 mM
孕酮Sigma-AldrichP8783溶剂：ETOH。储存浓度：10 mM
甲苯胺蓝 OSigma-Aldrich198161溶剂：超纯 dH₂O2O. 储备液浓度：粉末
油红OICN Biochemicals155984溶剂：2-丙醇。储存浓度：粉末
萘酚AS-MX磷酸二钠盐Sigma-AldrichN5000溶剂：DMSO。储存浓度：粉末
Fast Blue BB 盐Sigma-AldrichF3378溶剂：Tris HCl，pH 9.0。储存浓度：粉末
Fast Red Violet LB 盐Sigma-AldrichF3381溶剂：Tris HCl，pH 9.1。储存浓度：粉末
牛血清白蛋白，第五组分（BSA）Sigma-AldrichA-4503溶剂：DPBS。储备浓度：2%
茜素红SICN Biochemicals100375溶剂：超纯 dH₂O2O. 储备液浓度：粉末
甲醛溶液Sigma-Aldrich5339984%
Triton-100X默克11869溶剂：DPBS。储存浓度：0.2%。危险——仅可在化学通风橱中使用
钙黄绿素默克2315溶剂：DPBS。储备浓度：200 µg/mL
2-丙醇默克109634危险——仅可在化学通风橱中使用
Ab-CD105                                                    （小鼠单克隆抗体 [SN6] 针对 CD105（FITC））Abcamab11415液体。应用：               流式细胞术（Flow Cyt）
Ab-CD44                                       （小鼠单克隆）             [F10-44-2] 至 CD44（PE/Cy7）®) )Abcamab46793液体。应用：               流式细胞术（Flow Cyt）
Ab-CD45                                              （小鼠单克隆）             [MEM-28] 至 CD45（PerCP） Abcamab65952液体。应用：               流式细胞术（Flow Cyt）
Ab-CD105                                                    （人CD105纯化抗体） InvitrogenMHCD10500溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）
Ab-CD44                                       （抗CD44抗体） AbcamEPR1013Y(ab51037)溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）
Ab-Stro-1                                   （小鼠抗STRO-1） Invitrogen398401溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：               流式细胞术（Flow Cyt）       免疫荧光染色（IF）
Alexa Fluor 488             （抗兔IgG（Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG（H+L）））InvitrogenA-21206溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）
FITC 抗小鼠 Ig（FITC-兔抗小鼠 IgG（H+L））Invitrogen61-6511溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：               流式细胞术（Flow Cyt）       免疫荧光染色（IF）
Alexa Fluor 635 鬼笔环肽 InvitrogenA34054溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）
AutoMACS™MACS分离缓冲液Miltenyi130,091,221液态。4℃保存 °C
QIAzol®裂解试剂QIAGEN79306危险——仅可在化学通风橱内使用
QUANTITECT®                             逆转录试剂盒QIAGEN205314_ 
氯仿Sigma-AldrichC2432液体。危险——仅可在化学通风橱中使用
层流罩GELAIREBSB6A_ 
化学通风橱技术设备                             别墅模型                                                      DYNAMICA_ 
离心EPPENDORF5415R_ 
激光扫描共聚焦显微镜 LSM 5109 Meta ZEISS_ _ 
iCycler PCR 扩增仪 BIORAD_ _ 
CyFlow®太空 (PARTEC)_ _ 
倒置显微镜 Axiovert 200M ZEISS_ _ 
冻存盒Nalgene_ _ 
Original Pipet-AidpbiBrand_ _ 
微量移液器EPPENDORF_ _ 
巴斯德玻璃吸管SIGMA_ _ 
VICTOR3™                      珀金埃尔默_ _ 
锥形管                         （15 和 50 mL）                            BD FALCON352096（适用于15 mL）          352070（50 mL装）_ 
24孔透明平底TC处理多孔细胞培养板BD FALCON353047_ 
6孔透明平底超低吸附多孔板CORNING3471_ 
血清移液管                    （5 和 10 mL）                                          BD FALCON357543（5 mL装）              357551（10 mL装）_ 
注射器（5 mL）                             B|BRAUN4617053V_ 
培养皿 100×20 mm             BD FALCON353003_ 
Röhren 管                     (3.5 mL，55×12 mm，PS)               SARSTEDT55,484_ 
培养皿 60×15 mm                BD FALCON353004_ 
1.5 mL 冻存管            NALGENE5000-1020_ 
25 cm 细胞培养瓶²      BD FALCON353014_ 
尼龙网滤膜，亲水性MERCKNY4104700_ 
斯温内克斯滤器支架MERCKSX0002500_ 
佩里镊子 _ _ _ 
柳叶刀_ _ _ 
邓斯匀浆器___

参考文献

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