选择性收获边缘池肝内白细胞

摘要

边缘化肝白细胞与其他白细胞群体相比具有独特的特征和不同的免疫学功能。本文介绍了一种通过强制灌注大鼠或小鼠肝脏来选择性分离这一特定肝细胞群体的方法。边缘化肝白细胞在决定对肝脏相关疾病及转移性病变的易感性方面似乎起着关键作用。

摘要

边缘化肝（MH）白细胞（即黏附于肝脏窦状隙的白细胞）与其它免疫区室中的白细胞相比，表现出独特的组成和特性。具体而言，已有证据表明，MH白细胞群体具有特异性的促炎和抗炎特征，且在小鼠和大鼠中，肝脏特异性自然杀伤细胞（即窦相关淋巴细胞，pit细胞）的细胞毒性高于循环系统或脾脏中的免疫细胞。本文所述方法通过强制灌注小鼠和大鼠肝脏，可选择性地收获MH白细胞。与其他用于提取肝白细胞的方法（如组织研磨和生物降解）相比，该方法仅获取来自肝窦状隙的白细胞，避免了其他肝区室细胞的污染。此外，灌注技术更有利于保持MH白细胞的完整性和生理微环境，避免了组织处理过程中已知的生理反应干扰。由于许多循环中的恶性细胞和感染细胞在通过肝窦状隙时会被截留，并与内皮细胞及定居的白细胞发生物理相互作用，因此这一独特的MH白细胞群体处于战略性位置，能够与异常循环细胞相互作用、识别并作出反应。因此，在不同条件下选择性地收获并研究MH白细胞，有助于加深我们对其生物学和临床意义的理解，特别是在循环异常细胞、肝脏相关疾病以及癌症转移方面的研究。

引言

肝窦中含有多种具有不同免疫活性的白细胞亚型，对机体至关重要。例如，边缘区肝细胞（MH）自然杀伤（NK）细胞，也称为窦壁细胞（pit cells），在形态学上表现为大颗粒淋巴细胞（LGLs），功能上则为具有自发细胞毒性的白细胞，能够抵抗血源性肿瘤转移灶的形成。本文所介绍方法的目标是实现对MH白细胞的选择性分离，以便研究这一重要而独特的细胞群体（及免疫区室），并阐明各种干预措施（例如免疫激活）对这些特定细胞的影响。

尽管免疫系统无法清除正在发展的原发性肿瘤，但在癌症患者和动物模型中的证据表明，免疫系统可通过细胞介导的免疫（CMI）来控制循环肿瘤细胞、微转移灶以及残留病灶。然而，这些发现之间存在明显的不一致 体内 功能与能力 体外 在人类和动物中的研究显示，大多数自体肿瘤细胞对循环或脾脏白细胞的细胞毒性具有抗性^1,2这种不一致性可能至少部分归因于 体内 一种独特的白细胞亚群的存在，即边缘化-肝内（窦状隙）白细胞及其活化的自然杀伤细胞亚群，即窦腔细胞（pit cells）³事实上，我们实验室的未发表数据显示，在F344大鼠中，同系肿瘤细胞（MADB106）对循环和脾脏白细胞具有抗性，但可被MH-NK细胞裂解。⁴因此，据称肿瘤细胞 "NK抗性" MH-NK细胞可能调控循环白细胞的活性。值得注意的是，在小鼠中，MH-NK细胞活性的增强仅在以下情况下明显 体内 免疫刺激例如 通过使用Poly I:C或CpG-C⁵.

肝特异性自然杀伤细胞（MH-NK）位于窦状腔内，附着于内皮细胞和库普弗细胞。MH-NK细胞的特征是具有球形致密颗粒和带杆状核心的囊泡⁶，其中含有作为溶酶体酶的酸性磷酸酶，以及作为生物活性物质的穿孔素和颗粒酶^7,8与循环NK细胞相比，MH-NK细胞表现出更多且更大的颗粒和囊泡。^9-11在炎症条件下，MH-NK细胞表现出更高水平的LFA-1表达。¹²与循环NK细胞相比，这种增强的表达可能构成MH-NK细胞对某些肿瘤细胞具有更强细胞毒性的机制 ^13,14有趣的是，随后 体外 在白细胞介素（IL）-2孵育后，MH-NK细胞体积增大，其颗粒的数量和大小均增加，这些特征均符合淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞的表型¹⁵.

活性的肝巨噬细胞无法通过基于组织研磨和生物降解的标准肝脏白细胞分离方法 exclusively 获得。本文所述的灌注方法相较于标准方法具有两大优势。第一，灌注法可选择性地收获肝巨噬细胞，避免了来自肝脏其他区室的其他白细胞污染。第二，与会损伤细胞或改变其形态、并因组织损伤而诱导释放多种显著调节免疫活性因子的组织处理方法不同，灌注技术能更好地保持肝巨噬细胞的完整性、活性及其生理微环境。

肝脏是癌症转移和多种感染的主要靶器官¹⁶。由于MH细胞具有独特的特性，因此在这些病理条件下研究该特定细胞群体在不同条件下的表现非常重要。例如，值得注意的是，多种生物反应调节剂（如 poly I:C 或 CpG-C）引起的全身性免疫激活对MH白细胞的激活作用强于对外周循环白细胞的激活作用⁵。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得特拉维夫大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 大鼠实验方案

1. 样品制备
   1. 配制肝素化 PBS 溶液（30 单位/毫升），即将无防腐剂肝素按每毫升 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 30 单位，混匀后于室温（RT）使用。按每只动物 35 毫升计算所需体积。
   2. 将肝素化 PBS 通过蠕动泵管路和蝶形针头循环，以排除气泡。
   3. 对以下手术器械进行灭菌：两把剪刀、钝头镊子、两把止血钳和齿状组织镊（在121 °C下，重力（干燥）模式下高压灭菌至少30分钟）。
2. 肝脏灌注与MH-白细胞的收集
   1. 用8%异氟烷过量麻醉处死动物。作为预防措施，在打开胸腔前，将含有浸有异氟烷的垫料的50 ml离心管置于大鼠头部周围。
   2. 呼吸停止后立即打开腹腔和胸腔，暴露肝脏及心肺复合体。操作过程中避免出血。
      1. 具体操作时，从腹部中线下端开始切口，避免损伤内脏器官，然后向两侧斜向延伸至肋骨，并沿肋骨向上切至胸腔上部水平。
   3. 约1分钟内，从右心室尽可能采集多的血液（250 g动物约6 ml）至注射器中。
   4. 用止血钳尽可能靠近心脏夹闭尾腔静脉，以收集灌注液。
   5. 将肠管拉出并置于动物体外右侧，以暴露门静脉。
   6. 将连接至蠕动泵的25 G静脉导管尽可能靠尾侧插入门静脉，但位置需位于脾静脉头侧。
   7. 将连接有5 ml注射器的25 G蝶形针插入止血钳尾侧的下腔静脉。
   8. 打开蠕动泵，调节流速至约3 ml/min，用注射器轻轻收集最初被血液污染的约1 ml灌注液。继续灌注，直至灌注液颜色变为淡红色（约3–5 ml）。注意观察肝脏颜色逐渐变为浅棕色。
   9. 不停止蠕动泵，将5 ml收集注射器更换为20 ml收集注射器，并以较高的灌注速度（最高达4 ml/min）收集至少20 ml肝灌注液。持续监测灌注液流入收集注射器的流量，避免负压过强（以免因下腔静脉壁塌陷导致针头堵塞）。
   10. 当肝脏颜色变为浅棕色时，终止灌注。
3. 白细胞提取
   1. 以 400 × g 离心灌注液 10 分钟，24℃ °C
   2. 吸去上清液
   3. 加入10 ml PBS，以400 x g离心10分钟，吸除上清液。根据研究目的，可直接使用该样品，或进行额外纯化步骤（例如密度梯度分离
      1. 具体操作如下：在50 mL聚丙烯离心管中，将4 mL灌注液覆盖于4 mL密度梯度分离介质上方。于室温下以754 × g离心30分钟，离心时关闭刹车。
      2. 通过手动移液获取密度梯度分离后上清液界面处的单个核层，用 PBS 洗涤，然后转移至 5 ml 离心管中。

2. 小鼠实验方案

1. 准备工作
   1. 通过向每毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入30单位无防腐剂的肝素，配制在室温（RT）下使用的肝素化PBS溶液（30单位/毫升）。按每只动物20毫升计算用量。
   2. 将肝素化PBS通过蠕动泵管路和蝶形针头，以排除气泡。
   3. 对以下手术器械进行灭菌处理——两把剪刀、钝头镊子、两把止血钳和齿状组织镊（在121 °C条件下，使用重力（干燥）模式高压灭菌至少30分钟）。
2. 肝脏灌注及MH-白细胞收集
   1. 通过过量8%异氟烷实施安乐死。作为预防措施，在打开小鼠胸腔前，将含有异氟烷浸湿垫片的15毫升离心管置于小鼠头部周围。
   2. 将小鼠四肢固定于操作台面上。
   3. 在呼吸停止后立即切开腹腔和胸腔，暴露肝脏和心肺复合体，同时保持膈肌下部完整（以形成引流的胸腔积液池）。此过程中应避免出血。
      1. 具体操作时，从腹部中线下端开始切口，避免损伤内脏器官，并沿对角线向两侧肋骨方向延伸，切断肋骨至胸腔上部水平。
   4. 将肠管拉出并移至实验者右侧体外，以暴露门静脉。
   5. 将一根30号针头（连接至蠕动泵）插入脾静脉近端的门静脉中。
   6. 在膈肌上方剪断下腔静脉，以便灌注液从胸腔引出并收集。
   7. 启动蠕动泵，流速约为3毫升/分钟，轻柔收集最初从胸腔积液池流出的3毫升灌注液（含血液污染）。
   8. 弃去该部分灌注液。如有需要，可用生理盐水重复上述清洗步骤一次，之后再开始收集肝脏灌注液。
   9. 重新启动灌注，流速最高达4毫升/分钟，使用连接注射器的蝶形针从胸腔收集10毫升灌注液。
   10. 当肝脏颜色变为浅棕色时，终止灌注。
3. 白细胞提取
   1. 将灌注液在400 × g 条件下离心10分钟。
   2. 吸除上清液。
   3. 加入10毫升PBS，于400 × g 离心10分钟，吸除上清液。根据研究目的，可直接使用该样本，或进行进一步纯化（例如，密度梯度分离）。
      1. 具体操作：将每4毫升灌注液小心叠加于50毫升聚丙烯离心管中4毫升密度梯度分离介质之上。关闭刹车，在室温下以754 × g 离心30分钟。
      2. 用移液器手动吸取密度梯度分离介质与上清液界面处的单个核细胞层，用PBS洗涤后转移至5毫升离心管中。

结果

在F344大鼠中，我们比较了MH-NK细胞（通过强制肝脏灌注从肝窦中收集）的细胞毒性、经机械研磨肝脏组织后获得的全部肝细胞群体的细胞毒性，以及循环白细胞的细胞毒性。所有细胞悬液均按照免疫学实验常规至少洗涤3次，靶细胞系采用同种异体的YAC-1或同系的MADB106细胞系。如图1–4所示，MH-NK细胞对MADB106和YAC-1靶细胞系表现出强烈的细胞毒性（分别约为80%和高达100%），而全部肝细胞群体（图1）和循环白细胞（图2和图3）的细胞毒性水平显著较低，且对同系MADB106靶细胞几乎无杀伤作用。即使在机械处理后的肝脏样本进一步经过洗涤和密度梯度分离后，其细胞毒性仍保持相对较低的水平（图4），该结果与文献报道的典型数据一致。因此，MH-NK细胞在F344大鼠中表现出独特高水平的细胞毒性。流式细胞术（FACS）分析显示，不同细胞亚群的组成存在显著差异，包括单核细胞（...

讨论

本文介绍的肝脏灌注方法能够选择性地分离和研究边缘池肝内白细胞这一独特的细胞群体。肝内自然杀伤细胞（NK细胞），也称为窦壁细胞（pit cells）³，是一类独特的NK细胞亚群，定位于肝窦内。这类细胞存在于大鼠、小鼠¹⁷以及人类^18,19中。与外周血分离的NK细胞相比，窦壁细胞对YAC-1和CC531s靶细胞系表现出更强的细胞毒活性²⁰，胞质内含有更多且体积更小的颗粒²⁰，并表达更高水平的表面抗原（如LFA-1）¹²。此外，与外周血NK细胞不同，窦壁细胞能够裂解对NK细胞具有抗性的P815细胞。类似于大鼠的窦壁细胞，人类肝内NK细胞对NK敏感的K562靶细胞的杀伤活性也高于循环中的NK细胞^18,19，并已被证实可裂解对NK细胞具有抗性的靶细胞¹⁸。总体而言，由于肝脏在多种疾病中具有特殊且独特的作用，因此应在器官原位研究其免疫特性，并将肝边缘池（MH compartment）的细胞与实质细胞、库普弗细胞及星状细胞区分开来。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Autoclud 蠕动泵
蝶形针	OMG		26 G
蝶形针	OMG		21 G*3/4"
注射器	Pic 溶液		1 ml
注射器	Pic 溶液		2.5 ml
注射器	Pic 溶液		5 ml
注射器	Pic 溶液		10 ml
注射器	Pic 溶液		25 ml
钝头镊
剪刀
止血钳
组织镊
22 W 荧光日光放大镜灯