选择性收获边缘池肝内白细胞

摘要

边缘化肝白细胞与其他白细胞群体相比具有独特的特征和不同的免疫学功能。本文介绍了一种通过强制灌注大鼠或小鼠肝脏来选择性分离这一特定肝细胞群体的方法。边缘化肝白细胞在决定对肝脏相关疾病及转移性病变的易感性方面似乎起着关键作用。

摘要

边缘化肝（MH）白细胞（即黏附于肝脏窦状隙的白细胞）与其它免疫区室中的白细胞相比，表现出独特的组成和特性。具体而言，已有证据表明，MH白细胞群体具有特异性的促炎和抗炎特征，且在小鼠和大鼠中，肝脏特异性自然杀伤细胞（即窦相关淋巴细胞，pit细胞）的细胞毒性高于循环系统或脾脏中的免疫细胞。本文所述方法通过强制灌注小鼠和大鼠肝脏，可选择性地收获MH白细胞。与其他用于提取肝白细胞的方法（如组织研磨和生物降解）相比，该方法仅获取来自肝窦状隙的白细胞，避免了其他肝区室细胞的污染。此外，灌注技术更有利于保持MH白细胞的完整性和生理微环境，避免了组织处理过程中已知的生理反应干扰。由于许多循环中的恶性细胞和感染细胞在通过肝窦状隙时会被截留，并与内皮细胞及定居的白细胞发生物理相互作用，因此这一独特的MH白细胞群体处于战略性位置，能够与异常循环细胞相互作用、识别并作出反应。因此，在不同条件下选择性地收获并研究MH白细胞，有助于加深我们对其生物学和临床意义的理解，特别是在循环异常细胞、肝脏相关疾病以及癌症转移方面的研究。

引言

肝窦中含有多种具有不同免疫活性的白细胞亚型，对机体至关重要。例如，边缘区肝细胞（MH）自然杀伤（NK）细胞，也称为窦壁细胞（pit cells），在形态学上表现为大颗粒淋巴细胞（LGLs），功能上则为具有自发细胞毒性的白细胞，能够抵抗血源性肿瘤转移灶的形成。本文所介绍方法的目标是实现对MH白细胞的选择性分离，以便研究这一重要而独特的细胞群体（及免疫区室），并阐明各种干预措施（例如免疫激活）对这些特定细胞的影响。

尽管免疫系统无法清除正在发展的原发性肿瘤，但在癌症患者和动物模型中的证据表明，免疫系统可通过细胞介导的免疫（CMI）来控制循环肿瘤细胞、微转移灶以及残留病灶。然而，这些发现之间存在明显的不一致 体内 功能与能力 体外 在人类和动物中的研究显示，大多数自体肿瘤细胞对循环或脾脏白细胞的细胞毒性具有抗性^1,2这种不一致性可能至少部分归因于 体内 一种独特的白细胞亚群的存在，即边缘化-肝内（窦状隙）白细胞及其活化的自然杀伤细胞亚群，即窦腔细胞（pit cells）³事实上，我们实验室的未发表数据显示，在F344大鼠中，同系肿瘤细胞（MADB106）对循环和脾脏白细胞具有抗性，但可被MH-NK细胞裂解。⁴因此，据称肿瘤细胞 "NK抗性" MH-NK细胞可能调控循环白细胞的活性。值得注意的是，在小鼠中，MH-NK细胞活性的增强仅....

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得特拉维夫大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 大鼠实验方案

1. 样品制备
   1. 配制肝素化 PBS 溶液（30 单位/毫升），即将无防腐剂肝素按每毫升 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 30 单位，混匀后于室温（RT）使用。按每只动物 35 毫升计算所需体积。
   2. 将肝素化 PBS 通过蠕动泵管路和蝶形针头循环，以排除气泡。
   3. 对以下手术器械进行灭菌：两把剪刀、钝头镊子、两把止血钳和齿状组织镊（在121 °C下，重力（干燥）模式下高压灭菌至少30分钟）。
2. 肝脏灌注与MH-白细胞的收集
   1. 用8%异氟烷过量麻醉处死动物。作为预防措施，在打开胸腔前，将含有浸有异氟烷的垫料的50 ml离心管置于大鼠头部周围。
   2. 呼吸停止后立即打开腹腔和胸腔，暴露肝脏及心肺复合体。操作过程中避免出血。
      1. 具体操作时，从腹部中线下端开始切口，避免损伤内脏器官，然后向两侧斜向延伸至肋骨，并沿肋骨向上切至胸腔上部水平。
   3. 约1分钟内，从右心室尽可能采集多的血液（250 g动物约6 ml）至注射器中。
   4. 用止血钳尽可能靠近心脏夹闭尾腔静脉，以收集灌注液。
   5. 将肠管拉出并....

结果

在F344大鼠中，我们比较了MH-NK细胞（通过强制肝脏灌注从肝窦中收集）的细胞毒性、经机械研磨肝脏组织后获得的全部肝细胞群体的细胞毒性，以及循环白细胞的细胞毒性。所有细胞悬液均按照免疫学实验常规至少洗涤3次，靶细胞系采用同种异体的YAC-1或同系的MADB106细胞系。如图1–4所示，MH-NK细胞对MADB106和YAC-1靶细胞系表现出强烈的细胞毒性（分别约为80%和高达100%），而全部肝细胞群体（图1）和循环白细胞（图2和图3）的细胞毒性水平显著较低，且对同系MADB106靶细胞几乎无杀伤作用。即使在机械处理后的肝脏样本进一步经过洗涤和密度梯度分离后，其细胞毒性仍保持相对较低的水平（图4），该结果与文献报道的典型数据一致。因此，MH-NK细胞在F344大鼠中表现出独特高水平的细胞毒性。流式细胞术（FACS）分析显示，不同细胞亚群的组成存在显著差异，包括单核细胞（.......

讨论

本文介绍的肝脏灌注方法能够选择性地分离和研究边缘池肝内白细胞这一独特的细胞群体。肝内自然杀伤细胞（NK细胞），也称为窦壁细胞（pit cells）³，是一类独特的NK细胞亚群，定位于肝窦内。这类细胞存在于大鼠、小鼠¹⁷以及人类^18,19中。与外周血分离的NK细胞相比，窦壁细胞对YAC-1和CC531s靶细胞系表现出更强的细胞毒活性²⁰，胞质内含有更多且体积更小的颗粒²⁰，并表达更高水平的表面抗原（如LFA-1）¹²。此外，与外周血NK细胞不同，窦壁细胞能够裂解对NK细胞具有抗性的P815细胞。类似于大鼠的窦壁细胞，人类肝内NK细胞对NK敏感的K562靶细胞的杀伤活性也高于循环中的NK细胞^18,19，并已被证实可裂解对NK细胞具有抗性的靶细胞¹⁸。总体而言，由于肝脏在多种疾病中具有特殊且独特的作用，因此应在器官原位研究其免疫特性，并将肝边缘池（MH compartment）的细胞与实质细胞、库普弗细胞及星状细胞区分开来。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Autoclud 蠕动泵
蝶形针	OMG		26 G
蝶形针	OMG		21 G*3/4"
注射器	Pic 溶液		1 ml
注射器	Pic 溶液		2.5 ml
注射器	Pic 溶液		5 ml
注射器	Pic 溶液		10 ml
注射器	Pic 溶液		25 ml
钝头镊
剪刀
止血钳
组织镊
22 W 荧光日光放大镜灯