我们提出一种基于生物胶原支架的三维（3D）肺癌模型，用于研究非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗的敏感性。我们展示了多种检测技术，以确定细胞增殖指数、凋亡以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）状态。所获得的数据被整合到一个in silico模型中，用于预测药物敏感性。
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方法文章
一种联合三维组织工程 体外/计算机模拟 用于预测特定突变背景下药物有效性的肺癌模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在本研究中，我们结合了一种 体外 带有3D肺肿瘤模型的 计算机模拟 基于特定突变背景优化药物反应预测的模型。该模型构建于脱细胞猪源支架上，可再现细胞外基质组成及结构（包括基底膜）等组织特异性特征。我们建立了一项标准化方案，可在14天内完成人工肿瘤组织的构建，并包含3天的药物处理。本文提供了多种三维读出筛选技术的详细描述，如通过Ki67染色测定增殖指数、利用M30-ELISA法检测上清液中的凋亡指标，以及对 上皮-间质转化 （EMT），这些是评估治疗性化合物有效性的有用工具。与2D培养相比，我们能够在3D肿瘤模型中观察到增殖减少，这与临床情况相关。尽管增殖水平较低，该模型仍能预测 EGFR根据生物标志物状态准确预测靶向药物反应，如肺腺癌细胞系HCC827的比较所示（EGFR -突变的， KRAS 野生型）和 A549（EGFR 野生型 KRAS-突变体）经处理后 酪氨酸激酶抑制剂 （酪氨酸激酶抑制剂）吉非替尼。为研究更晚期肿瘤细胞的药物反应，我们通过长期使用TGF-beta-1处理诱导上皮-间质转化（EMT），并利用波形蛋白/广谱细胞角蛋白免疫荧光染色进行评估。采用流动生物反应器使培养条件接近生理状态，从而改善了组织生成。此外，我们展示了在吉非替尼处理或TGF-beta-1刺激下，将细胞凋亡、增殖指数及EMT等药物反应整合至布尔 in silico 模型。此外，我们阐述了如何预测具有特定突变背景的肿瘤细胞对药物的反应，以及针对耐药性的应对策略。我们相信，这种3D 体外 方法尤其适用于其 计算机模拟 扩增技术为临床前药物测试提供了额外价值，其测试条件比二维细胞培养更接近真实情况。
引言
制药行业在癌症治疗领域的临床阶段面临高达95%的高淘汰率，导致巨额成本 1-5造成这一不足的原因之一在于，目前潜在新化合物的药效评估主要依赖于对癌细胞系的二维细胞培养进行大规模筛选，或依赖于动物模型。动物模型虽具有更高的复杂性，但小鼠与人类之间存在关键差异。 6,7在过去的十年中，已采用不同方法构建了三维癌症模型，以弥合癌细胞系的二维培养与复杂肿瘤环境之间的差距 体内 肿瘤 6,8,9三维环境对细胞分化及信号传导的影响已在多年前的多项研究中得到证实（例如，由 Mina Bissell 提出） 10,11目前，已有多种3D细胞培养模型可供使用，例如球状体培养、水凝胶或微流控芯片。 12-16尽管这些模型相较于传统的二维培养系统提高了复杂性，但大多缺乏已知具有促肿瘤作用并影响药物疗效的组织微环境。
为了解决这一问题，我们基于一种名为SISmuc的生物支架构建了三维肿瘤模型（小肠黏膜下层＋黏膜源自脱细胞猪空肠的组织支架，从而保留了细胞外基质的组织结构及重要组分，如多种胶原蛋白以及基底膜结构 17这一独特特性对于源自上皮组织并占实体瘤约80%的癌瘤模型构建至关重要。此外，与二维培养中人为偏高的增殖速率相比，我们所构建的组织工程肿瘤模型中的增殖速率有所降低。由于增殖是评估药物疗效的重要参数，本模型可实现更接近生理条件的药物测试 体内 肿瘤 17.
为了评估我们的模型正确预测生物标志物依赖性药物疗效的潜力，本文提供了两种不同肺癌细胞系的数据，这两种细胞系的EGFR生物标志物状态不同。这种突变状态目前已开始在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中常规检测。针对携带激活型EGFR突变的肿瘤，使用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如EGFR抑制剂吉非替尼进行靶向治疗，其疗效优于基于铂类的化疗18-21。
我们建立了多种与评估化合物功效相关的检测技术。此外，在TGF-beta-1刺激后，我们能够研究化合物对已启动上皮-间质转化（EMT）过程的肿瘤细胞的作用，该过程被认为是恶性转化的重要步骤22,23，并与药物耐药性相关24。
三维肿瘤模型能够以良好的对比度监测细胞对靶向治疗、化疗或药物组合的特异性反应。为进一步增强并加快药物筛选进程，同时应对耐药性问题，该模型结合了in silico（计算机模拟）分析。基于少量实验数据，可利用in silico方法预测肿瘤对一系列药物及其组合治疗方案的反应结果。
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方案
1. 二维（2D）细胞培养
- 从DSMZ商业获取肿瘤细胞系HCC827。在添加20%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基中培养肺腺癌细胞系HCC827（EGFR突变型，KRAS野生型）。每2至3天更换一次培养基，每周传代两次。细胞使用至第20代为止。
- 从DSMZ商业获取肿瘤细胞系A549。在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基中培养肺癌细胞系A549（EGFR野生型，KRAS突变型）。培养操作同上。细胞使用至第20代为止。
- 定期（每4至6周）检测细胞是否存在支原体等污染。
- 在玻璃盖玻片上培养A549或HCC827细胞
- 使用镊子将1片无菌玻璃盖玻片放入24孔板的每个孔中。
- 分别在含有玻璃盖玻片的孔中接种两种细胞系各50,000个肿瘤细胞，接种体积为500 µl。
- 在标准培养条件（37 °C；5% CO2）下培养细胞，直至细胞融合度达到70%。在此期间，每隔2至3天用巴斯德吸管吸除旧培养基，并加入500 µl新鲜培养基。
2. 在生物胶原支架上构建肿瘤测试系统
- 静态培养条件
- 制备脱细胞小肠黏膜下层加黏膜（SISmuc），并如先前文献所述25，将其固定在两个金属环之间，即所谓的细胞环（cell crowns）。
- 将100,000个HCC827或A549细胞，以总体积500 µl接种至固定在细胞环中肠组织原腔面一侧。
- 在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，使肿瘤细胞贴壁。在细胞环内加入1 ml培养基，外侧加入1 ml培养基。
- 将肿瘤模型置于培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下静态培养14天，每2–3天更换一次培养基。操作时，使用巴斯德吸管吸除原有培养基，向细胞环内加入1 ml含适当浓度FCS的新鲜RPMI培养基（A549：10%，HCC827：20%），外侧加入1.5 ml相同培养基。
- 动态培养条件
- 按照第2.1.1至2.1.3小节所述方法，将脱细胞基质置于细胞环内并进行细胞接种，建立肿瘤测试系统。
- 将肿瘤模型在培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下静态培养3天。
- 组装已高压灭菌的生物反应器，并如先前发表的方法25将接种了细胞的SISmuc插入其中。
- 向培养瓶中加入45 ml含适当浓度FCS的RPMI培养基（A549：10%，HCC827：20%），并将无针取样装置连接至生物反应器与培养基瓶之间的管路系统。
- 将生物反应器放入培养箱，连接至泵，以恒定流速（3 ml/min）在37 °C、5% CO2条件下继续培养肿瘤模型14天。
- 在培养第7天更换全部培养基。操作时，将生物反应器从培养箱转移至超净工作台，使用巴斯德吸管吸除培养瓶中的培养基。在吸除过程中抬起生物反应器，以排空管路系统中的残留培养基。随后向培养瓶中加入45 ml新鲜培养基，将生物反应器放回培养箱并重新连接至泵。
3. 吉非替尼对静态肿瘤模型的处理
- 按照第2.1节所述方法培养肿瘤模型。
- 在培养的第11天，配制含1 µM吉非替尼的RPMI/FCS培养基（每 inserts 需2.5 ml）。使用巴斯德吸管吸除孔中旧培养基，向 inserts 内加入1 ml新配制的RPMI/FCS/吉非替尼培养基，inserts 外侧加入1.5 ml相同培养基。
注意：解冻后的吉非替尼储备液可在4 °C保存一周。 - 在第13天按照3.2小节所述方法更换培养基。
4. 使用TGF-beta-1刺激静态肿瘤模型以诱导EMT
- 按照第2.1节所述方法培养肿瘤模型。
- 在培养的第3天，用含载体的RPMI/FCS培养基配制含2 ng/ml TGF-beta-1的溶液（每个细胞环需2.5 ml）。使用巴斯德吸管吸除孔中旧培养基，向细胞环内加入1 ml上述配制的RPMI/FCS/TGF-beta-1培养基，环外加入1.5 ml相同培养基。自第3天起，每2–3天更换一次含TGF-beta-1的培养基，直至第14天，具体操作见4.2节。
5. 检测指标
- 用于ELISA检测的取样方法
- 在培养的第11至14天，按照第3节中吉非替尼处理的指示，分别从静态（第2.1节）和动态（第2.2节）培养的上清液中取样 图2此外，在治疗前（T0）采集样本。
- 在静态培养条件下，取 100 µl 从细胞冠部内侧取样。在动态培养条件下，将注射器旋接到取样装置上，从生物反应器系统中取出1 ml培养基。将所有收集的上清液储存在-80 °C。80 °C 直到进行ELISA检测为止。
- M30-ELISA 法用于细胞凋亡定量
- 为了定量上清液中的细胞凋亡，根据制造商说明书进行细胞死亡检测。在进行检测前，确保所有试剂均已升至室温。
- 涡旋混匀所有试剂。将洗涤片剂溶解于500 ml新鲜去离子水中。用9.2 ml结合物稀释缓冲液稀释HRP结合物，并混匀。移液 25 µl 每孔加入标准品或样品
- 添加 75 µl 每孔加入稀释的HRP缀合物溶液。盖上板子，在室温下于摇床上孵育4小时。手动洗板5次，使用 250 µl 已配制的洗涤液。
- 添加 200 µl 向每孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物。室温避光孵育20分钟。加入 50 µl 每孔加入终止液。将微孔板振荡10秒，室温静置5分钟后测定吸光度。使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度。采用适合处理ELISA数据的软件（如Origin）计算标准曲线及样品中目标物的浓度。
- 样品染色
- 3D模型的固定、石蜡包埋与切片制备
- 使用每孔细胞插件2.5 ml 4%多聚甲醛（PFA）固定接种的SISmuc，时长2小时，随后将其包埋于石蜡中
- 准备 3 µm 用于染色的组织切片，如先前已发表的方法所述 25.
- 二维培养条件下细胞的固定
- 当细胞在24孔板的玻璃盖玻片上生长至70%汇合度时，用PBS洗涤一次，并用 500 µl 每孔加入4% PFA，孵育10分钟。
- 去除PFA，将玻璃盖玻片置于含PBS的孔板中保存 4 °C 直到进行染色为止。
- H&E染色
- 根据标准方案，使用苏木精/伊红对复水后的切片进行常规染色以获得总体染色效果。
- 三维模型的免疫荧光染色
- 进行免疫荧光染色时，将脱蜡并复水的切片放入盛有预热柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的蒸汽锅中，加热20分钟以进行抗原修复。
注意：有关柠檬酸盐缓冲液的制备，请参见材料与设备表。 - 将切片转移至洗涤缓冲液（0.5 M PBS 缓冲液 + 0.5% Tween）中，用 PAP 笔圈出组织区域以减少染色液所需用量，并将切片置于湿盒中。
- 用5.3.4.6小节中所用二抗宿主物种的5%血清在室温下封闭组织切片20分钟。
- 轻轻将载玻片上的封闭血清甩至纸巾上，然后根据生产商说明书，将一抗抗体按相应稀释比例加入画圈区域（兔抗 Ki67 1:100，兔抗 vimentin 1:100，鼠抗 pan-cytokeratin 1:100）。4℃孵育过夜 4 °C进行双重染色时，必须使用来自不同宿主物种的一抗。
- 用洗涤缓冲液小心洗去未结合的抗体，每次5分钟，共洗三次。
- 为检测特定抗原-抗体结合，将二抗按1:400稀释后加入切片，室温孵育1小时。
- 用洗涤缓冲液洗涤三次，每次5分钟，以去除未结合的抗体。
- 使用含 DAPI 的水性封片剂封片以复染细胞核，并于室温下避光过夜干燥。
- 进行免疫荧光染色时，将脱蜡并复水的切片放入盛有预热柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的蒸汽锅中，加热20分钟以进行抗原修复。
- 二维培养细胞的免疫荧光染色
- 移除 PBS，加入含 0.2% Triton-X100 的 PBS 溶液覆盖接种有细胞的玻璃盖玻片，孵育 5 分钟以进行透化处理。用洗涤缓冲液（0.5 M PBS 缓冲液 + 0.5% Tween）洗涤玻璃盖玻片 5 分钟。
- 执行步骤 5.3.4.3 至 5.3.4.7。所有步骤均在摇床上的孔板中进行，并通过倒置孔板去除试剂。
- 封片时，取一滴含DAPI的水性封片剂滴于未处理的载玻片上，用镊子将带有细胞的盖玻片转移至封片剂上，使细胞面朝向封片剂。待其干燥后进行成像。
- 3D模型的固定、石蜡包埋与切片制备
- 增殖指数的测定
- 根据第5.3.4节或5.3.5节进行Ki67免疫荧光染色。
- 使用倒置显微镜对组织切片或二维培养细胞进行荧光成像。针对DAPI染色和Ki67染色分别使用不同的滤光片进行图像采集。定量分析时，每种条件下选取标本非重叠区域的10张三维切片图像或5张二维培养图像（放大倍数20倍）。
- 确定二维条件下细胞核数量及Ki67阳性细胞核数量
- 使用 Fiji 软件的 Cell Counter 插件手动计数 Ki67 阳性细胞核 26因此，打开图像后，点击“Plugins” → “Analyze” → “Cell Counter”。按下“Initialize”按钮，并选择一种计数器类型。逐一点击每个Ki67阳性细胞核，点击次数将显示在所选计数器类型旁边。
- 使用 Fiji 软件创建宏以实现细胞核总数的自动计数 27,28根据每种染色方法和细胞系调整宏。以下为创建宏的示例。
- 启动宏记录器。打开一张DAPI图像，通过点击“图像” → “类型” → “8位”将其转换为8位格式。点击“增强对比度”，将“饱和度”设置为“1”，并进行归一化。
- 设置“非锐化掩膜”以增强图像清晰度，使用“1”的“半径”和“0.60”的“掩膜强度”。点击“自动阈值”，选择“RenyiEntropy”方法，并设置为“黑背景上的白对象”以对图像进行二值化处理。
- 点击“Plugins” → “BioVoxxel” → “watershed irregular features”，设置侵蚀半径为“5”以分离细胞。点击“Analyze” → “Analyze Particles”，并将“size”设置为“0.02-Infinity”。
注意：总结表中显示的颗粒/细胞数量以计数值表示。 - 单击“Create”以保存宏，用于进一步图像的分析。
- 根据第5.4.3.1小节所述方法，手动确定三维结构中细胞核总数及Ki67阳性细胞核数量。
- 根据以下公式计算平均增殖指数（PI）：
n = 图像数量（3D：10，2D：5）
6. 计算机模拟 肿瘤模型构建与抗肿瘤治疗模拟EGFR HCC827细胞中的治疗
- 使用网络分析软件生成网络
- 利用不同的已知数据库，基于HCC827细胞系的重要实验读出参数及其突变背景，构建肿瘤网络。
- 打开网络分析软件 21 以可视化该网络。
- 单击“文件” → “新建” → 输入“JoVE_tumor models” → 单击“确定”以生成新网络。单击“方形近北视图” → “确定”以在双层膜中可视化受体。单击“通用蛋白”以将节点（=蛋白）显示为矩形 → 输入“EGFR” → 单击“确定”；对网络中的每个节点重复此操作。
- 标记网络中的节点：右键单击 → “更改颜色” & 形状……” → 选择节点 EGFR 和 (EGF-EGFR)，颜色代码为“255,0,0”（红色）；节点 c-MET 和 (c-MET)，颜色代码为“0,255,0”（绿色）；gefitinib，颜色代码为“255,255,0”（黄色）；PI3K-Inh，颜色代码为“204,204,204”（浅灰色）；MEK-Inh，颜色代码为“102,102,102”（深灰色）；网络中所有其他节点，选择颜色代码“255,255,255”（白色）。
- 单击“表型”以六边形形式可视化读出参数 → 输入“proliferation” → 单击“确定” → 右键单击 → “更改颜色” & 形状……” → 选择颜色代码“255,204,204”（鲑鱼色）；对参数凋亡重复此操作 → 选择颜色代码“255,51,204”（紫色）。
- 可视化边（= 相互作用）：点击“State Transition”表示激活（箭头），点击“Inhibition”表示抑制（钝头箭头）；对网络中的每个相互作用重复此操作。
- 单击“文件” → “另存为…” → 输入“JoVE_tumor_models.xml” → 单击“保存”，以将生成的信号网络保存为 .xml 格式。
- 计算机模拟 使用 SQUAD 进行模拟
注意：SQUAD 将网络拓扑表示为离散的逻辑布尔系统（AND、OR、NOT），并进行稳态分析。稳态分析反映了系统的平衡状态及其对信号刺激的响应特性例如药物应用或突变- 开放 SQUAD 17 软件，点击“加载网络” → 上传“JoVE_tumor models.xml”文件。点击“运行分析”：
注意：接下来，SQUAD 对布尔网络的连接性应用指数函数进行插值，从而实现对网络行为随时间变化的动态模拟（彩色的S形活性曲线）。 - 点击“高级” → “扰动器”以编写模拟方案。模拟抗-EGFR 抗性：点击“编辑实验方案”
- 点击“perturbation” → 使用标准“initialstate=SS-4”（稳态4）→ 点击“Add”以添加“new Constant Pulse” → 选择参数“state” → 选择目标“FLIP” → 选择时间“0” → 选择数值“0.4” → 点击“OK”。
- 重复以下操作：点击“Add” → 选择参数“state” → 选择目标“c-MET” → 选择时间“0” → 选择数值“0.4” → 点击“OK”；点击“Add” → 选择参数“state” → 选择目标“gefitinib” → 选择时间“0” → 选择数值“1” → 点击“OK”。
- 将状态值设置为激活节点（EGF-EGFR）：点击“activenode” → 点击“Edit” → 选择状态“0.8” → 点击“OK”；对于所有其他节点：点击“Edit” → 选择状态“0” → 点击“OK”。点击“OK”以保存协议。
- 显示特定曲线：进入“选项”面板 → 选择“(EGF-EGFR)”、“*(EGF-EGFR)”、“*MEK”、“caspases”、“(c-MET)”、“PI3K”、“gefitinib”、“apoptosis”、“proliferation”、“MEK-Inh”和“PI3K-Inh”以进行图形化展示。点击“初始化” → “运行”以启动系统响应的完整模拟。点击“重置”以开始新的模拟。
- 模拟PI3K和MEK抑制剂联合处理：点击“编辑方案”
- 使用与6.2.2.1 - 6.2.2.3中所述相同的节点参数。点击“perturbation” → 点击“Add”添加“new Constant Pulse” → 选择参数“state” → 选择目标“PI3K-Inh” → 选择时间“0” → 选择值“1” → 点击“OK”；点击“Add”添加“new Constant Pulse” → 选择参数“state” → 选择目标“MEK-Inh” → 选择时间“0” → 选择值“1” → 点击“OK”。
- 单击“确定”以保存方案。进入“选项”面板：使用与6.2.2.4节所述相同的节点进行图形化表示。单击“初始化”→“运行”，以启动系统响应的完整仿真。单击“重置”以结束仿真。
- 开放 SQUAD 17 软件，点击“加载网络” → 上传“JoVE_tumor models.xml”文件。点击“运行分析”：
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结果
基于 SISmuc 支架（图2A至图2C），我们建立了一套标准化操作流程，用于构建、刺激及处理三维肿瘤检测系统（图 2D）。该模型可利用M30-ELISA测定增殖指数并定量凋亡，如图所示。 图1 和 图3分别。 图3 显示具有代表性的 H&A549 和 HCC827 模型的 E 染色以及使用吉非替尼的一项代表性凋亡检测。此处展示的模型是以上述示例为基础设计的 EGFR-突变的非小细胞肺癌（NSCLC），该类型在临床上可通过靶向抑制剂成功治疗。相应地，仅 EGFR-mutated HCC827 细胞对治疗有反应，而 A549 细胞无反应 EGFR 通过检测凋亡增加评估我们的模型中TKI吉非替尼的抑制作用。 图4 显示了我们的模型在经EMT诱导剂TGF-beta-1刺激后的一个代表性染色结果。在流动生物反应器中的动...
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讨论
我们已建立了一种联合方法 体外/计算机模拟 用于生物标志物指导治疗预测的肿瘤检测系统。 体外 模型可评估化合物作用的多个重要方面，例如在特定突变背景下肿瘤细胞增殖与凋亡的变化，该背景亦可进行模拟 计算机模拟17在此，我们介绍了用于生成三维肿瘤模型及进行化合物测试的标准化方案，包括细胞增殖与凋亡的定量分析，以及建立预测模型的方法 计算机模拟 模型。该三维肿瘤模型基于携带特定突变的肿瘤细胞系。细胞在去细胞化组织基质上的细胞环中培养。基质的去细胞化处理、在两个金属环（细胞环）之间固定、生物反应器系统的组装以及支架的接种等步骤此前已在JoVE中可视化展示。 25.
体外 3D 肿瘤模型
将本研究获得的结果转化至临床应用，需要谨慎选择携带特定突变的合适肿瘤细胞，以便根据生物标志物对患者进行分类，从而匹配相应的靶向药物。在分层医学中，通过下一代测序技术鉴定可靶向的驱动突变尤为重要，尤...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由维尔茨堡大学医院跨学科临床研究中心（IZKF，项目编号 BD247）和巴伐利亚适配计划（授予 Heike Walles）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物反应器 | 组织工程与再生医学讲席教授，Wü德国罗兹堡 | 生物反应器设置 | |
| BioVoxxel Toolbox（ImageJ / Fiji） | Jan Brocher，Thorsten Wagner，https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| 细胞冠 | 组织工程与再生医学讲席教授，Wü吕贝克（德国） | 用于静态三维培养 | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | 该软件用于绘制网络图。 |
| 柠檬酸盐缓冲液储备液（10倍浓缩） | 内部生产 | 42 g/L 柠檬酸一水合物，17.6 g/L 氢氧化钠颗粒溶于去离子水，pH 6.0，室温保存。 | |
| 柠檬酸盐缓冲液工作液 | 内部生产 | 10% 枸橼酸盐缓冲液储备液，溶于去离子水中，室温保存。 | |
| 柠檬酸一水合物 | VWR，达姆施塔特（德国） | 1002441000 | 用于柠檬酸盐缓冲液 |
| 盖玻片 | 德国达姆施塔特 VWR | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech，伯明翰（美国） | SBA-0100-20 | |
| KEGG、HPRD 和 QIAGEN（基因 &与通路） | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html；http://www.hprd.org/；https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | 采用了多种已知的文献数据库来构建网络拓扑结构。 |
| 女性鲁尔卡箍式三通接头 | Mednet, Münster（GER） | FTLT-1 | 生物反应器设置 |
| 带5/16内螺纹的雌性鲁尔接头样式" 六角转1/4-28 UNF螺纹 | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | 生物反应器设置 |
| 胎牛血清 | 生物&SELL，Feucht（德国） | FCS.ADD.0500 | 未热灭活 |
| 吉非替尼 | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM 储存液（溶于DMSO） |
| 玻璃烧瓶（Schott，GER），配有玻璃软管接头 | 韦克特，基钦根（德国） | 定制 | |
| Histofix 4%（多聚甲醛） | 卡尔·罗特，卡尔斯鲁厄（德国） | P087.1 | |
| 软管接头 | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | 生物反应器设置 |
| 生物反应器培养箱 | 组织工程与再生医学讲席教授，Wü德国罗兹堡 | 生物反应器设置 | |
| M30 CytoDeathTM 酶联免疫吸附测定 | Peviva，布罗马（瑞典） | 10900 | |
| 雄性鲁尔一体式锁环 | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | 生物反应器设置 |
| 保湿室 | 定制 | ||
| 小鼠抗广谱角蛋白 | Sigma-Aldrich，慕尼黑（德国） | C2562-2ML | 克隆 C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2，免疫荧光使用比例为1/100 |
| 无针可擦拭阀式鲁尔接头（雌性） | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | 生物反应器设置，用于取样，γ射线灭菌 |
| O型圈 MVQ 10 红色 37 × 3 mm | Arcus 密封元件，Seevetal（德国） | 21444 | 大号O形圈，生物反应器装置 |
| O型圈 MVQ 70 红色 27 × 2.5 mm | Arcus 密封元件，Seevetal（德国） | 19170 | 小O形圈，生物反应器装置 |
| PAP笔 | Dako，汉堡（德国） | S002 | |
| 石蜡 | 卡尔·罗特，卡尔斯鲁厄（德国） | 6642.6 | |
| 蠕动泵 | Ismatec，Wertheim-Mondfeld（德国） | 生物反应器设置 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich，慕尼黑（德国） | D8537-6x500ml | |
| 泵管盒 | Ismatec，韦尔泰姆（德国） | IS 3710 | 生物反应器设置 |
| 兔抗 Ki67 | Abcam，剑桥（英国） | ab16667 | 克隆 SP6，用于免疫荧光实验，稀释比例为 1/100 |
| 兔抗波形蛋白 | Abcam，剑桥（英国） | ab92547 | 用于免疫荧光，稀释比例为1:100 |
| RPMI-1640 培养基 | 生命技术公司，达姆施塔特（德国） | 61870-044 | 37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C |
| 硅胶管 | 卡尔·罗斯特有限责任公司，卡尔斯鲁厄（德国） | HC66.1 | 生物反应器设置 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | 用于柠檬酸盐缓冲液 |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | 该软件用于进行半定量模拟。 |
| 无菌空气滤器，孔径 0.2 µm | 赛多利斯斯泰迪姆生物技术公司，Gö德国蒂宾根 | 16596-HYK | 生物反应器设置 |
| 5 ml 注射器鲁尔锁扣 | BD 生物科学，海德堡（德国） | 309649 | 用于生物反应器取样 |
| 组织培养试验板：6-， 12孔、24孔、96孔 | TPP Techno Plastic Products AG，特拉萨丁根（德国） | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| 转化生长因子-β1（TGF-β1）含载体 | 细胞信号传导，德国法兰克福 | 8915LC | 无菌柠檬酸盐缓冲液（pH 3.0）中的储备液 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München（GER） | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München（GER） | P7949-500ml | 免疫荧光染色洗涤缓冲液 |
参考文献
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
- BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
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