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方法文章

研究Wnt信号通路在传导性气道模式形成过程中的作用

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DOI：

10.3791/53910

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2016年10月16日

 ,  , 
1Neonatology and Pulmonary Biology-Perinatal Institute, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati, College of Medicine

本文内容

摘要

利用报告基因小鼠结合整体染色和切片染色、显微镜观察以及体内检测，有助于分析呼吸道正常模式形成背后的机制。本文描述了这些技术如何促进对气管发育过程中Wnt信号通路的研究。

摘要

Wnt 信号通路在呼吸道发育过程中发挥着关键作用。要理解组织在正常发育过程中如何形成特定模式，必须明确 Wnt 信号所调控的细胞分化与形态发生的具体机制。这些知识对于确定先天性出生缺陷（如肺发育不全和气管支气管软化症）的病因也至关重要。由于组织量极为有限，对呼吸道发育最早阶段进行研究面临挑战，这限制了适用于出生后研究的标准实验方案的应用。本文讨论了研究呼吸道细胞分化与增殖的方法，包括整体染色、共聚焦显微镜样品制备以及石蜡切片免疫荧光技术在发育中气管和肺组织中的应用。我们还介绍了研究气管间充质分化的技术，特别是软骨形成过程。本文所述的方法和技术克服了胚胎组织材料稀缺的限制，有助于更深入地理解发育中传导性气道的模式形成过程。

引言

呼吸系统发育始于胚胎第9天（E9），此时在腹侧内胚层前肠中出现Nkx2.1阳性细胞1,2。食管-气管管状结构的分离在E11.5时完成，此时两者已可明确区分为独立结构，各自被间充质组织包绕3。Wnt信号通路在呼吸系统特化过程中发挥关键作用，源自脏侧间充质表达的Wnt2和Wnt2b基因缺失，或内胚层呼吸上皮中β-catenin基因的缺失，均可导致肺发育不全4,5。我们先前的研究发现，在内胚层呼吸系统中特异性敲除Wls（一种介导所有Wnt配体分泌的运输受体）会导致肺发育不全、肺血管发育缺陷以及气管间充质的模式形成异常6,7。这些数据支持上皮-间充质间相互作用在细胞分化与特化过程中的重要性，这一点也在其他研究中得到证实8,9。

对肺发育最早阶段的研究依赖于遗传学、体外（in vitro）和离体（ex vivo）技术，这些技术使我们能够更深入地理解驱动呼吸系统身份建立的机制10-16。在气液界面进行的全肺外植体培养已被广泛用于研究生长因子在肺分支形态发生早期阶段的作用10,17,18。尽管该方法可用于观察形态学变化（如分支形态发生）以及基因表达调控，但其应用局限于发育过程的早期阶段，因为该培养体系本身无法支持血管系统的发育17。气管软骨的发育需要更长的孵育时间，这可能与该培养技术的适用条件不相容。

为了分析Wnt信号通路在呼吸道形成过程中的作用，我们对标准实验技术进行了改进，以满足胚胎学研究的需求。我们调整了试剂用量、染色时间、石蜡包埋的处理循环以及气管-肺组织透明化的时间。本研究中所描述技术优化的主要目标是分析小鼠气管发育的最早阶段，该阶段发生在胚胎发育第11天至第14.5天（E11至E14.5）。利用报告基因小鼠品系Axin2LacZ，我们精确定位了发育中气管间充质内Wnt/β-catenin信号活性的部位。我们还改进了凝集素染色方法，用于整体气管组织的染色。因此，我们能够可视化间充质的凝聚区域，并预测软骨形成将发生的部位。通过对WlsShhCre小鼠来源的胚胎组织整体标本及切片进行染色，并结合先进的显微成像技术，我们揭示了由气管上皮产生的Wnt配体在气管模式形成中的作用。

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方案

动物饲养于无病原体环境中。小鼠的处理遵循辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会（CCHMC IACUC，美国俄亥俄州辛辛那提）批准的方案。本研究中使用的小鼠维持在混合遗传背景中。

1. 全胚胎X-半乳糖苷酶染色

  1. 在E11.5至E14.5天处死怀孕雌鼠，采用CO2 吸入。将动物置于CO2 腔室，向腔室充入 CO2将动物置于舱内至少5分钟。通过颈椎脱位实施二次安乐死方法。
  2. 用70%乙醇（EtOH）清洁腹部区域，沿腹中线做单一切口进行剖腹手术。使用手术剪和标准型（直齿状）镊子。
  3. 用镊子和精细剪刀分离子宫角，并立即将组织置于含有预冷PBS溶液的培养皿中。在进行胚胎分离前，将组织保持在冰上。
  4. 从子宫角中分离胚胎。在解剖显微镜下解剖胚胎气管肺组织。使用尖头镊子和剪刀夹持并穿刺子宫组织。 概念 释放胚胎。
    1. 去除残留的胚胎膜。在针叶的辅助下，切除胚胎的头部以及膈肌以下的下部躯体。以肝脏作为解剖标志。
    2. 分离胚胎胸段后，使用针刀去除体壁的两侧、脊柱和心脏。在去除心脏时需小心操作，避免损伤气管组织。最后，借助针刀轻轻牵拉食管，将其与气管仔细分离。将组织置于冰上含有PBS溶液的容器中保存。
  5. 将组织放入4 ml螺口小瓶中，使用玻璃或移液管进行转移。用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定气管肺组织30分钟。固定后，用PBS冲洗组织。在冲洗过程中，配制X-gal染色液（加入5 mM K3Fe(CN)6, (100 μl 0.5 M 储液) 5 mM K4Fe(CN)6 (100 μl 0.5 M 储液) 2 mM MgCl2, (20 μl 1 M 储液) 0.01% NaDOC (50 μl 2% 储液)，0.02% NP4O（100 μl 2% 储液），1 mg/ml X-gal（500 μl 20 mg/ml 储液），加蒸馏水至终体积 10 ml。
  6. 除去残留的 PBS，向玻璃小瓶中加入 2 ml X-gal 染色液。将小瓶置于摇床上的托盘中，在 X-gal 染色液中染色 1 至 2 小时。如需进一步处理和包埋，将组织在 X-gal 溶液中孵育 4 小时。
  7. 用3%二甲基亚砜-PBS洗涤组织以终止反应，随后用PBS冲洗，每次5分钟，共洗3次，并将组织保存于70%乙醇中。
  8. 用1%琼脂糖/PBS溶液填充培养皿，待琼脂糖凝固。使用玻璃移液管将组织置于含有PBS溶液的琼脂糖包被培养皿上。使用解剖显微镜拍摄整体装片图像，选择合适的明场滤光片。
  9. 为了更清晰地区分X-gal染色位点，处理样品以进行石蜡包埋和切片。将样品置于细网筛盒中。
    1. 使用自动组织处理机对样本进行石蜡包埋前处理，设置短程序如下：酒精置换六次，第一次5分钟，其余每次3分钟；二甲苯置换三次，第一次5分钟，后两次各3分钟。上述步骤均在30 °C下进行。最后，在62 °C下进行三次石蜡置换，时间分别为25分钟、8分钟和5分钟。
  10. 将样本定向放置于包埋盒中，确保组织平贴于包埋盒底部。小心加入石蜡，注满包埋盒。立即置于包埋机冷台上冷却，直至石蜡完全凝固。将包埋块从包埋盒中取出。使用切片机切取6 μm厚的切片。将切片捞至预处理过的载玻片上，置于42 °C的玻片烘箱中干燥1小时。
  11. 在56 ºC烘箱中将载玻片烘烤过夜。将载玻片放入染色架中。用三次更换的100%二甲苯对载玻片进行脱蜡，每次10分钟。使用装有200 ml二甲苯的染色缸。
  12. 使用梯度乙醇（100%、70%、50% 和 30%，每步 1 分钟）将切片水化至 PBS，然后用核快红复染 10 至 30 秒。用自来水冲洗切片三次，每次 5 分钟，以去除多余的核快红。
  13. 在梯度乙醇系列（50%、70% 和 100% 乙醇）中脱水后，用二甲苯更换三次（每次 20 次浸洗），再用基于二甲苯的封片介质进行封片。

2. 凝集素染色

  1. 按照步骤 1.1 至 1.4 所述方法分离 E13.5 和 E14.5 胚胎的气管肺组织。使用玻璃移液管将组织放入带螺口盖的样品瓶中。加入 2 ml 2% 多聚甲醛（PFA）溶液，在 4 °C 下固定过夜。固定完成后，用 PBS 漂洗样本三次，每次 10 分钟。
  2. 配制封闭缓冲液，通常终体积为 10 ml。将 0.1 g BSA（1%）加入 8 ml PBS 中，待其完全溶解。再加入 0.2 ml 山羊血清（2%）和 0.03 ml Triton X-100（0.3%），最后用 PBS 定容至 10 ml。将样本置于 0.5 ml 封闭缓冲液中，在室温下封闭 1 小时。
  3. 用移液管吸除封闭缓冲液，替换为含 50 μg/μl 凝集素、10% 山羊血清和 PBS 的凝集素溶液。每份样本使用 250 μl 凝集素溶液，在 4 °C 下孵育过夜。确保用铝箔包裹装有组织的玻璃瓶以避光。凝集素溶液孵育结束后，用 PBS 漂洗样本三次，每次 10 分钟。
  4. 将组织外植体置于涂有琼脂糖的培养皿中，加入足量 PBS 浸没样本。使用荧光解剖显微镜拍摄整体样本图像。选择合适的滤光片以检测荧光信号。凝集素 PNA 通常与 GFP 荧光蛋白偶联。

3. 全胚免疫荧光染色与共聚焦显微镜观察

  1. 分离气管肺组织，转移至4 ml玻璃螺口瓶中，用4% PFA固定过夜。E11.5时期的组织可用2% PFA固定。随后置于100%甲醇中保存。样品可在-20 °C下保存数月。
  2. 用移液管去除甲醇，使用Dent's漂白液（4份甲醇、1份DMSO和1份30% H2O2）对样品进行2小时的通透处理。随后按以下梯度系列用PBS稀释的甲醇对组织进行水化：100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、100% PBS，每步在室温下孵育10分钟。
  3. 将组织在含0.5%封闭试剂的PBS溶液中（详见材料部分）于室温下振荡封闭2小时。
  4. 将一抗按适当比例（Sox9 1:100，Nkx2.1 1:200，αSMA 1:250）稀释于封闭液中，4 °C孵育过夜。用PBS在室温下洗涤样品五次，每次洗涤持续1小时。
  5. 将二抗按1:500比例稀释于0.5%封闭液中，注意选择不会相互结合的二抗。在避光条件下4 °C孵育过夜。室温下洗涤三次，每次20分钟。随后按以下梯度系列用PBS稀释的甲醇对样品进行脱水：25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇，每步10分钟。
    注意：确保样品始终用铝箔覆盖，尽量减少光照暴露。组织可在4 °C下保存数周，直至拍照。
  6. 将样品转移至定制的载样板，去除甲醇后，在成像前立即加入约200 μl Murray透明液19,20（2份苯甲酸苄酯，1份苯甲醇）进行透明处理。使用共聚焦显微镜拍照，并利用图像分析软件对图像进行处理与分析。

4. 细胞增殖

  1. 在E11.5天对怀孕小鼠进行腹腔注射，注射浓度为每克体重100 μg BrdU的BrdU溶液。按照方案第1节所述处死雌鼠，并在E12.5或E13.5天分离胚胎。使用刀片切除头部以及胸腔以下的躯体下部。
  2. 将胸部组织置于4 ml螺口小瓶中，加入1 ml 4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。用PBS清洗样本两次，每次5分钟；随后通过蒸馏水配制的乙醇梯度溶液进行脱水处理，依次为30%、50%和70%乙醇，每步5分钟，直至70%乙醇。
    1. 将样本放入中等大小的组织包埋盒中，使用自动组织处理仪进行石蜡包埋处理。设定程序如下：酒精更换6次，每次8分钟；二甲苯更换3次，每次6分钟；石蜡更换3次，时间分别为25分钟、9分钟和8分钟。
  3. 将组织包埋于石蜡中，并按所需方向定位，以获得6 μm厚度的横切或纵切切片（具体方法见第1节）。将切片贴附于载玻片上，并在42 °C的玻片加热器上孵育1小时，使组织牢固粘附于载玻片。
  4. 将载玻片侧立，在56 °C烘箱中烘烤过夜。将载玻片放入塑料染色架中，通过浸入三轮100%二甲苯（每轮10分钟）进行脱蜡处理，每轮使用200 ml二甲苯以完全浸没载玻片。随后用梯度乙醇溶液（100%、70%、50%和30%，每步5分钟并轻轻振荡）逐步水化，最后转入PBS中清洗5分钟。
  5. 使用pH 6.0的10 mM柠檬酸缓冲液进行抗原修复。配制100 ml柠檬酸缓冲液：取0.1 M一水合柠檬酸溶液18 ml与0.1 M柠檬酸钠溶液82 ml混合均匀。
    1. 将样本放入盛有抗原修复液的塑料Coplin瓶中，高功率微波加热6.5分钟。向Coplin瓶中添加蒸馏水以补充蒸发损失的柠檬酸缓冲液，然后以40%功率再次加热6分钟。
    2. 将Coplin瓶加满水，再次以40%功率微波加热6分钟。微波加热时间可能因所用微波炉型号不同而有所调整。
    3. 室温下冷却20分钟后，用蒸馏水清洗1分钟，再用PBS清洗5分钟。PBS清洗后，在封闭液中封闭2小时，封闭液成分为TBS（2.425 g Tris碱和8.765 g NaCl溶于1 L蒸馏水中）、10%驴血清和1% BSA。
  6. 将一抗用封闭液（含10%驴血清和1% BSA的TBS）稀释后加入。所用一抗包括：BrdU（有丝分裂标记物）、Nkx2.1（呼吸道上皮标记物）、Sox9（软骨前体细胞标记物）和αSMA（平滑肌细胞标记物）。4 °C孵育过夜。采用覆盖法以节约抗体用量：将180 μl抗体溶液加至密封垫圈上，再将载玻片盖上，如同加盖盖玻片。
  7. 通过将载玻片浸入蒸馏水中去除密封垫圈。取下垫圈后，用含0.1% Tween-20的TBS溶液清洗六次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。
    1. 将载玻片与用封闭液按1:200稀释的二抗在室温下孵育1小时。应谨慎选择二抗，避免产生非特异性交叉结合。用含0.1% Tween-20的TBS溶液清洗三次，每次5分钟，以去除未结合的二抗。
    2. 用0.1 M Tris碱溶液清洗两次，每次5分钟；再用0.05 M Tris碱溶液清洗两次，每次5分钟。可在0.05 M Tris碱溶液中暂存载玻片，同时使用含或不含DAPI（1.5 μg/ml）的封片剂进行封片。将载玻片存放在玻片盒中，置于4 °C保存，并用铝箔包裹玻片盒以避光。
  8. 使用自动荧光显微镜观察染色结果并拍照。在20X和40X放大倍数下，统计每个视野中标记细胞与总细胞数量，计算增殖细胞占总细胞的比例。

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结果

Wnt/β-catenin 活性

通过对报告基因 Axin2Lac-Z 小鼠11 胚胎分离得到的气管-肺组织进行整体染色，检测到β-半乳糖苷酶（Lac-Z）染色信号。染色部位指示Wnt/β-catenin信号通路的活性。对整体染色样品进行切片分析发现，Wnt/β-catenin信号活性存在于气管间充质以及发育中肺外周区域的间充质中。而在WlsShhCre胚胎（呼吸道上皮细胞分泌Wnt配体的功能被阻断）中，Lac-Z染色几乎完全消失（图1）。

气管间充质中的间充质凝聚

软骨形成过程...

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讨论

呼吸系统形态发生过程中所涉及的事件尚未完全阐明，特别是传导性气道模式形成的机制。以往的研究采用了ex vivo技术，将发育中的组织外植体在气-液界面培养或包埋于Matrigel中21,22。这些研究揭示了生长因子如何影响气管发育过程中的模式形成以及气管软骨的生成。然而，这些研究的局限性在于组织结构未能得到良好维持，因此可能无法准确再现in vivo软骨形成的生理过程。

我们为研究Wnt信号通路在传导性气道模式形成过程中的作用所采用的方法，包括结合整体染色技术、免疫荧光和成像的体内研究。对整体组织进行X-gal染色后继以切片和复染，相比石蜡切片染色具有优势。整体染色可直接检测Wnt/β-catenin活性发挥作用的部位。此外，对染色后的组织外植体进行切片，能够确定在发育进程中间充质中活性所在的具体位置。这种方法比在石蜡切片中检测β-半乳糖苷酶酶的表达更为准确和可靠。尽管酶活性可在切片中被检测到，但该过程需要制备冰冻切片，而冰冻切片并不总是易于制备，且可能无法很好地保存小样本的组织结构。本文所述方案的一个局限性...

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披露

"作者无任何利益冲突需要披露。"

致谢

我们感谢Mike Muntifering和Matt Kofron在共聚焦成像方面的协助，以及Gail Macke在组织学实验操作中的帮助。本研究工作部分由美国国立卫生研究院-国家心肺血液研究所（NIH-NHLBI）资助（项目编号K01HL115447，授予D.S.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 Sox9 抗体MilliporeAB55351:400 ，兔源
抗 Sox9 抗体Santa CruzSc-200951:50，兔源
抗平滑肌肌动蛋白抗体SigmaA52281:2k，小鼠源
抗 NKX2.1 抗体Seven Hillsn/a1:100，豚鼠源
抗 NKX2.1 抗体Seven Hillsn/a1:400，小鼠源
抗 Brdu 抗体AbcamAB18931:200，绵羊源
抗 Brdu 抗体Santa CruzSc-323231:4k，小鼠源
PNA 凝集素SigmaL 7381
二抗Life technologiesAlexa fluor 分子探针
K3Fe(CN)6SigmaP8131
K4Fe(CN)6Sigma-AldrichP3289
MgCl2Sigma-AldrichM9272
NaDOCLife Technologies89905
NP4OLife Technologies85124
阿尔新蓝 8GXSigmaA-3157
Fisher 品牌超白片Fisher12-550-15
多聚甲醛（16%）EMS15710
PBSGibco70011-044
胎牛血清Sigma11K413
封闭试剂InvitrogenTSA 试剂盒 #2 的组分   （T20932）
BrDuSigmaB5002-5g
Vectashield 封片剂Vector labsH-1000
PermountFisherSP15-500
组织定位盒 HistoscreenFisherC-0250-GR
活检盒PremiereBC0109提供多种颜色
核固红  0.1% KernechtrotSigmaN3020
柠檬酸SigmaC1909-500G
三水合柠檬酸钠SigmaS4641-1Kg
Trizma 盐酸盐SigmaT5941-500G
二甲苯Pharmco-AAPER399000000
乙醇Pharmco-AAPER111000200
微型刀片FST10318-14
Dumont #5 陶瓷涂层FST11252-50
Dumont #5COFST11295-20
Dumont # 5FST91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ESThermo Fisher
切片机LeicaRM2135
Nikon i90Nikon宽场显微镜
NikonA1RsiNikon共聚焦显微镜。设置：NikonA1 plus 相机，扫描器：Galvano，探测器：DU4。光学：Plan Apo lambda 10X。模式：宽场荧光激光共聚焦。 
Leica MS 16 FALeica荧光解剖显微镜
ZeissZeiss自动化荧光显微镜
Leica Application SuiteLeicaLeica 成像软件
NISNikonNikon 成像软件
IMARISBitplane图像处理软件

参考文献

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