脂肪库特异性Sca1high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

摘要

我们介绍了从鼠类腹股沟（皮下）和性腺周围（内脏）脂肪组织库中分离基质血管组分（SVF）的技术，以评估其基因表达和胶原酶活性。该方法包括利用免疫磁珠细胞分离技术富集Sca1^high脂肪来源干细胞（ASCs）。

摘要

脂肪来源干细胞（ASCs）的分离是脂肪组织生物学、脂肪生成以及细胞外基质（ECM）重塑研究领域的重要方法。体内，由纤维状胶原蛋白构成的富含ECM的微环境在肥胖发展与消退过程中为脂肪组织提供结构支持。由基质金属蛋白酶（MMPs）介导的生理性ECM重塑在调控脂肪组织大小和功能中起关键作用^1,2。生理性胶原降解性ECM重塑的丧失可能导致胶原过度积累（组织纤维化）、巨噬细胞浸润，最终导致包括胰岛素抵抗在内的代谢稳态失衡^3,4。当在基因靶向小鼠模型中观察到脂肪组织表型改变时，从脂肪库中分离原代ASCs进行体外研究，是明确特定基因在调控ASCs功能中作用的有效方法。下文将介绍一种Sca1^high ASCs的免疫磁珠分离方法。

引言

干细胞抗原1（Sca1，或Ly6A/E）最初被鉴定为造血干细胞和间充质干细胞表达的一种细胞表面标志物^5,6从小鼠脂肪组织库中获得的脂肪基质血管组分（SVF）是一类异质性细胞群体，包含成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、神经细胞以及脂肪细胞前体细胞。⁷脂肪细胞前体细胞，或称脂肪源性干细胞（ASCs），是存在于富含胶原的血管周围细胞外基质（ECM）中、不含有脂滴的细胞。⁸. 约50%的基质血管组分（SVF）由ASCs构成，其特征为谱系标记阴性（Lin^-）和 CD29⁺CD34⁺Sca1^{+ 9}。这些细胞大多数为 Sca1⁺CD24^- 脂肪细胞前体，具有分化为脂肪细胞的能力 体外；然而，仅有少量细胞（SVF 的 0.08%）为 Sca1 阳性⁺CD24⁺ 具有完全增殖能力并能分化为脂肪细胞的细胞 体内 条件⁹尽管使用Sca1可能存在潜在的局限性⁺ 不区分CD24的SVF⁺ CD24 阳性细胞^- 细胞，分离 Sca1⁺ 利用免疫磁珠细胞分离法从脂肪库中分离ASCs是确定原代脂肪细胞前体细胞细胞自主表型的一种高效且实用的方法。

方案

伦理声明：所有方法和实验方案均经密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准，符合《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会实验动物资源研究所）的规定。小鼠饲养于密歇根大学动物实验中心，自由摄食饮水，并维持在12小时黑暗/12小时光照的循环环境中。

1. 准备工作

1. 使用DMEM、10% FBS、1× P/S/G和1×抗生素/抗真菌剂配制原代培养基，用于组织消化前的保存。将原液和分装样品置于37 ºC水浴中预热。
2. 每种待分离的脂肪垫（最多五只小鼠）按每5毫升使用HBSS（含Ca、Mg）溶解5 mg/ml的III型胶原酶配制溶液。例如，若从单一基因型中分离SQ和VIS脂肪垫，则配制10 ml；若为野生型和突变型的SQ及VIS脂肪垫，则配制20 ml。调节pH至7.4，经无菌过滤后分装至50 ml离心管中，避光放置备用。
3. 使用70%乙醇对术区进行消毒，擦拭后覆盖蓝色垫巾，并在垫巾上喷洒适量乙醇。
4. 使用22 G针头将吸水垫固定于泡沫板上，并用剪刀修整边缘。用乙醇喷洒垫子后，将泡沫板置于蓝色垫巾上，并用另一块蓝色垫巾覆盖，直至开始解剖操作。
5. 取两个50 ml离心管装满乙醇，放置在术区旁边的支架上，将剪刀和镊子浸入乙醇中消毒。
6. 另取一个50 ml离心管装入含1×抗生素/抗真菌剂的PBS，用于冲洗手术器械上的乙醇。
7. 在生物安全柜内，为每种组....

结果

从不同脂肪垫中富集Sca1^high ASCs。

从SQ脂肪中分离的血管基质细胞呈现成纤维细胞样、伸展的细胞形态，且不受Sca1表达水平的影响（图1A）。另一方面，VIS（来源于eWAT）的Sca1^high和Sca1^low细胞在细胞形态上表现出明显差异。与SQ（来源于iWAT）Sca1^high细胞类似，VIS（来源于eWAT）Sca1^high细胞呈现伸展的成纤维细胞样形态，而VIS Sca1^low细胞则呈现上皮样形态。从Sca1-GFP小鼠中分离的Sca1^high细胞在组织培养中可轻易识别为GFP阳性细胞（图1B）。当通过流式细胞术检测这些细胞时，大多数GFP阳性细胞被证实可通过抗Sca1抗体检测到细胞表面表达Sca1蛋白（

讨论

本文展示了从小鼠不同脂肪垫中分离和通过免疫磁珠法分离小鼠ASCs的方法及其应用 体外 实验。该方法可高效快速地分离大量Sca1阳性ASCs，相较于技术复杂且成本较高的FACS介导的ASCs分离方法具有优势。^9,14与流式细胞术（FACS）不同，免疫磁珠细胞分选技术不能利用多种抗原来鉴定目标细胞群体。然而，若细胞表面抗原特征明确，使用免疫磁珠分离可增加待分析细胞的数量，且无需依赖FACS设备。¹⁵对于许多没有核心设施的小型研究机构的生物研究人员来说，仍然难以轻易获得。

为了确保实验成功，操作过程中有一些关键环节必须严格遵守。获取脂肪来源的干细胞需要通过手术分离小鼠的脂肪组织库。因此，组织获取的速度和准确性对于获得大量活细胞至关重要。此外，保持手术区域和器械的清洁对防止细胞和组织样本受到微生物污染也极为重要。分离后的脂肪组织必须在II型胶原酶溶液中进行酶解消化。皮下脂肪（SQ）与内脏脂肪（VIS）脂肪垫的细胞外基质（ECM）组成存在差异^10,16，其中VIS脂肪垫的胶原蛋白含量低于SQ。因此，VIS脂肪.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
III型胶原酶	沃辛顿生物化学	LS004182	组织消化
DMEM	Gibco	11965-092	高糖培养基
青霉素/链霉素/谷氨酰胺（100倍浓缩）	Gibco	10378-016	培养基抗生素
抗-抗（100倍稀释）	Gibco	15240-062	抗真菌培养基
FBS	Gibco	16000-044
PBS（1×，pH 7.4）	Gibco	10010-023
胰蛋白酶（0.05%）	Gibco	25300-054
细胞筛	BD生物科学	352360	100-μm细胞滤筛
60 mm 培养皿	BD Falcon	353004
剪刀	FST	14001-12	大型
剪刀	FST	14091-11	精细，弯曲尖端
大型镊子	FST	11000-12
精细镊子	任意供应商
25G 5/8” 针	BD	305122
22G 1.5” 针	BD	305159
15 ml 离心管	BD Falcon	352097
50 ml 锥形管	BD Falcon	352098
MACS 分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
抗Sca1微珠试剂盒（FITC）	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb 和抗 FITC 磁珠 2ºAb
AutoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
蓝色Chux垫	Fisher	276-12424
吸水垫	Fisher	19-165-621
泡沫板			使用50 ml离心管
70% 乙醇
异氟烷	任意供应商
大鼠 IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
大鼠 IgG2a 抗小鼠 Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
大鼠 IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
大鼠 IgG2a 抗小鼠 F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
圆底试管	BD Falcon	352058
HBSS（–Ca, –Mg	Gibco	14175-095
HBSS（含Ca，含Mg）	Gibco	14025-092	用于胶原酶溶液
I型胶原蛋白（2.7 mg/ml，溶于37 mm乙酸）	自行制备12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	自制准备
盖玻片	康宁	2870-22
Alexa Fluor 594 羧酸琥珀酰亚胺酯，混合异构体	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO₃3	Gibco	25080-094