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一种靶向并分离小鼠气道支配感觉神经元的方法

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DOI：

10.3791/53917

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2016年4月19日

 , 
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

本文内容

摘要

器官特异性感觉神经元难以鉴定。利用荧光示踪剂Fast Blue标记支配气道的结状神经元，用于细胞分选。分选后的结状神经元用于提取高质量核糖核酸（RNA），以进行测序。通过本方案，可确定气道特异性神经元的基因表达谱。

摘要

体感神经可转导由内源性和环境因子引起的热、机械、化学以及有害刺激。这些传入神经元的胞体位于感觉神经节内。感觉神经节支配特定器官或身体部位。例如，背根神经节（DRG）位于脊柱内，其神经突遍布全身及四肢；三叉神经节位于颅骨内，支配面部和上呼吸道；结状神经节的迷走传入纤维则延伸至肠道、心脏和肺部。结状神经元调控多种功能，如呼吸频率、气道刺激和咳嗽反射。因此，为了理解并调控其功能，关键在于识别和分离出特异性支配气道的神经元亚群。在小鼠中，将荧光示踪染料Fast Blue作用于气道，用于逆行标记特异性支配气道的结状神经元。随后解离结状神经节，并利用荧光激活细胞（FAC）分选技术收集染料阳性细胞。接着，从染料阳性细胞中提取高质量核糖核酸（RNA），用于下一代测序。通过该方法可确定气道特异性神经元的基因表达谱。

引言

体感神经可转导由内源性和环境因子引起的热、机械、化学以及有害刺激。这些传入神经的细胞体位于感觉神经节中，例如背根神经节、三叉神经节或结状神经节。每个感觉神经节支配身体的特定区域，并包含支配该区域内不同器官和组织的细胞。例如，背根神经节（DRG）位于脊柱内，其神经突遍布全身及四肢；而三叉神经节位于颅骨内，含有支配面部、眼睛、脑膜或上呼吸道的神经元1,2。迷走神经的结状神经节位于颅骨下方的颈部区域，其细胞体发出神经纤维分布于整个胃肠道、心脏以及下呼吸道和肺部3。在人类中，结状神经节是独立存在的，但在小鼠中，它与颈静脉神经节融合在一起，后者也支配肺部4。这种融合的神经节常被称为颈静脉/结状复合体、迷走神经节，或简称为结状神经节5。本文中将其称为结状神经节。

结状神经节的传入纤维将来自内脏的信息传递至脑干中的孤束核（NTS）。这一独特神经节的感觉输入调控多种功能，例如肠道蠕动6、心率7、呼吸8,9以及刺激物引发的呼吸反应10,11。鉴于其功能多样且支配多个器官，为研究特定神经通路，至关重要的是能够靶向并分离结状神经节中支配特定器官的神经元亚群。然而，由于结状神经节体积小且所含神经元数量有限，这一目标并非易事。每侧小鼠的结状神经节约含5,000个神经元12，此外还有大量支持性的卫星细胞。在这些5,000个结状神经元中，仅有3–5%支配气道。因此，由于气道支配神经元在结状神经节中高度密集，由呼吸刺激或病理状态引起的此类神经元在功能、形态或分子层面的任何变化都可能被掩盖而难以检测。

为了解决这一问题，研究人员开发了一种方法，用于鉴定并分离支配气道的神经元。通过向气道施加荧光示踪染料，以标记随后支配该区域的结状神经元。荧光染料Fast Blue可被神经元摄取，并迅速逆向运输至其胞体，且可在其中稳定保留长达八周13-15。在成功标记后，采用一种温和但高效的细胞解离方案，以在进行荧光激活细胞（FAC）分选时，保持 染料标记的完整性及细胞活性。分选所得的细胞可用于提取高质量的核糖核酸（RNA），以进行基因表达分析或其他下游分子实验。该方案为分离支配特定靶组织的感觉神经元提供了一种有效且可靠的实验技术。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 快速蓝的鼻内给药

对于 Fast Blue，应在处死小鼠前至少 2 天注射染料。该染料可维持长达八周。

  1. 用轻度吸入麻醉（2.5% 七氟烷）麻醉小鼠，直至呼吸开始变慢。
  2. 使用带滤芯吸头的 200 µl 移液器，将 40 µl 染料溶液（0.4 mM 快速蓝，1% 二甲基亚砜，DMSO，溶于磷酸盐缓冲液，PBS）缓慢滴入小鼠鼻孔，期间可暂停数次，以确保小鼠将溶液吸入（图 1A）。
  3. 将小鼠垂直握住，头部朝上，并轻轻按摩胸部，以确保染料在肺内均匀分布。

2. 解剖与分析日的准备工作

  1. 按照表1中指定的成分配制10 ml 神经节解离溶液（GaDS）。
  2. 在专用的实验区域进行RNA提取。实验开始前，使用70%乙醇、10%次氯酸钠溶液和RNase去污染试剂清洁实验台面，包括RNA离心机、试管架和移液器。确保使用专用于RNA操作的滤芯吸头盒。请勿在此区域和设备上进行DNA制备操作，以免造成样本污染。
  3. 用无RNase的水新鲜配制70%和80%乙醇，每个待提取RNA的样本准备1 ml 。
成分用量
Advanced DMEM/f129.5 ml
谷氨酰胺（glutamine）100 µl
HEPES (10 mM)100 µl
N2 添加剂100 µl
B27（不含维生素A）200 µl
NGF (50 µg/ml)10 µl

表1. 神经节解离液（GaDS）的试剂混合物。

3. 解剖步骤

  1. 为每个实验样本、一个阳性分选对照和一个阴性分选对照各准备1.5 ml 离心管，每管中加入500 µl GaDS。解剖过程中将离心管置于冰上保存。
  2. 取出结状神经节，并做两个部分切口以促进解离，然后将其放入实验样本管中。有关结状神经节和DRG的解剖操作，请参考以下JoVE实验方案16和17。
  3. 解剖并部分切开未标记的神经节（如背根神经节，DRG），用于分选对照。阳性对照使用两个神经节，阴性对照也使用两个神经节。
  4. 为获得足够数量的结状神经元以确保分选成功，将5只小鼠的神经节合并至一个含有GaDS的实验样本管中。

4. 感觉神经节解离

  1. 用移液器吸出500 µl GaDS，使神经节留在管中。加入1 ml PBS洗涤神经节一次，等待神经节沉降至管底，然后吸出PBS。
  2. 向每根管中加入1 ml GaDS和22 µl 消化酶（I/II型胶原酶与蛋白酶混合物，2.5 mg/ml 溶于H2O）。
  3. 向阳性对照管中加入20 µl Fast Blue（5.26 mM）。
  4. 将管子放入已预热至37 °C的水浴或加热块中。
    注意：神经节的消化时间取决于消化酶的使用时间。溶解后1个月内，消化30分钟；2至6个月内，消化45分钟；若酶使用超过6个月，则消化60分钟。
  5. 每15分钟 轻轻振荡并弹动管子，确保神经节被溶液充分覆盖。
  6. 在神经节消化过程中，使用颗粒溶液（聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅颗粒）制备密度梯度。
    1. 在GaDS中配制12%颗粒溶液，每份样品500 µl 。
    2. 在GaDS中配制28%颗粒溶液，每份样品500 µl 。
    3. 在新的1.5 ml 离心管中，缓慢而小心地将400 µl 12%密度溶液加至400 µl 28%密度溶液之上（每份样品一管）。避免两层溶液混合。管中应可见两层清晰分界，其中一层颜色较深。
  7. 在神经节消化过程中，标记新的1.5 ml 收集管用于分选（每份待分选样品准备一个Fast Blue阳性管和一个Fast Blue阴性管）。根据分选设备的要求，这些管子必须带有可拆卸盖子，以免干扰细胞分选仪。
  8. 在适当的消化时间结束后，吸除含消化酶的GaDS，并用1 ml PBS洗涤神经节两次。向每根管中加入200 µl 新鲜GaDS。
  9. 使用200 µl 移液器，设定体积为100 µl ，反复吹打神经节数次以使细胞充分解离。重复操作直至无完整组织块可见。避免在溶液中产生气泡。
  10. 将解离后的细胞通过70 µm细胞筛网过滤。
  11. 向原始解离管中再加入100 µl GaDS，以回收残留的游离细胞，并将额外溶液通过细胞筛网。使用新的移液器吸头收集已通过筛网并附着在滤网上的含细胞液体。最终悬浮于GaDS中的细胞体积为300 µl。
  12. 小心地将300 µl 细胞悬液叠加至先前制备的密度梯度之上。避免产生气泡或使细胞与密度层混合。
  13. 在室温下以2,900 x g离心10分钟 。
  14. 在细胞离心过程中，按以下方法配制裂解缓冲液（每份实验样品1 ml ）：将10 µl 2-巯基乙醇加入1 ml RLT缓冲液（来自RNA提取试剂盒）中。
    1. 向Fast Blue阳性收集管中加入300 µl 裂解缓冲液，向Fast Blue阴性收集管（步骤4.7中标记的管）中加入600 µl 。该体积取决于预期收集的细胞数量：若细胞数<2,000，加300 µl；若细胞数>7,000，加600 µl。这可确保分选鞘液不会显著稀释裂解缓冲液。
  15. 离心结束后，小心吸除并弃去上层700 µl 液体。该层含有大部分细胞碎片，若不除去将干扰后续细胞分选。
  16. 向剩余含细胞的溶液中加入700 µl 新鲜GaDS，并反复吹打数次以混匀。
  17. 以2,900 x g离心15分钟 以沉淀细胞。
  18. 在细胞离心过程中，通过向1 ml GaDS中加入5 µl DNase（10 mg/ml）来配制分选用GaDS（每份样品500 µl ）。
  19. 离心结束后，小心吸除并弃去上清液，保留细胞沉淀。
  20. 用设定为200 µl的1,000 µl移液器反复吹打数次，将细胞沉淀重悬于200–300 µl 分选用GaDS中。将样品置于冰上。细胞现已准备好进行分选。

5. 荧光激活细胞（FAC）分选

注意：本部分需要具备流式细胞分选仪（FACS）的操作知识，或由熟练的技术人员协助完成。

  1. 加入 1 µl 向每个样本中加入碘化丙啶（PI）储备液（50 µg/ml），以检测细胞活力。将阴性对照分为两管，一管加PI，另一管不加。PI仅与死细胞中的DNA结合。若在前几次分选后无死细胞可标记，则无需使用PI。
  2. 将细胞转运至流式细胞仪， 例如BD FACS AriaII 流式细胞分选仪，运行 Diva 8 软件，置于冰上。
  3. 由于该细胞群体的细胞大小具有变异性，分选时应使用较大喷嘴（100 µm）。为降低细胞所受的剪切应力并提高细胞存活率，应采用较低压力（20 psi）。
  4. 使用FACS分选仪软件设置分析图，包括前向散射、侧向散射（SSC）、Fast Blue和碘化丙啶（PI）（如需要）。
  5. 为重悬细胞，在将样品加入分选仪前，轻轻涡旋振荡片刻。
  6. 从阴性对照开始，不加Fast Blue或PI，以设定门控阈值（图2A）。这将确定细胞群体中的自发荧光水平。可选：使用碘化丙啶（PI）运行阴性样品，以鉴定是否存在死细胞群体。
  7. 对阳性对照样本（与Fast Blue孵育）进行分选，以设置补偿参数。
  8. 设定好门控和参数后，开始分选实验样本。将样本分选至预先装有RNA裂解缓冲液的收集管中。
  9. 将分选后的样品置于冰上保存，直至细胞分选完成。
  10. 细胞分选后立即开始RNA提取步骤。

6. RNA 提取

  1. 将分选后的细胞在裂解缓冲液中涡旋震荡1分钟 以充分匀浆。
  2. 加入1体积的70%乙醇，通过反复吹打数次混匀。
  3. 将最多700 µl 样品转移至离心柱中，在8,000 × g条件下离心15秒 ，弃去穿流液。
    1. 重复此步骤，直至全部样品体积均通过离心柱。
  4. 加入350 µl RW1缓冲液，并按照试剂盒说明书针对细胞样本的操作步骤继续进行RNA纯化，包括DNase处理步骤。
  5. RNA提取完成后，根据制造商说明，使用微流控电泳系统检测RNA质量。

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结果

采用该方法，通过鼻内滴注荧光金（Fast Blue）对支配气道的神经元进行标记（图1A）。两天后，可在结节神经节中观察到被荧光金标记的细胞（图1C）。这些细胞约占结节神经节总神经元群体的3%至5%。其他曾用于此目的的逆行染料包括DiI（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）和Fluorogold。肺部暴露于DiI可标记结节神经元，但DiI需要更长时间才能到达神经节，通常在滴注后7至14天才可检测到18,19，因此本研究选用一种可主动运输的染料。Fluorogold是一种可主动运输的染料，也曾被用于标记气道神经元14,20。然而，根据我们的经验，该染料一旦到达结节神经节的胞体，会迅速被卫星细胞摄取，而非神经元（数据未显示）。荧光金（Fast Blue）是另一种可主动运输的荧光染料，已被证实能有效且快速地标记大鼠的背根神经节（DRG）21以及支配气道的结节神经元13,14。因此，荧光金标记法显...

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讨论

本方案描述了一种靶向迷走神经结状神经节中支配气道的神经元的方法。标记后，轻柔地解离神经节，以最大程度地保持细胞数量和活性。随后将这些神经元直接通过流式细胞分选（FAC）进入裂解缓冲液，并提取RNA。该方案的意义在于能够靶向、分离并保持特定感觉神经元群体的质量。本文描述了这群少量神经元中的基因表达，并鉴定了器官特异性功能 及神经网络。

本方案中的关键步骤包括快速完成解离过程以及随后的细胞分选。必须合理安排分选时间，确保其在解离完成后立即开始。此外，所有RNA提取试剂必须新鲜，70%和80%乙醇溶液需现配现用，且用于RNA提取的所有离心管和设备必须洁净并无RNase污染。

该方案可进行修改，使细胞被单独分选至孔板中，用于单细胞RNA提取和测序。该方法也可用于分离其他感觉神经节中的细胞，例如背根神经节（DRGs）。已有文献描述过通过向不同身体部位注射染料以逆行追踪至DRGs的方法17。本方案还可进一步修改，以收集细胞用于功能分析。此时，细胞不被分选至裂解缓冲液中，而是分选至神经元培养基GaDS中。随后...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01HL105635（资助对象：SEJ）支持。作者谨此感谢Diego V. Bohórquez提供的技术指导。同时感谢R. Ian Cumming在技术方面的协助，并在杜克大学人类疫苗研究所研究流式细胞术共享资源中心（北卡罗来纳州达勒姆）完成流式细胞术检测。流式细胞术检测在杜克大学区域生物安全实验室进行，该实验室的建设获得了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所的部分支持（项目编号：UC6-AI058607）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
快蓝Polysciences, Inc.17740-2以水配制为 2 mg/ml 储存液
NeuroTrace 530/615 红色尼氏染色Life TechnologiesN21482
二甲基亚砜（DMSO）费舍尔科技公司D128-500
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS），不含钙和镁Gibco14190-144
高级 DMEM/F12 培养基Gibco12634-010
谷氨酰胺（Glutamax）Gibco35050-061
HEPESGibco15630-080
N2 添加剂Gibco17502-048
B27 添加剂（不含维生素 A）Gibco12587-010
神经生长因子（NGF）SigmaN6009以 PBS/10% FBS 配制为 50 µg/ml 储存液
消化酶，Liberase DH 研究级罗氏5401054001以水配制为 2.5 mg/ml 储存液
颗粒溶液（Percoll）SigmaP1644-25ML
加热金属块LabNet
70 µm 细胞滤网Falcon352350
无水乙醇（200 证明）费舍尔科技公司BP2818-500
无 RNase 水费舍尔科技公司BP2484-100
RNase 去污染试剂，RNase AWAYinvitrogen10328-011
2-巯基乙醇VWREM-6010
RNA 提取试剂盒，RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
DNase 试剂盒，无 RNase 的 DNase 套装Qiagen79254
DNaseSigmaD5025-15KU以 0.15 M NaCl 配制为 10 mg/ml 储存液
碘化丙啶SigmaP4170-10MG以 PBS 配制为 10 µg/ml 储存液
微流控电泳系统（TapeStation 2200）安捷伦

参考文献

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Fast Blue RNA

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