一种靶向并分离小鼠气道支配感觉神经元的方法

摘要

器官特异性感觉神经元难以鉴定。利用荧光示踪剂Fast Blue标记支配气道的结状神经元，用于细胞分选。分选后的结状神经元用于提取高质量核糖核酸（RNA），以进行测序。通过本方案，可确定气道特异性神经元的基因表达谱。

摘要

体感神经可转导由内源性和环境因子引起的热、机械、化学以及有害刺激。这些传入神经元的胞体位于感觉神经节内。感觉神经节支配特定器官或身体部位。例如，背根神经节（DRG）位于脊柱内，其神经突遍布全身及四肢；三叉神经节位于颅骨内，支配面部和上呼吸道；结状神经节的迷走传入纤维则延伸至肠道、心脏和肺部。结状神经元调控多种功能，如呼吸频率、气道刺激和咳嗽反射。因此，为了理解并调控其功能，关键在于识别和分离出特异性支配气道的神经元亚群。在小鼠中，将荧光示踪染料Fast Blue作用于气道，用于逆行标记特异性支配气道的结状神经元。随后解离结状神经节，并利用荧光激活细胞（FAC）分选技术收集染料阳性细胞。接着，从染料阳性细胞中提取高质量核糖核酸（RNA），用于下一代测序。通过该方法可确定气道特异性神经元的基因表达谱。

引言

体感神经可转导由内源性和环境因子引起的热、机械、化学以及有害刺激。这些传入神经的细胞体位于感觉神经节中，例如背根神经节、三叉神经节或结状神经节。每个感觉神经节支配身体的特定区域，并包含支配该区域内不同器官和组织的细胞。例如，背根神经节（DRG）位于脊柱内，其神经突遍布全身及四肢；而三叉神经节位于颅骨内，含有支配面部、眼睛、脑膜或上呼吸道的神经元^1,2。迷走神经的结状神经节位于颅骨下方的颈部区域，其细胞体发出神经纤维分布于整个胃肠道、心脏以及下呼吸道和肺部³。在人类中，结状神经节是独立存在的，但在小鼠中，它与颈静脉神经节融合在一起，后者也支配肺部⁴。这种融合的神经节常被称为颈静脉/结状复合体、迷走神经节，或简称为结状神经节⁵。本文中将其称为结状神经节。

结状神经节的传入纤维将来自内脏的信息传递至脑干中的孤束核（NTS）。这一独特神经节的感觉输入调控多种功能，例如肠道蠕动⁶、心率⁷、呼吸^8,9以及刺激物引发的呼吸反应^10,11。鉴于其功能多样且支配多个器官，为研究特定神经通路，至关重要的是能够靶向并分离结状神经节中支配特定器官的神经元亚群。然而，由于结状神经节体积小且所含神经元数量有限，这一目标并非易事。每侧小鼠的结状神经节约含5,000个神经元¹²，此外还有大量支持性的卫星细胞。在这....

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 快速蓝的鼻内给药

对于 Fast Blue，应在处死小鼠前至少 2 天注射染料。该染料可维持长达八周。

1. 用轻度吸入麻醉（2.5% 七氟烷）麻醉小鼠，直至呼吸开始变慢。
2. 使用带滤芯吸头的 200 µl 移液器，将 40 µl 染料溶液（0.4 mM 快速蓝，1% 二甲基亚砜，DMSO，溶于磷酸盐缓冲液，PBS）缓慢滴入小鼠鼻孔，期间可暂停数次，以确保小鼠将溶液吸入（图 1A）。
3. 将小鼠垂直握住，头部朝上，并轻轻按摩胸部，以确保染料在肺内均匀分布。

2. 解剖与分析日的准备工作

1. 按照表1中指定的成分配制10 ml 神经节解离溶液（GaDS）。
2. 在专用的实验区域进行RNA提取。实验开始前，使用70%乙醇、10%次氯酸钠溶液和RNase去污染试剂清洁实验台面，包括RNA离心机、试管架和移液器。确保使用专用于RNA操作的滤芯吸头盒。请勿在此区域和设备上进行DNA制备操作，以免造成样本污染。
3. 用无RNase的水新鲜配制70%和80%乙醇，每个待提取RNA的样本准备1 ml 。

结果

采用该方法，通过鼻内滴注荧光金（Fast Blue）对支配气道的神经元进行标记（图1A）。两天后，可在结节神经节中观察到被荧光金标记的细胞（图1C）。这些细胞约占结节神经节总神经元群体的3%至5%。其他曾用于此目的的逆行染料包括DiI（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）和Fluorogold。肺部暴露于DiI可标记结节神经元，但DiI需要更长时间才能到达神经节，通常在滴注后7至14天才可检测到^18,19，因此本研究选用一种可主动运输的染料。Fluorogold是一种可主动运输的染料，也曾被用于标记气道神经元^14,20。然而，根据我们的经验，该染料一旦到达结节神经节的胞体，会迅速被卫星细胞摄取，而非神经元（数据未显示）。荧光金（Fast Blue）是另一种可主动运输的荧光染料，已被证实能有效且快速地标记大鼠的背根神经节（DRG）²¹以及支配气道的结节神经元^13,14。因此，荧光金标记法显.......

讨论

本方案描述了一种靶向迷走神经结状神经节中支配气道的神经元的方法。标记后，轻柔地解离神经节，以最大程度地保持细胞数量和活性。随后将这些神经元直接通过流式细胞分选（FAC）进入裂解缓冲液，并提取RNA。该方案的意义在于能够靶向、分离并保持特定感觉神经元群体的质量。本文描述了这群少量神经元中的基因表达，并鉴定了器官特异性功能 及神经网络。

本方案中的关键步骤包括快速完成解离过程以及随后的细胞分选。必须合理安排分选时间，确保其在解离完成后立即开始。此外，所有RNA提取试剂必须新鲜，70%和80%乙醇溶液需现配现用，且用于RNA提取的所有离心管和设备必须洁净并无RNase污染。

该方案可进行修改，使细胞被单独分选至孔板中，用于单细胞RNA提取和测序。该方法也可用于分离其他感觉神经节中的细胞，例如背根神经节（DRGs）。已有文献描述过通过向不同身体部位注射染料以逆行追踪至DRGs的方法¹⁷。本方案还可进一步修改，以收集细胞用于功能分析。此时，细胞不被分选至裂解缓冲液中，而是分选至神经元培养基GaDS中。随后.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
快蓝	Polysciences, Inc.	17740-2	以水配制为 2 mg/ml 储存液
NeuroTrace 530/615 红色尼氏染色	Life Technologies	N21482
二甲基亚砜（DMSO）	费舍尔科技公司	D128-500
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS），不含钙和镁	Gibco	14190-144
高级 DMEM/F12 培养基	Gibco	12634-010
谷氨酰胺（Glutamax）	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2 添加剂	Gibco	17502-048
B27 添加剂（不含维生素 A）	Gibco	12587-010
神经生长因子（NGF）	Sigma	N6009	以 PBS/10% FBS 配制为 50 µg/ml 储存液
消化酶，Liberase DH 研究级	罗氏	5401054001	以水配制为 2.5 mg/ml 储存液
颗粒溶液（Percoll）	Sigma	P1644-25ML
加热金属块	LabNet
70 µm 细胞滤网	Falcon	352350
无水乙醇（200 证明）	费舍尔科技公司	BP2818-500
无 RNase 水	费舍尔科技公司	BP2484-100
RNase 去污染试剂，RNase AWAY	invitrogen	10328-011
2-巯基乙醇	VWR	EM-6010
RNA 提取试剂盒，RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
DNase 试剂盒，无 RNase 的 DNase 套装	Qiagen	79254
DNase	Sigma	D5025-15KU	以 0.15 M NaCl 配制为 10 mg/ml 储存液
碘化丙啶	Sigma	P4170-10MG	以 PBS 配制为 10 µg/ml 储存液
微流控电泳系统（TapeStation 2200）	安捷伦