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脂肪库特异性Sca1high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

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DOI：

10.3791/53890

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2016年8月11日

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, Biointerfaces Institute, University of Michigan

本文内容

摘要

我们介绍了从鼠类腹股沟（皮下）和性腺周围（内脏）脂肪组织库中分离基质血管组分（SVF）的技术，以评估其基因表达和胶原酶活性。该方法包括利用免疫磁珠细胞分离技术富集Sca1high脂肪来源干细胞（ASCs）。

摘要

脂肪来源干细胞（ASCs）的分离是脂肪组织生物学、脂肪生成以及细胞外基质（ECM）重塑研究领域的重要方法。体内，由纤维状胶原蛋白构成的富含ECM的微环境在肥胖发展与消退过程中为脂肪组织提供结构支持。由基质金属蛋白酶（MMPs）介导的生理性ECM重塑在调控脂肪组织大小和功能中起关键作用1,2。生理性胶原降解性ECM重塑的丧失可能导致胶原过度积累（组织纤维化）、巨噬细胞浸润，最终导致包括胰岛素抵抗在内的代谢稳态失衡3,4。当在基因靶向小鼠模型中观察到脂肪组织表型改变时，从脂肪库中分离原代ASCs进行体外研究，是明确特定基因在调控ASCs功能中作用的有效方法。下文将介绍一种Sca1high ASCs的免疫磁珠分离方法。

引言

干细胞抗原1（Sca1，或Ly6A/E）最初被鉴定为造血干细胞和间充质干细胞表达的一种细胞表面标志物5,6从小鼠脂肪组织库中获得的脂肪基质血管组分（SVF）是一类异质性细胞群体，包含成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、神经细胞以及脂肪细胞前体细胞。7脂肪细胞前体细胞，或称脂肪源性干细胞（ASCs），是存在于富含胶原的血管周围细胞外基质（ECM）中、不含有脂滴的细胞。8. 约50%的基质血管组分（SVF）由ASCs构成，其特征为谱系标记阴性（Lin-）和 CD29+CD34+Sca1+ 9。这些细胞大多数为 Sca1+CD24- 脂肪细胞前体，具有分化为脂肪细胞的能力 体外；然而，仅有少量细胞（SVF 的 0.08%）为 Sca1 阳性+CD24+ 具有完全增殖能力并能分化为脂肪细胞的细胞 体内 条件9尽管使用Sca1可能存在潜在的局限性+ 不区分CD24的SVF+ CD24 阳性细胞- 细胞，分离 Sca1+ 利用免疫磁珠细胞分离法从脂肪库中分离ASCs是确定原代脂肪细胞前体细胞细胞自主表型的一种高效且实用的方法。

在肥胖与糖尿病领域，组织纤维化和炎症在2型糖尿病的发生与维持过程中起着关键作用3。最近，Tokunaga 等. 表明 Sca1高 从C57BL6/J小鼠腹股沟（或皮下，SQ）和性腺周围（或内脏，VIS）脂肪组织分离的细胞表现出不同的基因表达特征和细胞外基质重塑模式 体外10MMP14（MT1-MMP）是膜型基质金属蛋白酶（MMP）家族的典型成员，通过其胶原蛋白水解活性介导白色脂肪组织（WAT）的发育。1.

通过以下方案分离和富集的细胞可开展多种实验，例如三维培养、分化研究、胶原降解检测以及RNA测序10,11降解实验应使用酸提取的胶原蛋白进行，以确保端肽的保留11,12以下方案将演示从不同脂肪组织库中分离原代血管基质细胞，并利用免疫磁珠细胞分离技术富集脂肪细胞前体细胞的方法。细胞分选的有效性将通过流式细胞术以及表达Sca1-GFP的转基因小鼠（其Sca1阳性细胞表达绿色荧光蛋白GFP）进行评估。+ 细胞，由一个 Sca1 启动子13.

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方案

伦理声明：所有方法和实验方案均经密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准，符合《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会实验动物资源研究所）的规定。小鼠饲养于密歇根大学动物实验中心，自由摄食饮水，并维持在12小时黑暗/12小时光照的循环环境中。

1. 准备工作

  1. 使用DMEM、10% FBS、1× P/S/G和1×抗生素/抗真菌剂配制原代培养基，用于组织消化前的保存。将原液和分装样品置于37 ºC水浴中预热。
  2. 每种待分离的脂肪垫（最多五只小鼠）按每5毫升使用HBSS（含Ca、Mg）溶解5 mg/ml的III型胶原酶配制溶液。例如，若从单一基因型中分离SQ和VIS脂肪垫，则配制10 ml；若为野生型和突变型的SQ及VIS脂肪垫，则配制20 ml。调节pH至7.4，经无菌过滤后分装至50 ml离心管中，避光放置备用。
  3. 使用70%乙醇对术区进行消毒，擦拭后覆盖蓝色垫巾，并在垫巾上喷洒适量乙醇。
  4. 使用22 G针头将吸水垫固定于泡沫板上，并用剪刀修整边缘。用乙醇喷洒垫子后，将泡沫板置于蓝色垫巾上，并用另一块蓝色垫巾覆盖，直至开始解剖操作。
  5. 取两个50 ml离心管装满乙醇，放置在术区旁边的支架上，将剪刀和镊子浸入乙醇中消毒。
  6. 另取一个50 ml离心管装入含1×抗生素/抗真菌剂的PBS，用于冲洗手术器械上的乙醇。
  7. 在生物安全柜内，为每种组织类型标记60 mm培养皿，并加入预热至37 ºC的培养基，将培养皿置于手术区域附近备用。

2. 皮下脂肪垫的分离

  1. 用过量异氟烷和张力性气胸法处死小鼠。
  2. 用70%乙醇轻轻喷洒小鼠，并使其仰卧。用22号针将四肢固定在泡沫板上。
  3. 在小鼠下腹部皮肤上做一个小切口。用镊子夹住切口上缘，用剪刀将皮肤与腹膜分离。
  4. 从腹部至胸部将皮肤完全与腹膜分离后，沿身体两侧做横向切口，将皮肤向头侧翻折，远离腹膜。
  5. 将残留的皮肤连同腹股沟脂肪组织一起从身体上翻起，并用22号针将其固定在泡沫板上。
  6. 更换为精细剪刀和镊子。用镊子夹住靠近腹膜处的腹股沟脂肪垫起始部位，沿皮肤与腹股沟脂肪之间的间隙向腹股沟方向剪下，避免皮肤污染皮下组织。
  7. 将分离出的腹股沟脂肪垫放入已标记的60 mm培养皿中。

3. 内脏脂肪垫（VIS）的分离

  1. 与步骤 2.5 类似，切开腹膜以暴露内脏脂肪团和肠道。
  2. 将肠道向胸腔方向移开。
  3. 在远端抓住 VIS 脂肪团并轻轻提起。在分离 VIS 脂肪团时需小心，避免包含附睾（或使用雌性小鼠时为子宫）组织。
  4. 放入已标记的培养皿中，并对另一侧 VIS 脂肪团重复步骤 3.3。

4. 脂肪垫的胶原酶消化

  1. 将60 mm培养皿移至组织培养罩中，吸除培养基。
  2. 用弯头剪刀剪碎脂肪组织，然后加入胶原酶溶液中。在处理不同组织类型之间，务必用乙醇和PBS清洗剪刀和镊子。
  3. 在37 ºC、300 rpm条件下振荡10–20分钟，直至组织消化完全。若仍有少量皮下组织碎片可见，亦属正常，后续步骤将予以处理。
  4. 向胶原酶溶液中加入25 ml培养基以终止胶原酶消化作用，并用10 ml血清移液管反复吹打10次，使消化后的组织充分分散。
  5. 使用100 µm细胞滤网过滤细胞，随后以300 × g离心10分钟。
  6. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀，向沉淀中加入5 ml无菌水，轻轻吹打使细胞重悬，静置2分钟以裂解红细胞。
  7. 加入含10% FBS的25 ml培养基，并通过新的100 µm细胞滤网过滤细胞。
  8. 以300 × g离心10分钟，吸除上清液，将沉淀用1 ml培养基重悬。
  9. 使用血细胞计数板，以1:1台盼蓝染色法进行细胞计数。
  10. 在6孔板的每个孔中接种1 × 106个细胞。

5. 磁性细胞分离

  1. 细胞贴壁约 4 至 6 小时后，用 HBSS (-Ca, -Mg) 洗涤细胞两次。使用 0.05% 胰蛋白酶消化贴壁细胞。将胰蛋白酶细胞悬液用 1 ml 分离缓冲液稀释后，以 300 × g 离心 5 分钟。
  2. 吸除上清液。将细胞重悬于 500 µl 缓冲液中。取 10 µl 样品，使用血细胞计数板计数细胞。
  3. 以 300 × g 离心 5 分钟。
  4. 完全吸除上清液。将细胞重悬于 90 µl 缓冲液中。加入 10 µl 抗 Sca1-FITC 一抗，充分混匀后于 4 ºC 避光孵育 10 分钟。
  5. 用 1 ml 缓冲液洗涤细胞，以 300 × g 离心 5 分钟。完全去除上清液。
  6. 将细胞重悬于 80 µl 缓冲液中。加入 20 µl 抗 FITC 磁珠，充分混匀后于 4 ºC 避光孵育 15 分钟。
  7. 用 1 ml 缓冲液洗涤细胞，以 300 × g 离心 5 分钟。
  8. 去除上清液，将沉淀重悬于 500 µl 缓冲液中。
  9. 将层析柱置于磁力架上，用 500 µl 缓冲液冲洗层析柱。
  10. 将细胞悬液加入层析柱中。加样时避免产生气泡。
  11. 收集未标记的 Sca1- 细胞，并用 500 µl 缓冲液洗涤层析柱 3 次。仅当储液腔排空后才加入新的缓冲液。加样时避免产生气泡。
  12. 将层析柱从磁力架上取下，放入一个 15 ml 锥形管中。
  13. 向层析柱中加入 1 ml 缓冲液，通过推动随附的活塞穿过层析柱储液腔，洗脱 Sca1+ 细胞。
  14. 将细胞组分以 300 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 1 ml 培养基中。
  15. 从标记和未标记的组分中各取 10 µl 样品，使用血细胞计数板计数细胞。
  16. 将每种细胞组分接种至 6 孔板中的 1 个孔内。

6. 使用流式细胞术验证Sca1high ACSs的免疫磁珠分选

  1. 用不含钙、镁的 HBSS 溶液冲洗细胞两次，然后使用 0.05% 胰蛋白酶消化细胞。
  2. 将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，加入 1 ml 培养基重悬细胞，并用血细胞计数板计数。
  3. 取 1 ml 培养基中含有 >106 个的细胞，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  4. 吸除上清液，并重复步骤 6.3 两次。
  5. 用 1 ml 含 2% 山羊血清和 2% BSA 的溶液重悬细胞，在室温下封闭 30 分钟。
  6. 将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  7. 移除封闭液。
  8. 在 100 µl 含 2% 山羊血清和 2% BSA 的 PBS 中加入大鼠 IgG2a Alexa Fluor 647 抗体（0.25 µg，1:400）或抗 Sca1 Alexa Fluor 647 抗体（0.25 µg，1:400），4 °C 避光孵育 30 分钟。
  9. 向细胞中加入 1 ml 冷 PBS，于 4 °C 在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  10. 吸除上清液，并重复步骤 6.9 两次。
  11. 将细胞重悬于 1 ml PBS 中，将细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网，以备流式细胞术分析。

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结果

从不同脂肪垫中富集 Sca1high ASCs

从皮下脂肪（SQ fat）分离的血管基质细胞呈现成纤维细胞样、伸展的细胞形态，且与Sca1表达水平无关（图1A）。另一方面，来源于腹股沟脂肪（VIS，即eWAT来源）的Sca1high和Sca1low细胞在细胞形态上表现出明显差异。与来源于皮下脂肪（iWAT来源）的Sca1high细胞类似，来源于腹股沟脂肪（eWAT来源）的Sca1high细胞呈现伸展的成纤维细胞样形态，而VIS来源的Sca1low细胞则呈现上皮样形态。从Sca1-GFP小鼠分离的Sca1high细胞可在组织培养中被轻易识别为GFP阳性细胞（图1B）。当通过流式细胞术检测这些细胞时，大多数GFP阳性细胞被证实可在细胞表面...

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讨论

本文展示了从小鼠不同脂肪垫中分离和通过免疫磁珠法分离小鼠ASCs的方法及其应用 体外 实验。该方法可高效快速地分离大量Sca1阳性ASCs，相较于技术复杂且成本较高的FACS介导的ASCs分离方法具有优势。9,14与流式细胞术（FACS）不同，免疫磁珠细胞分选技术不能利用多种抗原来鉴定目标细胞群体。然而，若细胞表面抗原特征明确，使用免疫磁珠分离可增加待分析细胞的数量，且无需依赖FACS设备。15对于许多没有核心设施的小型研究机构的生物研究人员来说，仍然难以轻易获得。

为了确保实验成功，操作过程中有一些关键环节必须严格遵守。获取脂肪来源的干细胞需要通过手术分离小鼠的脂肪组织库。因此，组织获取的速度和准确性对于获得大量活细胞至关重要。此外，保持手术区域和器械的清洁对防止细胞和组织样本受到微生物污染也极为重要。分离后的脂肪组织必须在II型胶原酶溶液中进行酶解消化。皮下脂肪（SQ）与内脏脂肪（VIS）脂肪垫的细胞外基质（ECM）组成存在差异10,16，其中VIS脂肪垫的胶原蛋白含量低于SQ。因此，VIS脂肪...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）DK095137 项目（资助对象：THC）提供支持。我们感谢现有及以往实验室成员对所述方法的开发与完善所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
III型胶原酶沃辛顿生物化学LS004182组织消化
DMEMGibco11965-092高糖培养基
青霉素/链霉素/谷氨酰胺（100倍浓缩）Gibco10378-016培养基抗生素
抗-抗（100倍稀释）Gibco15240-062抗真菌培养基
FBSGibco16000-044
PBS（1×，pH 7.4）Gibco10010-023
胰蛋白酶（0.05%）Gibco25300-054
细胞筛BD生物科学352360100-μm细胞滤筛
60 mm 培养皿BD Falcon353004
剪刀FST14001-12大型
剪刀FST14091-11精细，弯曲尖端
大型镊子FST11000-12
精细镊子任意供应商
25G 5/8” 针BD305122
22G 1.5” 针BD305159
15 ml 离心管BD Falcon352097
50 ml 锥形管BD Falcon352098
MACS 分离柱Miltenyi Biotec130-042-201
抗Sca1微珠试剂盒（FITC）Miltenyi Biotec130-092-529FITC-anti-Sca1 1ºAb 和抗 FITC 磁珠 2ºAb
AutoMACS 运行缓冲液Miltenyi Biotec130-091-221
MiniMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
蓝色Chux垫Fisher276-12424
吸水垫Fisher19-165-621
泡沫板使用50 ml离心管
70% 乙醇
异氟烷任意供应商
大鼠 IgG2a Alexa Fluor 647InvitrogenR2a21
大鼠 IgG2a 抗小鼠 Sca1 Alexa Fluor 647InvitrogenMSCA21
大鼠 IgG2a R-PEInvitrogenR2a04
大鼠 IgG2a 抗小鼠 F4/80 R-PEInvitrogenMF48004
圆底试管BD Falcon352058
HBSS（–Ca, –MgGibco14175-095
HBSS（含Ca，含Mg）Gibco14025-092用于胶原酶溶液
I型胶原蛋白（2.7 mg/ml，溶于37 mm乙酸）自行制备12
10x MEMGibco11430-030
1 M HEPESGibco15630-080
0.34 N NaOH自制准备
盖玻片康宁2870-22
Alexa Fluor 594 羧酸琥珀酰亚胺酯，混合异构体InvitrogenA-20004
0.89 M NaHCO₃3 Gibco25080-094

参考文献

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Sca1 Sca1

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