如何利用小型反刍动物为木本作物中的匍匐地被植物建立条件性味觉厌恶

摘要

可以通过改变家畜的摄食行为偏好，来实施木本作物的放牧管理计划。本文介绍了一种在动物食用新植物后给予氯化锂剂量以诱导条件性味觉厌恶的实验方案。

摘要

条件性味觉厌恶（CTA）是一种学习行为过程，动物在经历胃肠道不适后学会拒绝摄食特定饲料。氯化锂（LiCl）是用于家畜诱导CTA的首选试剂，因为它能特异性刺激呕吐中枢。此外，LiCl易于获取、配制，并可通过灌药枪方便地给药。然而，为了获得有效且持久的CTA，使小型反刍动物能在作物生长季节安全放牧，需考虑若干因素。关键一点是使用此前从未接触过目标植物（即需要避免采食的植物；新饲料）的动物。由于小型反刍动物天生具有新食物恐惧的摄食行为，它们能够很容易将负面反应与新饲料联系起来，从而形成强烈而持久的CTA。推荐剂量为山羊200 mg LiCl/kg体重（BW），绵羊225 mg LiCl/kg体重（BW）。为诱导CTA，应单独提供100 g目标植物，持续至少30分钟，若动物摄食量超过10 g，则随后给予LiCl。每次动物在无不良后果的情况下摄食目标植物，CTA效应就会减弱。因此，为最大限度降低摄食目标植物的风险，必须提供充足且适口的地表植被覆盖。存在替代性饲料（具备足够质量和数量）可防止动物误食目标植物。建议密切监控羊群，对摄食超过4口或10 g目标植物的个体应及时移出并重新给药。在每个放牧季节开始前，应检查每只动物的CTA状态，确认其厌恶反应仍有效后再将其转移至作物田区。

引言

在木本作物行间使用地表覆盖物可减轻土壤侵蚀和退化，并提高水分、有机碳和氮的保持能力^1-3。此外，地表覆盖物还能维持并增加生物多样性，有助于作物害虫与其天敌之间的生态平衡。农民通常通过施用农用化学品或使用收割机来清除杂草，从而减少作物与绿色覆盖植物之间的养分竞争。一种经济有效的地表覆盖控制方法是利用小型反刍动物进行放牧。动物放牧的另一个好处是改善土壤健康和肥力。然而，由于小型反刍动物会采食幼叶和嫩芽而损害作物，农民往往不愿意采用这种做法。

为防止潜在的农作物损害，可在羊群或 goat 群体中的羊或山羊中诱导条件性味觉厌恶（CTA）。由于动物对新饲料存在先天性的摄食新奇恐惧行为，CTA 可轻易针对新型饲料建立^4,5 小型反刍动物，且由于熟悉的饲料与积极的反应相关联 "习得性安全" 状态，更难以改变或操控⁶动物会因某种饲料（条件刺激）摄入后产生负面的消化后效应（非条件刺激）而学会拒绝该饲料。为了诱导动物对适口且无毒的植物产生条件性味觉厌恶（CTA），可在动物摄食目标植物后口服氯化锂（LiCl；诱导剂）。尽管还存在其他诱导剂（例如 阿扑吗啡、环磷酰胺、噻苯唑），氯化锂因作用于化学感受器触发区并引起胃肠道不适，对催吐系统产生影响，表现出最强且最持久的条件性味觉厌恶（CTA）^7,8 伴有轻度全身不适症状。锂（Li）从上消化道吸收后分布于全身体液空间⁹动物的恢复期可短至两天^7,10,11.

LiCl可通过与食物混合^12,13、装入明胶胶囊^13,14，或使用灌胃枪口服溶液的方式给予^15-17。尽管LiCl溶液具有腐蚀性，但未见口腔或食管损伤的报道。LiCl的使用剂量范围为每千克体重100至400 mg（mg LiCl/kg BW），较高剂量可获得更佳效果（条件性味觉厌恶更持久）^16,18。然而，考虑到不同物种和品种对剂量的反应差异，某些情况下其致死效应在400 mg LiCl/kg BW时即已出现。推荐用于产生有效长期条件性味觉厌恶（CTA）的剂量为：山羊200 mg/kg BW，绵羊225 mg/kg BW^10,17,19。在此剂量下使用的锂元素主要通过尿液（92 ± 4%）在给药后前4天内排出，其次为粪便（6.5 ± 1.3%）和乳汁（2.8 ± 0.4%）¹¹。单次给予LiCl后，血浆中锂的完全清除期估计为：绵羊9天，山羊11天。由于乳汁中锂的排泄量极低，因此无法在哺乳期幼崽中自然建立条件性味觉厌恶^11,20。

当有替代牧草来源时，绵羊在整个放牧季节（3-4个月）内均表现出长期的条件性味觉厌恶（CTA）持续性^14,21，并在下一个放牧季节（9个月后）仅通过一次LiCl给药即可几乎完全重建对该植物的厌恶反应¹⁴。此外，在牧场条件下，当目标饲料为有毒但适口性良好的植物时，奶牛的CTA持续时间可达2至3年，且无需加强剂量^22,23。对于维持动物对非毒性植物的CTA而言，提供替代饲料的选择至关重要。每当动物摄入超过10 g被厌恶的植物而未引发胃肠道不适时，CTA便会受到削弱²⁴。

方案

下文所述诱导对木本作物产生条件性味觉厌恶（CTA）的实验方案遵循了相关动物护理指南 "巴塞罗那自治大学" （西班牙贝拉特拉）并已获得动物与人类实验伦理委员会（CEEAH，编号分别为770和998）对绵羊和山羊实验的批准。

1. 氯化锂剂量的配制

1. 在蒸馏水中配制25% w/v（重量/体积）的LiCl溶液。也可使用干净的自来水。由于LiCl具有极强的吸湿性，因此在操作粉末状化学品时必须小心谨慎。
   1. 称取250 g LiCl，溶于蒸馏水中（得到LiCl浓缩液）。该溶解过程为放热反应，需等待溶液恢复至室温后再继续操作。将溶液倒入容量瓶中，并加入蒸馏水定容至1,000 ml。
2. 计算每只动物所需的溶液体积（个体剂量）。
   1. 称量动物体重（BW），并根据公式1计算每只动物所需的LiCl溶液体积。绵羊长期示踪推荐剂量为225 mg LiCl/kg BW¹⁰ ，山羊为200 mg LiCl/kg BW¹⁷。然而，放牧研究中使用的其他剂量见表1。
      
      （kg BW × LiCl剂量 g/kg BW）/ LiCl浓度 g/L = LiCl体积（L）[公式1]
      
      例如：
      绵羊：体重60 kg；剂量225 mg LiCl/kg BW；LiCl溶液浓度250 g/L
      （60 kg × 0.225 g/kg）/ 250 g/L = 0.054 L = 54 mL
      山羊：体重35 kg；剂量200 mg LiCl/kg BW；LiCl溶液浓度250 g/L
      （35 kg × 0.200 g/kg）/ 250 g/L = 0.028 L = 28 mL

LiCl 剂量	Mazorra 等 (2006)19	伯里特 等 (2013)35
低	100	125
培养基	150	150
高	225	175

表1：氯化锂剂量范围。 不同研究者用于诱导摄食厌恶的氯化锂剂量范围（mg/kg 体重，BW）。

2. 动物选择与饲养设施

1. 选择成年、未怀孕且未哺乳的动物，且这些动物此前从未摄食过目标饲料。
2. 为更好地控制动物行为，同时进行条件性味觉厌恶（CTA）诱导的动物数量不应超过20只。初始阶段仅对5只动物进行CTA诱导。
3. 将动物安置在能够单独记录其摄食目标饲料量的环境中。每天饲喂一次基础日粮，以满足其全部营养需求，并提供自由饮水和矿物盐块。确保动物摄入足够的食盐，以防止氯化锂（LiCl）的毒性作用，因为体细胞可能用锂（Li）替代钠（Na）⁹。
4. 若动物初次进入实验设施，应给予1周的适应期，使其熟悉环境和基础日粮。

3. 厌恶诱导

1. 在前一晚（第 -1 天）移除基础日粮，并提供目标饲料 随意摄取 以确保动物在第二天积极摄食目标饲料¹².
2. 次日（第0天），早晨移除剩余饲料，每只动物在30分钟内提供200 g目标饲料。之后称量剩余饲料。
3. 若动物摄食量超过20–30 g，应尽快使用灌胃枪给予相应计算体积的LiCl（按1.2步骤计算出的毫升数），最迟不得超过摄食后1小时；若动物摄食量少于20–30 g，则于次日重复该操作。由于动物天生具有对新食物的恐新行为，可能需要超过1天时间才能开始摄食目标饲料。^10,17,25-27.
4. 给予LiCl后，等待2小时再提供基础饮食。
5. 从第1天到第3天，不向动物提供目标饲料，并定期检查动物是否出现严重疾病的任何可能迹象，每日记录饲料和饮水摄入量（按重量或清单记录）、呼吸频率及动物行为。在氯化锂给药后的数天内，动物可能出现头下垂、耳下垂、活动减少、腹泻、呼吸频率增加以及饮水和进食量减少等症状。^9-11,20,25.

4. 厌恶反应验证

1. 在给予氯化锂后的第4、5、6和7天，重复步骤3.2。
2. 如果动物摄食的目标饲料少于<10 g（或少于<4口），可认为条件性味觉厌恶（CTA）已建立。零（无摄食）与10 g之间的阈值可能取决于目标植物的具体情况（是否有毒）。
3. 若任何动物摄食量超过>10 g，则给予新的氯化锂剂量并重复步骤4.1。若该动物在第二次给药后仍持续摄食目标植物，则将其从CTA组中剔除。社会促进作用（例如母体、同胞及亲密同伴）可改变家畜的CTA行为。已被建立对目标植物厌恶的动物，在与未建立厌恶的动物共同放牧时，可能重新摄食该植物²⁸。

5. 牧场管理

注意：用于诱导条件性味觉厌恶（CTA）的氯化锂剂量在数天内几乎完全通过尿液排出体外。

1. 尽管锂在地壳中广泛分布，但为避免有机作物可能受到污染，在使用锂标记后，需等待9至11天方可将动物转移至作物区域（该时间为根据锂确定的清除期） 药代动力学¹¹.
2. 确保在放牧期间作物的地面覆盖充足且适口，以防止动物采食目标饲料。将经过处理的动物与未处理的动物分开放牧。
3. 让动物在划定的区域内采食整个地表，以均匀控制草的高度。使用便携式电围栏或金属围栏划定区域，或通过牧羊人引导动物在特定作物行间进行放牧。
4. 避免过度放牧，当地表覆盖物变得稀疏（草高5 cm）时，应及时移走动物²⁹.

6. 重建 CTA

1. 每年在允许动物返回啃食作物之前，重复步骤4。

结果

以下结果来自巴塞罗那自治大学开展的多项关于木本作物单宁对小型反刍动物影响的研究，这些研究为所提出方案的建立提供了依据。

在山羊中使用175和200 mg LiCl/kg体重、在绵羊中使用200和225 mg LiCl/kg体重的剂量，单次给药即可成功诱导对木本作物的条件性味觉厌恶（CTA），仅有两例动物未完全吞下所给的LiCl剂量^10,17（表2）。大多数产生CTA的动物在给予LiCl后的第二天出现低头、活动减少以及基础日粮采食量下降的现象^10,11,17；然而，这些胃肠道不适症状在2天内即消失^10,11。对于所有使用的剂量，典型的CTA行为表现为动物拒绝接近饲喂箱，仅嗅闻植物材料后即拒绝采食，或采食目标饲料的量少于<10 g^10,17。此外，在每种动物中，不同剂量在长期效果维持时间以及短期内需要追加LiCl剂量的动物数量方面...

讨论

如果目标饲料是动物从未食用过的植物，且该植物不含不可替代的营养物质，则条件性味觉厌恶（CTA）在小型反刍动物中很容易建立。动物对无毒饲料通常具有积极的摄入后关联反应，除非先前的接触使其难以改变对该特定饲料的认知^7,33。条件性味觉厌恶的产生是因为氯化锂（LiCl）刺激了催吐系统，引起不适或胃肠道不适³⁴。已有研究证实，摄入氯化锂的动物呼吸频率增加，出现头部下垂和耳朵耷拉的现象，偶尔会用后腿踢腹部²⁵，并表现出产奶量下降²⁰以及食物和水的摄入量减少¹¹。然而，这些症状在数天内（2至4天）即会消失^11,20。

该方案可根据其他条件性味觉厌恶（CTA）研究进行轻微调整。尽管我们指出氯化锂（LiCl）应在摄食目标饲料后立即给予，但动物在给药后4小时内仍能够将摄食行为与不适感建立关联²⁴。然而，重要的是在给药后单独提供目标饲料，并暂时将其与其他饲料（如基础日粮）分离（至少在给药后1小时²⁴），以防止交叉性CTA的发生。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化锂 PRS	Panreac	141392.1209	同一公司可提供相同产品的不同数量。
Labelvage 灌胃器 70 mL	Labelvage	240040	可使用类似产品（不同品牌或体积）。