单探针的应用：常温条件下的质谱成像与单细胞分析

摘要

本文介绍了对组织进行常温质谱成像（MSI）的实验方案 原位 使用单探针（一种用于质谱分析的微型多功能装置）进行活体单细胞质谱（SCMS）分析。

摘要

质谱成像（MSI）和 原位 在常温常压条件下进行的单细胞质谱（SCMS）分析是两个具有广阔前景的新兴领域，可实现对生物样品中生物分子的高精度质谱（MS）分析。单探针是一种微型化装置，集成了取样与电离功能，能够同时执行常温质谱成像（ambient MSI）和 原位 SCMS分析。在常压质谱成像（ambient MSI）中，单探针通过表面微萃取技术对样品进行连续的质谱分析，该方法能够从生物样品（如小鼠脑和肾组织切片）获得具有高空间分辨率（8.5 µm）的质谱图像。常压质谱成像的优势在于分析前几乎无需样品预处理，从而减少了数据采集过程中潜在的人为假象，使样品的分析结果更具代表性。对于 原位 SCMS中，由于采样探针尖端尺寸较小，单探针尖端可直接插入活体真核细胞（如HeLa细胞）内< 10 µm），并且该技术能够在接近实时的条件下检测单个细胞内多种多样的代谢物。单细胞质谱技术（SCMS）能够在单细胞水平上获得更高灵敏度和准确性的化学信息，从而加深我们对生物过程在比以往更基础层面上的理解。该单探针装置可与多种质谱仪联用，适用于广泛的空间代谢组学成像（MSI）和单细胞质谱（SCMS）研究。

引言

质谱成像（MSI）是一种相对较新的分子成像技术，可用于提供目标化合物在表面的空间分布信息。在MSI分析过程中，质谱（MS）测量以单个像素为基础在整个表面上进行，从而生成目标物种的二维图像¹。MSI技术能够对多种代谢物提供空间分辨的特征分布，使从样品中获得的信息量远超传统分子成像技术，并有望显著提升生物学和药理学研究中对生物样本的分析能力²。MSI技术 broadly 可分为非环境离子化和环境离子化两类。非环境MSI分析技术，如基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱³和飞行时间二次离子质谱（ToF SIMS）⁴，具有高空间分辨率（分别为约5 µm和100 nm）和高灵敏度。然而，这些方法需要复杂的样品前处理，例如在样品表面施加基质分子，且需在真空采样环境中进行，这可能引入数据伪影。而环境离子化技术，如解吸电喷雾电离（DESI）质谱⁵、激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）质谱⁶和纳米DESI质谱⁷，可在常压环境下对样品进行几乎无需前处理的质谱成像，从而生成更可能反映样品原始状态的质谱图像。然而，与非环境技术相比，这些技术通常在空间分辨率和检测灵敏度方面有所不足，实验中每个像素通常约为150 µm⁸。

单细胞分析（SCA）是一个不断发展的领域，能够对生物样品在细胞水平上进行化学成分表征。与传统的细胞分析技术相比，SCA可在更基础的层面上研究生物系统；传统方法通常提供细胞群体的平均结果，而单细胞分析则可能揭示以往难以获得的生物学见解⁹。近年来，质谱技术已应用于单细胞分析（称为单细胞质谱分析，SCMS），包括使用非环境电离技术，如基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI MS）¹⁰和飞行时间二次离子质谱（ToF SIMS）¹¹，这些方法需在分析前对细胞进行预处理；同时也包括环境电离技术，如激光烧蚀电喷雾电离质谱（LAESI MS）¹²，以及直接提取方法，例如活体单细胞视频质谱（live single-cell video-MS）^{13, 14}，用于分析多种类型的细胞，如卵细胞、植物细胞和癌细胞。环境电离技术的优势在于可直接应用于活细胞，从而进一步减少人为假象，更真实地反映活细胞内代谢物的状态。然而，上述基于直接提取的方法将样品提取与分析过程分为两个步骤，导致分析过程中存在时间间隔，可能改变样品中代谢物的组成。

单探针，一种微型多功能装置，能够对生物组织切片进行高空间分辨率的常温质谱成像 ¹⁵ 近实时 原位 活体单细胞上的SCMS ¹⁶单探针采用一体化结构，由拉制的双孔石英毛细管与溶剂供给入口及熔融石英毛细管制成的纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射器耦合而成，可在单一装置中实现溶剂输送与分析物提取。在常压质谱成像（MSI）模式下，将单探针置于样本组织表面，进行表面微萃取，从而获得高空间分辨率的光栅扫描质谱图像。特别是，单探针的锥形尖端足够细小，可插入活体真核细胞内进行操作。 原位 SCMS 分析中，从探针插入到质谱检测的代谢物检测耗时不到两秒，可实现近实时的化学信息采集。以下是单探针装置的制备方案，以及利用单探针质谱技术进行常压质谱成像（MSI）和 SCMS 模式检测的操作流程。

方案

动物的使用与福利应遵循经机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的《NIH 实验动物护理和使用指南》。小鼠组织样本由合作者 Chuanbin Mao 博士提供。

1. 小鼠组织切片制备

1. 放置一个完整的小鼠目标器官（脑、肾、肝） 等等。) 注入小塑料孔的中心（例如，12孔细胞培养板），并用包埋剂浸没至约10 mm高度。确保包埋剂中无气泡产生，且器官处于预期的方向即，矢状，冠状 等等。).
2. 立即将组织放入液氮中进行速冻。如需长期保存，应将冷冻样品置于 -80 °C 超低温冰箱中储存。
3. 取冷冻的小鼠器官，在温度可控的冷冻切片机中解冻至 -15 °C。
4. 用约500 µl包埋剂将组织固定于钢制底座上，然后置于冷冻切片机切片托架，使组织处于所需切片方向对准刀刃。
5. 将组织切成12 µm厚度。将切好的组织切片置于聚碳酸酯显微镜载玻片上，室温下干燥30分钟。如需长期保存，将冷冻载玻片存放在-80 °C冰箱中。

2. 细胞培养

注意：细胞培养在生物安全柜（生物安全二级）中的无菌条件下进行。以 HeLa 细胞系作为模型系统，细胞使用完全培养基，按照以下常规方案进行培养：

1. 将试剂（即，胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）和细胞培养基）预热至 37 °C。
   注意：细胞培养基含有无机盐、氨基酸、维生素等成分。有关成分的完整列表，请参考生产商提供的配方。
2. 取细胞样品（例如，1 ml HeLa 细胞悬液），将其加入标准 10-cm 细胞培养皿中的 9 ml 完全细胞培养基中。初始细胞密度约为 0.5 × 10⁶ 细胞/ml。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 2–3 天，直至细胞培养皿表面有 70–80% 被细胞覆盖。记录每次传代的细胞代数。
3. 在细胞培养皿中进行细胞传代（即，细胞分种）。
   1. 吸除生长培养基，用 5 ml 1× PBS 清洗细胞。使用无菌吸头去除 PBS，然后加入 2.5 ml 胰蛋白酶（0.25%）于 37 °C 孵育约 5 分钟，使细胞从培养皿表面脱落。
      注意：实际胰蛋白酶处理时间需根据所购自生产商的具体产品进行优化。处理时间不足会导致细胞仍附着于培养皿，而处理时间过长则会引起细胞死亡。
   2. 加入 7.5 ml 完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，随后将细胞均匀重悬（总体积 10 ml）。将所得细胞悬液用于后续培养（步骤 2.2）或 SCMS 样品制备（步骤 2.4）。
4. 为 SCMS 实验准备细胞样品。
   1. 将单个微型盖玻片放入 12 孔板中，每孔加入 1.8 ml 细胞培养基和 0.2 ml 细胞悬液。
   2. 轻轻晃动培养板使细胞均匀混合，并在 37 °C、5% CO₂ 环境中孵育约 24 小时。如需对培养细胞进行药物处理，可将药物化合物溶液（例如，溶于 DMSO（二甲基亚砜））加入 12 孔细胞培养板中。
      注意：最终药物浓度（例如，10 nM、100 nM、1 µM 和 10 µM）及处理时间（例如，4 小时）应根据具体研究目的进行调整。细胞将附着于微型盖玻片上，可用于后续 CSMS 实验（步骤 6）。

3. 单探针制备

1. 将双孔石英毛细管（内径（I.D.）127 µm，外径（O.D.）500 µm）放入激光微电极拉制仪中，拉制双孔石英针。可使用以下参数作为起始值：加热（Heat）= 400，拉力（Fil）= 3，速度（Vel）= 80，延迟（Del）= 150，拉力持续时间（Pul）= 250（所有单位均为仪器制造商单位）。确保拉制出的双孔石英针具有锥形尖端，以获得最佳探针性能。将拉制后的尖端切断，使另一端保留约 5 mm 未拉制的双孔石英毛细管。
   注意：激光拉制仪的实际参数应根据仪器的具体条件进行优化。
2. 截取一段约 80 mm 的熔融石英毛细管（内径 40 µm，外径 105 µm）作为溶剂供给毛细管，并将其插入双孔石英针扁平端的一个孔中。
3. 截取一段约 40 mm 的熔融石英毛细管（内径 40 µm，外径 105 µm），用剃刀从其中部去除约 5 mm 的聚酰亚胺涂层。使用丙烷火焰快速加热并拉伸该熔融毛细管，制成具有细锥形的纳米电喷雾电离（ESI）发射器。截取一段纳米ESI发射器（长约 7–10 mm），将其插入双孔石英针扁平端的另一个孔中。也可使用激光拉制仪制备细锥形。
4. 在双孔石英针的扁平端滴加少量（约 1–2 µl）紫外光固化树脂，使用LED紫外灯照射约 20 秒以固化树脂，从而固定溶剂供给毛细管和纳米ESI发射器。将各部件组装成单探针的步骤如图1a所示。
5. 将标准显微镜玻片（1" × 3"）沿长度方向切成两半。将单探针放置在玻片一端，使纳米ESI发射器朝外。在单探针主体上涂抹普通环氧树脂，使其牢固固定在玻片上（图1b）。静置过夜使其完全固化。将制备好的单探针连接至集成式单探针装置（图1c），该装置如图1d所示连接至质谱仪。

4. 构建集成式单探针质谱装置

1. 改造质谱仪的离子源接口法兰，并制作数字体视显微镜的支架（可调节位置和高度）（图1e和图1f）。
   1. 在离子源接口法兰上钻两个孔，用于固定铝制光学板。制作滑轨装置和高度调节杆（连接至XY平台以实现精细位置调节），使数字体视显微镜系统能够安装在铝制光学板上（图1e）。
2. 将改造后的数字体视显微镜、USB数字显微镜、带柔性夹具的微型手动XYZ平移台以及电动XYZ平移台系统安装到铝制光学板上，该光学板固定在质谱仪定制的离子源接口法兰上（图1c和图1f）。使用柔性夹具固定装有单探针的载玻片。
3. 将单探针装置连接至质谱仪（图1f）。调节柔性夹具和微型XYZ平移台，使单探针的发射端位于质谱仪进样口前方。使用位于单探针侧边的USB数字显微镜（视角可调）放大观察单探针尖端或纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射端，同时利用位于单探针上方的数字体视显微镜（高度可调）观察细胞和探针尖端。
   注意：通过使用相应的离子源法兰，该集成式单探针系统可与任何配备常压电离源的其他类型质谱仪联用。

5. 常温质谱成像

1. 在室温下解冻样品切片，将其放置于单探针下方的电动XYZ平移台系统上。通过调节控制软件中的坐标来调整样品位置。
2. 使用注射器以适当速率泵入采样溶剂（例如，0.2 µl/min），并施加电离电压（例如，5 kV）。采样溶剂的选择具有灵活性，常见的包括甲醇：水（9:1）和乙腈。纳米电喷雾电离发射器的死体积估计约为 ~3 nl，探针与表面接触至观测到离子信号之间的时间通常小于 1 秒 ¹⁵.
   注意：定制的离子源接口法兰可通过鳄鱼夹将质谱仪的电离电压传递至导电接头。电离电压随后通过导电接头传导至毛细管内的溶剂及单探针通道，并施加于纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射端，以实现待测分析物的离子化。连接鳄鱼夹与导电接头时，务必确保电离电压处于关闭状态。
3. 调节单探针的高度，使其刚好位于样品表面之上，能够进行代谢物的表面提取。小心地抬升Z轴载物台，然后使用单探针侧边的USB数字显微镜监测单探针尖端与组织表面之间的距离变化。在调节高度过程中实时监测质谱信号的变化，当观察到离子信号由溶剂背景转变为组织代谢物信号时，停止抬升Z轴载物台。
4. 重复步骤 5.3 三次，以在阶段控制程序中设置三个不同的点，用于自动表面平整调整。将单探针的尖端置于样品表面上相距约 10 mm 的三个不同位置。通过按上升和下降图标进行高度调节，并将这三个点的位置锁定在 "规划方法".
5. 使用该程序设置在样品目标区域进行光栅扫描的其他参数。对于本实验所展示的小鼠肾脏切片，采用10.0 µm/sec的光栅扫描速度和20 µm的线间距。电动载物台系统的最小移动步长为0.1 µm。单探针尖端与组织之间的距离来自步骤5.3。
6. 建立一种从质谱仪自动采集质谱（MS）数据的方法。针对小鼠肾脏样本进行高分辨率质谱成像（MSI）时，采用以下参数：质谱分辨率60,000（m/Δm），正离子模式约5 kV，微扫描次数1次，最大离子注入时间150毫秒，自动增益控制（AGC）开启。所有采集的质谱数据代表质谱图像的每一行，每条谱图具有相同数量的扫描次数，且各次扫描之间的时间间隔均匀，表明所生成图像的像素尺寸分布均匀。
7. 启动 MSI 数据采集。启动质谱仪的质谱采集序列，然后启动 XYZ 控制程序的光栅扫描序列。
   1. 例如，在此处使用的 MS 数据采集程序中，前往 "序列设置"，选择 "新序列"，生成一组新序列文件，编号从01到X，其中X为获取目标质谱图像所需的行数，然后按下 "运行序列".
   2. 使用自制的电子设备，使软件能够产生一个触点闭合信号，以触发质谱仪进行数据采集。电路图见补充图图 S1）作为参考。
8. 使用适当的质谱成像（MSI）可视化软件，从原始质谱文件构建质谱图像。例如，当使用美国西北太平洋国家实验室（PNNL）Laskin 团队开发的软件包时 ¹⁷，执行以下步骤。
   1. 点击 "浏览文件" 选择从MSI实验中获得的第一个文件。在下方指定文件的起始和结束位置 "线条数量" 选择一个范围 m/z 质谱图像范围的数值 "输入质荷比范围".
   2. 按压 "开始" 按钮以启动图像生成过程。一旦生成质谱图像，单击 "保存图像" 在……下方 "工具栏" 将图像存储在计算机中。

6. 原位 活体 SCMS

1. 按照质谱成像（MSI）的说明设置单探针系统。调整溶剂（例如， 甲醇/H₂O 或乙腈）流速（例如，约25 nl/min）。
2. 用 PBS 清洗贴壁生长在微型盖玻片上的培养细胞，以去除培养基和细胞外药物成分。将含有细胞的玻片置于电动化 XYZ 平移台系统上进行实验。
   注意：也可使用新鲜的细胞培养基（不含胎牛血清）冲洗培养的细胞，此方法观察到的离子抑制效应较弱。此外，在环境温度（约 20 °C）显著低于培养温度（37 °C）的实验过程中，细胞可存活更长时间。不同研究中所使用的药物类型、溶液浓度及处理时间各不相同。
3. 将数码体视显微镜（位于样品上方）聚焦于单探针的尖端，以在分析过程中监测细胞穿刺情况。使用USB数码显微镜（位于单探针侧面）监测单探针上纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射器的工作状态。
4. 使用电动XYZ载物台控制程序和数字体视显微镜（位于细胞上方）定位目标细胞，并将单探针尖端精确置于样品上方。在单探针插入细胞前，开始质谱数据采集。
   1. 使用高分辨质谱仪进行质谱分析时，参考以下参数：质量分辨率 100,000 (m/Δm)，正负离子模式下约 3 kV，1 次微扫描，最大注入时间 150 毫秒，AGC 模式开启。通过点击自动采集质谱图 "开始" 在质谱数据采集程序中。
   2. 点击图标抬升电动Z轴，以穿透细胞膜并持续记录细胞产生的质谱信号。探针插入与质谱信号检测之间通常存在1-2秒的时间延迟。作为细胞膜穿透的另一确认依据，可在穿透细胞膜时观察到质谱信号的显著变化。细胞内化合物的质谱信号通常可持续约15-20秒，随后显著减弱。
   3. 降低含有细胞的培养板，将单探针尖端从细胞中抽出。通常需要 <细胞化合物的离子信号需约15秒降至接近噪声水平。随后让溶剂持续流动约3分钟，以彻底冲洗单探针。在此期间，调整电动XYZ载物台系统，定位下一个待分析的细胞。每个细胞的实验过程约需3分钟完成。

结果

单探针已成功用于小鼠肾脏组织切片的常温质谱成像（MSI）分析 ¹⁵。该装置采用表面液体微萃取机制（图1a），可从微小区域高效提取分析物，从而在MSI结果中获得丰富的离子信号强度。例如，某些高丰度代谢物的信号强度已达到10⁷以上（图2a）。通过该方法检测到大量代谢物，包括多种鞘磷脂（SM）和磷脂酰胆碱（PC）类物质，如[SM (34:1) + Na]⁺（725.5575 m/z）、[PC (32:0) + H]⁺（734.5700 m/z）、[PC (34:1) + Na]⁺（782.5696 m/z）和[PC (38:5) + Na]⁺（814.5726 m/z）。当与高分辨质谱仪联用时，这些化合物可通过高质量分辨率和质量精度进行鉴定。例如，在本研究展示的结果中，每种代谢物的鉴定质量精度均优于4 ppm m/z（即实测值与理论值之间的差异）（图2b）。此外，还进行了串联质谱分析（即 MS/MS），以更可靠地鉴定目标物种。¹⁵

由于单探针装置能够在小面积区域上高效地进行液体微萃取，因此可在常温常压条件下用于执行高空间分辨率的质谱成像实验¹⁵例如，已获得小鼠肾脏切片的详细质谱成像，展示了特定代谢物的空间分布（图2c空间分辨率确定为8.5 µm，依据广泛采用的评估标准，即质谱信号强度在20%至80%变化范围内确定锐利特征的过渡点。 ¹⁸ 对于磷脂 [PC (38:5 + Na)] 的情况⁺ 在小鼠肾脏切片上_, 内髓与外髓之间的特征过渡在时间图的一个扫描周期内完成，显示出超过20%至80%范围的强度变化。根据样品移动速度（10.0 µm/sec）和质谱数据采集速率（0.85 sec/谱图），一个质谱扫描周期内的样品移动距离为8.5 µm。 即，MSI的空间分辨率，可以计算（图2d该空间分辨率在针对生物样本的常温质谱成像技术中已达到最高水平之一。

对于单细胞质谱分析（SCMS），单探针能够实现对单个活体HeLa细胞的分析¹⁶。单探针的尖端尺寸通常小于10 µm（图3a），足够小，可直接插入多种直径约为10 µm的真核细胞中，用于细胞内物质的提取和质谱分析。探针尖端插入细胞的过程可通过数字体视显微镜进行可视化监测（图3b），而细胞膜穿透可通过质谱信号从PBS（或新鲜细胞培养基）迅速且显著地转变为细胞内化合物信号来确认（图3c和3d）。实验可在正离子和负离子两种模式下进行，以检测更广泛的分子种类。例如，在正离子模式下鉴定出18种不同的脂质分子，包括鞘磷脂（SM）和磷脂酰胆碱（PC）；而在负离子模式下检测到腺苷磷酸类物质（AMP、ADP和ATP）（图3c和3d）。单探针插入细胞至信号检测之间的时间延迟通常小于两秒，从而实现了对细胞代谢物的近实时检测。SCMS还被应用于抗癌药物（例如，OSW-1、紫杉醇和多柔比星）处理细胞的实验中¹⁹]。在DMSO（二甲基亚砜）中以一系列浓度（即，10 nM、100 nM、1 µM和10 µM）处理4小时后，可在HeLa细胞内检测到相应药物，对照组细胞仅添加DMSO。药物的质谱信号在细胞外PBS或对照组中均未出现（图3e），但通过单探针质谱技术可在单个细胞内检测到（仅显示100 nM处理结果，见图3f）。由于细胞经过PBS（或新鲜细胞培养基）冲洗以去除细胞外化合物和污染物，因此对内源性代谢物（例如，细胞脂质和腺苷磷酸）及外源性化合物（例如，抗癌药物）的检测表明，单探针质谱技术可用于分析细胞内化合物。

图1. 用于常压质谱成像（MSI）和单细胞质谱分析（SCMS）的单探针的制备与装置。 a) 单探针的制备流程。b) 固定在玻璃载片上的已制备单探针的照片。c) 将单探针装置连接至质谱仪的照片。d) 单探针装置与质谱仪耦合的示意图。实验过程中，采样溶剂由注射器持续供给，电离电压从质谱仪端施加至导电接头，使用两个数字显微镜监控样品位置，通过电动XYZ三维移动平台控制系统调节样品运动，并利用质谱仪进行分析。e) 定制的数字体视显微镜系统的照片。f) 数字体视显微镜通过光学板连接至离子源接口法兰的照片。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 小鼠肾组织切片的常压质谱成像研究结果，具有高空间分辨率和高质量分辨率。 a) 单探针质谱成像获得的代表性质谱图。检测到的代谢物最大强度可达 3.39 × 10⁷（任意单位）。 b) 所检测到的部分代谢物及其质量精度信息。 c) 小鼠肾组织切片中 [PC(32:0) + H]⁺ 和 [PC(34:1) + Na]⁺ 的质谱成像结果，空间分辨率为 8.5 µm。PC：磷脂酰胆碱。比例尺：2 mm；插图中为 0.20 mm。 d) [PC(38:5) + Na]⁺ 质谱图像空间分辨率的测定（经参考文献15许可改编）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 高分辨质谱分析环境条件下药物处理的HeLa细胞所得结果。 a) 单探针尖端的放大照片，显示其典型直径< 10 µm。 b) 单探针插入HeLa细胞时拍摄的照片。比例尺：50 µm。 c) 典型的正离子模式质谱图，鉴定了多种PC（磷脂酰胆碱）分子种类。 d) 在正离子和负离子模式下通过SCMS分析HeLa细胞检测到的代表性代谢物列表。 e-f) 对照组和药物处理组（100 nM OSW-1）细胞的质谱图（经参考文献16许可改编）。 请点击此处查看该图的高清版本。

图S1。用于产生接触闭合信号以使质谱仪采集数据的电子设备电路图。请点击此处查看或下载该图。

讨论

单探针是一种多功能装置，可用于质谱成像（MSI）和单细胞质谱（SCMS）实验。单探针装置（包括平移台系统、显微镜、离子源接口法兰） 等等。设计为可灵活适配现有质谱仪的附加组件。单探针装置与传统电喷雾电离（ESI）离子源之间的快速切换可在一分钟内完成。原则上，通过使用适当的离子源接口法兰，单探针装置可适配于其他各类质谱仪。此外，单探针装置可使用含有多种试剂的采样溶剂，用于反应性质谱成像（reactive MSI）和单细胞质谱（SCMS）实验，显著增强了对更广泛生物分子的检测能力。除动物组织和细胞系外，单探针还可用于分析植物等其他生物体系。因此，在相同的实验装置和相似的操作培训条件下，同一仪器和同一操作人员可开展多种研究，从而以最少的培训时间和仪器成本实现高效且多用途的实验。

单探针质谱技术的关键组件是探针本身。单探针的质量对其性能具有显著影响，很大程度上决定了质谱成像（MSI）和单细胞质谱（SCMS）实验的质量。在制备单探针时，务必确保双通道管内的毛细管被牢固粘接，以避免实验过程中发生溶剂泄漏。使用尽可能少的紫外固化环氧树脂至关重要，以防止探针制备过程中堵塞孔口和毛细管。

单探针已用于对生物样本进行高空间分辨率和高质量分辨率的常压质谱成像 ¹⁵环境型质谱成像相较于非环境型方法的主要优势在于，样品前处理步骤极简，且无需真空采样环境，从而使样品能够以接近其天然状态的形式进行分析 ⁸大多数其他常压质谱成像技术面临的主要障碍之一是空间分辨率不足 ¹与基于解吸的质谱成像技术（如 DESI 和 LAESI）相比，单探针的小尺寸尖端可在较小区域内实现更稳定且高效的表面液体微萃取，从而获得 8.5 µm 的高空间分辨率，该分辨率在环境质谱成像技术中属于最高水平之一 ¹⁵此外，调整采样溶剂的组分可为实验提供额外的灵活性。例如，含有试剂的采样溶剂（例如，双阳离子化合物）已被用于开展反应性质谱成像实验，使得每次实验所鉴定的代谢物数量显著增加 ²⁰单探针的另一个优势在于其一体化设计，可在整个数据采集过程中提供便捷的操作体验。由于探针尖端与组织表面之间的距离对离子信号强度和稳定性极为敏感，因此获得平整的组织切片，并进行表面平整调节以最小化距离差异，是实现高质量质谱成像（MSI）实验的关键。因此，单探针MSI技术不适用于对表面不平整样品进行高空间分辨率质谱成像。

除了制备高质量的探针外，仔细调试仪器对于成功的质谱成像（MSI）实验也至关重要。在所有调试步骤中，调节单探针尖端与组织切片表面之间的高度是最关键的一步。调节探针高度时，应泵入采样溶剂并开启电离电压，以便仅能观察到溶剂背景离子信号。随后，在通过电动Z轴平台缓慢降低探针与样品表面距离的同时，密切监测质谱信号的变化，直至观察到强而稳定的来自组织切片的离子信号；此探针高度将用于实验过程中MSI数据的采集。此外，优化的溶剂流速对MSI实验同样至关重要。应在已优化的探针高度条件下调节流速，确保组织表面无溶剂扩散现象即，流速过高）或纳米电喷雾发射器内部产生气泡（即，流速过低。

单探针是一种用于生物分析的多功能设备。除了质谱成像实验外，它还能够进行接近实时的 原位 利用SCMS从活体真核细胞中解析详细的化学信息¹⁶，这与其他基于真空的单细胞质谱技术（如MALDI）相比具有显著优势¹⁰ 和 SIMS²¹）。探针尖端尺寸微小，可插入活体真核细胞内，直接提取并离子化胞内化合物，进而进行即时质谱分析。类似地，含有试剂的采样溶剂（例如，双阳离子化合物）可用于SCMS实验，从而以前所未有的方式在活体单细胞中检测更广泛的细胞组分（正在进行的研究，数据未展示）。尽管实时分析能够提供活体单细胞的化学图谱，但由于探针穿透细胞膜并提取细胞内容物，受测细胞在实验后将死亡，表明单探针SCMS技术仍属于破坏性方法。此外，单探针中的探针尖端和纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射器对于经验不足的操作者而言容易发生堵塞。为降低装置堵塞的风险，在将单探针插入细胞时应避免触碰细胞核。若发生堵塞，可通过自制加热线圈对堵塞的探针尖端或nano-ESI发射器进行加热，从而实现装置的再生。¹⁶单探针SCMS技术的另一个局限性在于，仅能检测贴壁细胞（即, 可通过当前装置分析贴壁细胞（即细胞附着于表面）；然而，若将细胞操控系统整合至单探针质谱装置中，则未来有望研究更广泛的细胞类型。

与MSI实验类似，获得高质量的探针和优化的溶剂流速对于SCMS研究至关重要。调节溶剂流速时，将单探针尖端置于样品上方（即，不与细胞或培养基接触），并确保探针尖端无溶剂滴落，纳米电喷雾电离发射器内无气泡形成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
单探针制备
双孔石英毛细管，1.120’’ × 0.005” × 12”	Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ	MBT-005-020-2Q
微电极激光拉制仪	Sutter Instrument Co., Novato, CA	Model P-2000
熔融石英毛细管，内径：40 µm，外径：110 µm	Molex, Lisle, IL	TSP040105
紫外固化树脂	Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA	Item No. 006.030
LED紫外灯	Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China	LY-C240
环氧树脂	Devcon, Danvers, MA	Part No. 20945
在线微滤器	IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL	M-520
微型连接头	IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL	M-539
显微镜载玻片（玻璃）	C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA	9105
注射器	Hamilton, Reno, NV	1725LTN 250UL
质谱仪
LTQ Orbitrap 质谱仪	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	LTQ Orbitrap XL
Xcalibur 2.1 软件	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	XCALIBUR21
Fance 阶段控制	Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
MSI QuickView	Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
触点闭合装置
USB-6009 多功能数据采集设备	National Instruments, Austin, TX	779026-01
DR-5V SDS 继电器	Panasonic, Kadoma, Japan	DR-SDS-5
逻辑门 50 欧姆线路驱动器	Texas Instruments, Dallas, TX	SN74128N
单探针装置
电动线性位移台及控制器（3套）	Newport, Irvine, CA	Conex-MFACC
微型XYZ位移台	Newport, Irvine, CA	MT-XYZ
XY平移位移台	ThorLab, Newton, NJ	PT1 和 PT102
Thermo LTQ XL 离子源接口法兰	New Objective, Woburn, MA	PV5500
数字立体显微镜，250X - 2,000X	Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China	Supereyes T004
USB数字摄影显微镜	DX.com, HongKong, China	S02 25~500X
注射泵	Chemyx Inc., Stafford, TX	Nexus 3000
实心铝制光学平台，8" x 8" x 1/2"	Thorlabs, Newton, NJ	MB810
柔性夹具支架	Siskiyou, Grants Pass, OR	MXB-3h
溶剂
甲醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34860 Chromasolv
水	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	W4502
乙腈	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34967 Chromasolv
细胞培养
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro, Manasas, VA	10-013-CV
10% 热灭活胎牛血清（FBS）	Gibco/Life Technologies, Long Island, NY	10100-139
青霉素/链霉素	Cellgro, Manasas, VA	30-002-CI
10 mM HEPES（pH 7.4）	Cellgro, Manasas, VA	25-060-CI
磷酸盐缓冲液（PBS）	Cellgro, Manasas, VA	46-013-CM
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	12604-013
12孔板	Corning Inc., Corning, NY	Falcon 351143
T25 培养瓶	Corning Inc., Corning, NY	Falcon 3055
圆形显微镜盖玻片，1号	VWR International, Radnor, PA	48380-046
DMSO（二甲基亚砜）	VWR International, Radnor, PA	BDH1115-1LP
组织成像
冷冻切片机	American Optical Coporation
Tissue-Tek 最佳切割温度（OCT）包埋剂	Sakura Finetek Inc., Torrance, CA	4583
显微镜载玻片（聚碳酸酯）	Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL	P11011P