我们提出一种基于生物胶原支架的三维（3D）肺癌模型，用于研究非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗的敏感性。我们展示了多种检测技术，以确定细胞增殖指数、凋亡以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）状态。所获得的数据被整合到一个in silico模型中，用于预测药物敏感性。
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方法文章
一种联合三维组织工程 体外/计算机模拟 用于预测特定突变背景下药物有效性的肺癌模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在本研究中，我们结合了一种 体外 带有3D肺肿瘤模型的 计算机模拟 基于特定突变背景优化药物反应预测的模型。该模型构建于脱细胞猪源支架上，可再现细胞外基质组成及结构（包括基底膜）等组织特异性特征。我们建立了一项标准化方案，可在14天内完成人工肿瘤组织的构建，并包含3天的药物处理。本文提供了多种三维读出筛选技术的详细描述，如通过Ki67染色测定增殖指数、利用M30-ELISA法检测上清液中的凋亡指标，以及对 上皮-间质转化 （EMT），这些是评估治疗性化合物有效性的有用工具。与2D培养相比，我们能够在3D肿瘤模型中观察到增殖减少，这与临床情况相关。尽管增殖水平较低，该模型仍能预测 EGFR根据生物标志物状态准确预测靶向药物反应，如肺腺癌细胞系HCC827的比较所示（EGFR -突变的， KRAS 野生型）和 A549（EGFR 野生型 KRAS-突变体）经处理后 酪氨酸激酶抑制剂 （酪氨酸激酶抑制剂）吉非替尼。为研究更晚期肿瘤细胞的药物反应，我们通过长期使用TGF-beta-1处理诱导上皮-间质转化（EMT），并利用波形蛋白/广谱细胞角蛋白免疫荧光染色进行评估。采用流动生物反应器使培养条件接近生理状态，从而改善了组织生成。此外，我们展示了在吉非替尼处理或TGF-beta-1刺激下，将细胞凋亡、增殖指数及EMT等药物反应整合至布尔 in silico 模型。此外，我们阐述了如何预测具有特定突变背景的肿瘤细胞对药物的反应，以及针对耐药性的应对策略。我们相信，这种3D 体外 方法尤其适用于其 计算机模拟 扩增技术为临床前药物测试提供了额外价值，其测试条件比二维细胞培养更接近真实情况。
引言
制药行业在癌症治疗领域的临床阶段面临高达95%的高淘汰率，导致巨额成本 1-5造成这一不足的原因之一在于，目前潜在新化合物的药效评估主要依赖于对癌细胞系的二维细胞培养进行大规模筛选，或依赖于动物模型。动物模型虽具有更高的复杂性，但小鼠与人类之间存在关键差异。 6,7在过去的十年中，已采用不同方法构建了三维癌症模型，以弥合癌细胞系的二维培养与复杂肿瘤环境之间的差距 体内 肿瘤 6,8,9三维环境对细胞分化及信号传导的影响已在多年前的多项研究中得到证实（例如，由 Mina Bissell 提出） 10,11目前，已有多种3D细胞培养模型可供使用，例如球状体培养、水凝胶或微流控芯片。 12-16尽管这些模型相较于传统的二维培养系统提高了复杂性，但大多缺乏已知具有促肿瘤作用并影响药物疗效的组织微环境。
为了解决这一问题，我们基于一种名为SISmuc的生物支架构建了三维肿瘤模型（小肠黏膜下层＋黏膜源自脱细胞猪空肠的组织支架，从而保留了细胞外基质的组织结构及重要组分，如多种胶原蛋白以及基底膜结构 17这一独特特性对于源自上皮组织并占实体瘤约80%的癌瘤模型构建至关重要。此外，与二维培养中人为偏高的增殖速率相比，我们所构建的组织工程肿瘤模型中的增殖速率有所降低。由于增殖是评估药物疗效的重要参数，本模型可实现....
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方案
1. 二维（2D）细胞培养
- 从DSMZ商业获取肿瘤细胞系HCC827。在添加20%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基中培养肺腺癌细胞系HCC827（EGFR突变型，KRAS野生型）。每2至3天更换一次培养基，每周传代两次。细胞使用至第20代为止。
- 从DSMZ商业获取肿瘤细胞系A549。在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基中培养肺癌细胞系A549（EGFR野生型，KRAS突变型）。培养操作同上。细胞使用至第20代为止。
- 定期（每4至6周）检测细胞是否存在支原体等污染。
- 在玻璃盖玻片上培养A549或HCC827细胞
- 使用镊子将1片无菌玻璃盖玻片放入24孔板的每个孔中。
- 分别在含有玻璃盖玻片的孔中接种两种细胞系各50,000个肿瘤细胞，接种体积为500 µl。
- 在标准培养条件（37 °C；5% CO2）下培养细胞，直至细胞融合度达到70%。在此期间，每隔2至3天用巴斯德吸管吸除旧培养基，并加入500 µl新鲜培养基。
2. 在生物胶原支架上构建肿瘤测试系统
- 静态培养条件
- 制备脱细胞小肠黏膜....
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结果
基于 SISmuc 支架（图2A至图2C），我们建立了一套标准化操作流程，用于构建、刺激及处理三维肿瘤检测系统（图 2D）。该模型可利用M30-ELISA测定增殖指数并定量凋亡，如图所示。 图1 和 图3分别。 图3 显示具有代表性的 H&A549 和 HCC827 模型的 E 染色以及使用吉非替尼的一项代表性凋亡检测。此处展示的模型是以上述示例为基础设计的 EGFR-突变的非小细胞肺癌（NSCLC），该类型在临床上可通过靶向抑制剂成功治疗。相应地，仅 EGFR-mutated HCC827 细胞对治疗有反应，而 A549 细胞无反应 EGFR 通过检测凋亡增加评估我们的模型中TKI吉非替尼的抑制作用。 图4 显示了我们的模型在经EMT诱导剂TGF-beta-1刺激后的一个代表性染色结果。在流动生物反应器中的动.......
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讨论
我们已建立了一种联合方法 体外/计算机模拟 用于生物标志物指导治疗预测的肿瘤检测系统。 体外 模型可评估化合物作用的多个重要方面，例如在特定突变背景下肿瘤细胞增殖与凋亡的变化，该背景亦可进行模拟 计算机模拟17在此，我们介绍了用于生成三维肿瘤模型及进行化合物测试的标准化方案，包括细胞增殖与凋亡的定量分析，以及建立预测模型的方法 计算机模拟 模型。该三维肿瘤模型基于携带特定突变的肿瘤细胞系。细胞在去细胞化组织基质上的细胞环中培养。基质的去细胞化处理、在两个金属环（细胞环）之间固定、生物反应器系统的组装以及支架的接种等步骤此前已在JoVE中可视化展示。 25.
体外 3D 肿瘤模型
将本研究获得的结果转化至临床应用，需要谨慎选择携带特定突变的合适肿瘤细胞，以便根据生物标志物对患者进行分类，从而匹配相应的靶向药物。在分层医学中，通过下一代测序技术鉴定可靶向的驱动突变尤为重要，尤.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由维尔茨堡大学医院跨学科临床研究中心（IZKF，项目编号 BD247）和巴伐利亚适配计划（授予 Heike Walles）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物反应器 | 组织工程与再生医学讲席教授，Wü德国罗兹堡 | 生物反应器设置 | |
| BioVoxxel Toolbox（ImageJ / Fiji） | Jan Brocher，Thorsten Wagner，https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| 细胞冠 | 组织工程与再生医学讲席教授，Wü吕贝克（德国） | 用于静态三维培养 | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | 该软件用于绘制网络图。 |
| 柠檬酸盐缓冲液储备液（10倍浓缩） | 内部生产 | 42 g/L 柠檬酸一水合物，17.6 g/L 氢氧化钠颗粒溶于去离子水，pH 6.0，室温保存。 | |
| 柠檬酸盐缓冲液工作液 | 内部生产 | 10% 枸橼酸盐缓冲液储备液，溶于去离子水中，室温保存。 | |
| 柠檬酸一水合物 | VWR，达姆施塔特（德国） | 1002441000 | 用于柠檬酸盐缓冲液 |
| 盖玻片 | 德国达姆施塔特 VWR | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech，伯明翰（美国） | SBA-0100-20 | |
| KEGG、HPRD 和 QIAGEN（基因 &与通路） | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html；http://www.hprd.org/；https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | 采用了多种已知的文献数据库来构建网络拓扑结构。 |
| 女性鲁尔卡箍式三通接头 | Mednet, Münster（GER） | FTLT-1 | 生物反应器设置 |
| 带5/16内螺纹的雌性鲁尔接头样式" 六角转1/4-28 UNF螺纹 | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | 生物反应器设置 |
| 胎牛血清 | 生物&SELL，Feucht（德国） | FCS.ADD.0500 | 未热灭活 |
| 吉非替尼 | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM 储存液（溶于DMSO） |
| 玻璃烧瓶（Schott，GER），配有玻璃软管接头 | 韦克特，基钦根（德国） | 定制 | |
| Histofix 4%（多聚甲醛） | 卡尔·罗特，卡尔斯鲁厄（德国） | P087.1 | |
| 软管接头 | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | 生物反应器设置 |
| 生物反应器培养箱 | 组织工程与再生医学讲席教授，Wü德国罗兹堡 | 生物反应器设置 | |
| M30 CytoDeathTM 酶联免疫吸附测定 | Peviva，布罗马（瑞典） | 10900 | |
| 雄性鲁尔一体式锁环 | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | 生物反应器设置 |
| 保湿室 | 定制 | ||
| 小鼠抗广谱角蛋白 | Sigma-Aldrich，慕尼黑（德国） | C2562-2ML | 克隆 C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2，免疫荧光使用比例为1/100 |
| 无针可擦拭阀式鲁尔接头（雌性） | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | 生物反应器设置，用于取样，γ射线灭菌 |
| O型圈 MVQ 10 红色 37 × 3 mm | Arcus 密封元件，Seevetal（德国） | 21444 | 大号O形圈，生物反应器装置 |
| O型圈 MVQ 70 红色 27 × 2.5 mm | Arcus 密封元件，Seevetal（德国） | 19170 | 小O形圈，生物反应器装置 |
| PAP笔 | Dako，汉堡（德国） | S002 | |
| 石蜡 | 卡尔·罗特，卡尔斯鲁厄（德国） | 6642.6 | |
| 蠕动泵 | Ismatec，Wertheim-Mondfeld（德国） | 生物反应器设置 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich，慕尼黑（德国） | D8537-6x500ml | |
| 泵管盒 | Ismatec，韦尔泰姆（德国） | IS 3710 | 生物反应器设置 |
| 兔抗 Ki67 | Abcam，剑桥（英国） | ab16667 | 克隆 SP6，用于免疫荧光实验，稀释比例为 1/100 |
| 兔抗波形蛋白 | Abcam，剑桥（英国） | ab92547 | 用于免疫荧光，稀释比例为1:100 |
| RPMI-1640 培养基 | 生命技术公司，达姆施塔特（德国） | 61870-044 | 37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C |
| 硅胶管 | 卡尔·罗斯特有限责任公司，卡尔斯鲁厄（德国） | HC66.1 | 生物反应器设置 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | 用于柠檬酸盐缓冲液 |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | 该软件用于进行半定量模拟。 |
| 无菌空气滤器，孔径 0.2 µm | 赛多利斯斯泰迪姆生物技术公司，Gö德国蒂宾根 | 16596-HYK | 生物反应器设置 |
| 5 ml 注射器鲁尔锁扣 | BD 生物科学，海德堡（德国） | 309649 | 用于生物反应器取样 |
| 组织培养试验板：6-， 12孔、24孔、96孔 | TPP Techno Plastic Products AG，特拉萨丁根（德国） | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| 转化生长因子-β1（TGF-β1）含载体 | 细胞信号传导，德国法兰克福 | 8915LC | 无菌柠檬酸盐缓冲液（pH 3.0）中的储备液 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München（GER） | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München（GER） | P7949-500ml | 免疫荧光染色洗涤缓冲液 |
参考文献
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J.
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