体外 通过梯度离心法拆解甲型流感病毒衣壳

摘要

流感病毒A型病毒核在进入宿主细胞过程中的解离是一个多步骤过程。我们描述了一种 体外 分析病毒脱壳早期阶段的方法。该方法利用速度梯度离心，在定义明确的条件下，从生物化学角度解析启动脱壳的各个步骤。

摘要

酸触发的分子过程严格调控着许多通过内吞系统进入细胞的病毒的细胞入侵。以甲型流感病毒（IAV）为例，病毒与内体膜的融合以及随后的病毒衣壳解离（称为脱壳）过程，均由内吞囊泡内部的离子环境所调控。由于内体在实验上无法直接接触，病毒生命周期的早期步骤难以研究，因此需要一种体外（in vitro）研究方法。本文介绍了一种基于速度梯度离心的技术，将纯化的病毒颗粒通过双层甘油梯度离心，从而实现对IAV核心结构及其稳定性的分析。该梯度的下层含有非离子型去垢剂（NP-40），当病毒沉降到管底时，可通过溶解作用去除病毒包膜。在中性pH条件下，病毒核心以稳定结构形式沉淀。主要的核心组分——基质蛋白（M1）和病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）——可通过SDS-PAGE在沉淀组分中清晰识别。当下层pH降低至6.0或更低时，M1会从沉淀中选择性解离，随后在更酸性的条件下vRNPs被释放。考马斯亮蓝染色凝胶上的病毒蛋白条带可进行光密度定量分析，以监测IAV解离过程中的中间状态。除pH外，通过相应调整含去垢剂的甘油层成分，还可评估其他影响病毒核心稳定性的因素，如盐浓度和潜在的病毒脱壳因子。综上所述，该技术可实现对病毒脱壳过程高度可重复且定量的体外（in vitro）分析，并可应用于其他经历复杂脱壳过程的包膜病毒。

引言

甲型流感病毒（IAV）是一种有包膜病毒，属于Orthomyxoviridae科。其基因组为分段的负链单股RNA。在人类中，IAV引起呼吸道感染，通常以季节性流行暴发的形式出现，并具有引发全球大流行的潜力¹。当IAV与宿主细胞表面的唾液酸残基结合后²，可通过网格蛋白依赖性和非依赖性内吞途径进入细胞^3-8。内吞囊泡内的酸性环境（pH < 5.5）会触发IAV刺突糖蛋白血凝素（HA）发生显著的构象变化，从而导致病毒包膜与晚期内体膜融合⁹。一旦IAV衣壳（本文中也称为病毒"核心"）从晚期内体（LEs）中释放出来，便在细胞质中脱壳，随后病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）被转运至细胞核——即病毒复制和转录的发生部位^10-13。在HA被酸性环境激活之前，病毒在内吞系统中经历逐步降低的pH值，这一过程可使病毒核心预先“启动”，为后续的解离做好准备^14-16。在此"启动"过程中，病毒包膜上的M2离子通道介导质子和K^+10,14,16的内流。病毒内部离子浓度的变化破坏了病毒基质蛋白M1与八个vRNP复合物之间的相互作用，从而促进膜融合后IAV在细胞质中的脱壳过程^10,14-17。

由于内体在实验上难以接近，对引发步骤进行直接和定量分析一直受到阻碍。此外，病毒进入过程高度不同步。另外，终点检测方法（如释放的病毒RNA的qRT-PCR或感染性测定）无法提供关于病毒衣壳在进入任何特定步骤时生化状态的详细信息。尽管通过siRNA或药物处理对内体进行干扰已显著促进了对IAV进入机制的理解^18-20，但在严格调控的内体成熟程序中，对其进行精细调控十分困难，且容易产生非特异性的副作用。

为避免这些问题，我们改进了一种先前开发的基于速度梯度离心法的体外实验方案¹⁷。与其他多数基于蛋白酶解和去垢剂处理再结合电镜分析的方法^21,22,23,24不同，该方法可获得易于定量的结果。通过不同梯度层进行离心，可使沉降颗粒以受控方式暴露于变化的环境条件并发生反应。在本方案中，来源于澄清羊膜液或纯化的病毒颗粒在含有两层甘油梯度的介质中沉降，其中底层含有非离子型去垢剂NP-40（图1）。当病毒进入第二层含去垢剂的梯度层时，病毒的脂质包膜及包膜糖蛋白被温和地溶解并滞留在上层。由八个vRNP复合物束及其外周基质层包围形成的病毒核心则以稳定结构沉降至沉淀部分。病毒核心蛋白（如M1蛋白和与vRNP结合的核蛋白NP）可通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色在沉淀中被检测到。特别是利用 commercially available 梯度凝胶并结合高灵敏度的胶体考马斯亮蓝染色²⁵，能够实现高精度分析，并检测到极微量的病毒核心相关蛋白。

这为检测不同条件（如pH值、盐浓度和假定的脱壳因子）对核心组分的沉降行为及核心稳定性的影响奠定了基础。为此，仅通过引入感兴趣的因子或条件，对蔗糖梯度中下方含有去垢剂的层级进行修饰。该技术在研究不同pH值和盐浓度对甲型流感病毒（IAV）核心完整性影响方面尤为有价值。¹⁶可监测流感病毒（IAV）脱壳的中间步骤，包括在弱酸性pH条件下基质层的解离（<6.5），随后在 pH 5.5 及更低条件下发生 vRNP 解离^16,17 (图1）。高钾的存在进一步增强了后一步骤。⁺ 甘油层中的浓度，反映晚期内吞环境¹⁶因此，随着病毒和核心在梯度中沉降，其所处环境发生渐变，模拟了内体中的条件。结果是病毒核心发生逐步解离。 体外，补充来自细胞生物学实验的结果。

本文所述方法实现了对甲型流感病毒（X31 和 A/WSN/33）和乙型流感病毒（B/Lee/40）在酸性 pH 及逐渐升高 K^+16,17 条件下脱壳过程的快速且高度可重复的分析，以及副黏病毒核心在碱性 pH 暴露下的解离过程¹⁷。可以预见，该方法可被拓展应用于其他包膜病毒，以深入理解病毒衣壳结构及其在细胞入侵过程中衣壳解离的生化特性。

方案

1. 缓冲液和储备溶液的配制

1. 配制 MNT 缓冲液（20 mM MES、30 mM Tris 和 100 mM NaCl）：将 470 mg Tris 盐酸盐、390 mg MES 水合物和 580 mg NaCl 溶解于 80 ml ddH₂O 中。用 ddH₂O 将缓冲液调至 pH 7.4，并定容至 100 ml。
2. 配制三份相同的 500 mM MES 缓冲液：每份将 9.76 g MES 水合物溶解于 80 ml dH₂O 中。分别用浓 NaOH 滴定调节缓冲液 pH 至 5.8、5.4 和 5.0。每份用 dH₂O 定容至 100 ml。
3. 配制两份相同的 500 mM Tris 缓冲液：每份将 7.88 g Tris 盐酸盐溶解于 80 ml dH₂O 中，并分别用浓 HCl 滴定调节 pH 至 7.4 和 6.4。用 dH₂O 将缓冲液定容至 100 ml。
4. 在 dH₂O 中配制 50% 甘油溶液，充分搅拌至甘油均匀混合。使用 Steritop 滤器装置（孔径 0.22 µm）将溶液过滤至玻璃瓶中。
5. 在 dH₂O 中配制 10% NP-40 溶液和 1 M NaCl 溶液。
6. 通过将两片蛋白酶抑制剂片剂溶解于 4 ml ddH₂O 中，配制 25 倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液。

2. 甘油梯度的制备

1. 为每个待测试的 pH 条件（pH 7.4、6.4、5.8、5.4 和 5.0）配制 5 ml 去垢剂缓冲液主混合液（300 mM NaCl，2% NP-40，2 倍浓度蛋白酶抑制剂）。为此，将 9 ml 1 M NaCl、6 ml 10% NP-40、2.4 ml 25 倍浓度蛋白酶抑制剂储备液和 9 ml ddH₂O 混合。
2. 对每个 pH 条件，将 4.4 ml 主混合液用移液器加入 50 ml 锥形管中。
3. 对于 pH 高于 5.8 的条件，向管中加入 0.6 ml 相应 pH 调节的 500 mM Tris 储备液；对于 pH 5.8 及更低的条件，加入 0.6 ml 相应 pH 调节的 500 mM MES 储备液。
4. 配制 5 ml 缓冲液，其中含 300 mM NaCl、2 倍蛋白酶抑制剂、60 mM Tris（调至 pH 7.4）和 ddH₂O。该溶液将作为无去垢剂对照梯度缓冲液。
5. 如有必要，分别加入浓盐酸或氢氧化钠溶液，将各溶液的 pH 精细调节至 pH 7.4、6.4、5.8、5.4 和 5.0。
6. 将 5 ml 50% 甘油储备液加入 5 ml 含去垢剂和不含去垢剂的缓冲液混合物中，得到六种不同的 25% 甘油溶液。使用 pH 指示试纸验证 pH 值。
   注意：若测得的 pH 值与目标值差异显著，应重新配制相应溶液。
7. 通过将 50% 甘油储备液与 dH₂O 按 3:7 的比例混合，配制 15% 甘油溶液。

3. 流感病毒的超速离心

1. 使用5 ml注射器和针头（21 G，9 cm长）将3 ml 15%甘油溶液加入超透明离心管（13.2 ml，14 mm × 89 mm）中。避免在管内壁残留液滴，以免干扰梯度的完整性。重复此操作，共准备六根离心管，分别用于五个待测pH条件及一个对照样品。
2. 使用5 ml注射器和长针头，将3.4 ml 25%甘油溶液小心地注入15%甘油层下方，注意避免混合两层液体。针对所有六种待测条件，分别使用pH值已调节的甘油溶液重复此步骤。
   注意：以下步骤需在II级生物安全柜中进行。
3. 用1 ml MNT缓冲液稀释含IAV（X31，H3N2）的澄清尿囊液30 µl（每梯度对应约20–30 µg总病毒蛋白），轻柔地覆盖在甘油梯度上方。
4. 将相对的离心管平衡后放入SW41超速离心转子中。在55,000 x g和12 °C条件下离心150分钟。
5. 离心后，小心移除上清液， 即使用干净的巴斯德移液管和抽吸装置，移除上下两层甘油。将沉淀重悬于40 µl（1倍体积）非还原性LDS上样缓冲液中。需反复吹打数次，以确保沉淀完全溶解。将样品转移至1.5 ml微量离心管中。

4. 上清组分的SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色

1. 将所有样品在 95 °C 下加热 10 分钟。此时样品可保存在 -20 °C，直至进行 SDS-PAGE 分析。
2. 将 20 µl 溶解后的沉淀物上样至预制的梯度（4-12%）Bis-Tris mini 胶，在 1x MOPS SDS 电泳缓冲液中以 200 V 电压运行 1 小时。
3. 用 40% 甲醇和 10% 冰醋酸溶于 ddH₂O 中配制固定液。
4. 将凝胶在固定液中孵育 1 小时，然后在 15 cm 细胞培养皿中加入足量胶体考马斯亮蓝染色液，于室温轻轻振荡过夜染色。
   注意：必须封闭培养皿以避免染色液蒸发。
5. 用 ddH₂O 对凝胶进行脱色，每 15–20 分钟更换一次 ddH₂O，直至凝胶背景清晰。将凝胶保存在 4 °C 的 ddH₂O 中，直至进行条带定量扫描。
6. 高分辨率扫描凝胶，并使用市售或自行开发的软件对蛋白质条带强度进行定量。从目标条带附近的区域扣除背景信号，并将所得数值归一化至无去垢剂的对照样品（pH 7.4）。

结果

如前所述，流感病毒（IAV）核心需要在内体中进行引发，才能获得脱壳能力。核心的质子化会削弱M1蛋白与vRNP（由病毒RNA、NP蛋白以及聚合酶复合物PB1/PB2/PA组成）之间的相互作用。该过程始于病毒进入早期内体（EEs）并暴露于pH 6.5（或更低）环境时，并持续至病毒在晚期内体（LEs）中于pH约5.0条件下发生膜融合为止。

为了模拟pH值的降低，将甘油梯度的底层pH值在恒定盐浓度下调节至7.4至5.0之间。来源于澄清尿囊液的X31病毒经速度梯度离心后，通过SDS-PAGE进行分析（图2A、B）。当梯度中不含去垢剂时（图2A，泳道1），完整病毒颗粒被沉淀下来，这在考马斯亮蓝染色凝胶中表现为特征性条带模式，包括代表血凝素（HA1和HA2；63 kDa）、核蛋白（NP；56 kDa）和基质蛋白M1（27 kDa）的条带。由于凝胶电泳在非还原条件下进...

讨论

病毒衣壳是亚稳定的大型分子复合物。病毒颗粒的组装需要对病毒基因组进行包裹和压缩，而启动下一轮感染则依赖于这种致密衣壳结构的解离。病毒在进化过程中利用了多种细胞机制来调控脱壳与再组装的循环过程，包括细胞受体、分子伴侣、蛋白水解酶、由马达蛋白或解旋酶提供的物理作用力，以及pH和离子开关等。^26,27在此，我们描述一种 体外 基于甘油梯度离心的方法，可特异性检测促进流感病毒A型（IAV）核心解离的因子的作用。该技术有望被改造用于解析其他包膜病毒的脱壳过程。

通过使用胶体考马斯亮蓝染色，即使病毒颗粒数量相对较少，也能在SDS-PAGE中清晰检测到甲型流感病毒（IAV）的主要结构蛋白M1、NP和HA。然而，对沉降的衣壳结构及其组成的更深入表征则需要后续分析，例如电子显微镜（如先前报道²⁸）、蛋白质印迹（Western blotting）、动态光散射或质谱分析。本方案的进一步拓展可包括对较低层（25%）甘油相进行分级分离，并分析其特定的核心组分。

将下层甘油调节至最佳融合pH值...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cOmplete™，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂	Sigma-Aldrich	11873580001	储存液可在2至8°C下保存1至2周
冰醋酸	Merck Millipore	100063
无水甘油 BioChemica	AppliChem	A1123
盐酸	Merck Millipore	100317
长注射针头（21 G，9 cm，斜面或钝端）
MES水合物	Sigma-Aldrich	M8250
甲醇	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	现可商业购得为IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris迷你胶，10 孔，1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS上样缓冲液（4x）	Life Technologies	NP0008
NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液（20x）	Life Technologies	NP0001
pH指示试纸，pH 4.0-7.0	Merck Millipore	109542
QC胶体考马斯亮蓝染色液	BIO RAD	1610803
氯化钠	Merck Millipore	106406
氢氧化钠	Merck Millipore	106498
Steritop滤器单元	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti超速离心转子组件	Beckman Coulter	331336
薄壁超透明离心管，13.2 ml，14 mm × 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris盐酸盐	AppliChem	A1087
X31甲型流感病毒（H3N2），鸡蛋培养，澄清的尿囊液	Virapur		在4°C下新鲜解冻