利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

摘要

从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子 Grem2，既可增加所获得的心肌细胞数量，又能生成具有心房表型的心肌细胞。

摘要

从多能干细胞生成心肌细胞群体的方案已有报道，但这些方法通常产生表型混合的细胞。对于希望开展特定心肌细胞亚型研究的研究人员而言，需要采用更为定向的分化策略。通过使用Grem2处理小鼠胚胎干细胞（ES细胞），Grem2是一种分泌型BMP拮抗剂，在心房腔室形成过程中具有必要作用 体内，可生成大量具有心房表型的心脏细胞。利用经基因工程改造的Myh6-DSRed-Nuc多能干细胞系，可实现对心肌细胞的识别、筛选与纯化。本方案中，采用悬滴法由Myh6-DSRed-Nuc细胞生成拟胚体，并在悬浮状态下培养至分化第4天（d4）。在d4时，细胞经Grem2处理后接种于明胶包被的培养板上。在d8至d10期间，培养物中出现大面积收缩区域，并持续扩展和成熟至d14。分子、组织学及电生理学分析表明，经Grem2处理的细胞获得类似心房的特征，提供了一种 体外 用于研究心房心肌细胞的生物学特性及其对各种药理学试剂的反应的模型。

引言

多能干细胞是基础研究和临床前研究中用于生成和研究难以获取的组织细胞的有力工具，尤其在人类研究中具有重要意义^1-5。通过适当调控发育相关的信号通路，可引导多能干细胞向特定表型命运分化。目前已有多种方案被开发用于从多能干细胞生成心肌细胞（CMs）^6-14。这些方案通常通过定时添加外源性生长因子和/或小分子，调控TGFβ超家族（包括Activin、BMP和TGFβ）以及Wnt信号通路^10,12-15。这些方法通常能有效提高分化为心肌细胞的细胞比例，但特异性不足，常产生包含心房、心室以及结节/传导系统谱系的混合细胞群体。为了研究特定的心脏亚型，需要采用更具靶向性的分化策略。

Gremlin2（Grem2，也称为与Dan和Cerberus相关的蛋白，简称PRDC）是一种分泌型BMP拮抗剂，是必需的 在斑马鱼心脏发育过程中，实现正常的心脏分化和心房腔室形成¹⁶在分化第4天（即中胚层标志物T-Brachyury和Cerberus like 1表达达峰后）用Grem2处理正在分化的胚胎干细胞，可提高心肌细胞产量，并产生以心房谱系为主的细胞群体¹⁴.

重组Grem2可用于处理正在分化的细胞，可通过标准蛋白质生产技术制备¹⁷，也可商业购买。该蛋白在水溶液中具有高溶解性，可根据需要在特定时间点外源性地添....

方案

1. 细胞培养基、溶液和试剂的准备。

1. 通过混合并经无菌过滤（0.2 μm）制备 500 ml 小鼠胚胎干细胞（mESC）培养基 μm孔径）445 ml格拉斯哥最低必需培养基（GMEM），50 ml热灭活胎牛血清（FBS），5 ml 100倍浓缩L-谷氨酰胺替代液，5 µl 重组小鼠白血病抑制因子（LIF）1 × 10⁷ 单位/毫升，以及 1.43 µl β-巯基乙醇（终浓度为 50 µM）。4 ℃保存 ˚C，待使用时取出。
2. 通过混合并经无菌过滤 391 ml Iscove 改良杜尔贝科培养基（IMDM）、100 ml 热灭活 FBS、5 ml 100X 浓缩 L-谷氨酰胺替代物、5 ml 100X 浓缩非必需氨基酸（NEAA）和 2.86 µl β-巯基乙醇（终浓度为100） µM）。4 ℃保存˚ C，待使用时取出。
3. 将1 g猪皮明胶粉末与500 ml过滤蒸馏水混合，配制0.2% w/v的明胶溶液₂O. 通过高压灭菌进行灭菌。注意，明胶在室温水中可能无法完全溶解。高压灭菌后，明胶应完全溶解。置于室温保存，待用时取出。
4. 通过将50的Grem2重组蛋白溶解，制备其分装液 µ100 中的 g 冻干 Grem2 小球 µl 磷酸盐缓冲液（PBS），添加 0.1% BSA，配制成 0.5 µg/µ....

结果

在诱导分化之前，多能干细胞应呈致密集落状，且无自发分化现象。图1A所示的细胞已准备好进行单细胞化处理，并用于后续悬滴法操作，具体步骤详见方案部分的5.1。图1B所示的细胞已发生自发分化，不应用于悬滴的制备。

包含的面板 图2 在分化第2天显示出成功形成的小体。优质的小体通常在均匀分布、形态圆润的悬滴中形成，如图所示。 图2到分化第2天，应可在悬滴末端用肉眼观察到拟胚体，其为正在分化的干细胞形成的球形聚集体图2）。这些拟胚体已准备好进行方案部分5.3所述的洗脱步骤。

在第2至4天期间，悬浮培养中洗涤下来的拟胚体应持续增大。到第4天时，结构良好的拟胚体应呈游离状态，且在.......

讨论

该方案通常可获得高比例的心肌细胞（CMs），这些细胞具有心房谱系的特征。与任何分化方案一样，分化前小鼠胚胎干细胞（mESCs）的质量需特别关注。应常规监测mESCs是否具有正常的形态学特征（图1A）。在拟胚体（EBs）形成前若出现任何自发分化，将显著降低心脏分化效率，因此在传代前应将其清除（图1B）。EB的大小也会影响心脏分化效率。每EB接种200至1,000个细胞的条件已进行过测试，通常每EB 500个细胞可获得最多数量的心肌细胞。在EB形成前一天进行传代的细胞通常也具有更高的分化效率。

本方案中采用"悬滴"法生成拟胚体（EBs）²⁵。已有文献报道其他用于心肌分化的拟胚体生成方法^26-29。该"悬滴"法操作简便、成本低廉，任何配备常规细胞培养设备和材料的实验室均可轻松实施，且具备细胞培养经验的人员均可操作。该方法还具有良好的灵活性，所生成的拟胚体可根据研究人员的需求方便地进行操作、转移、接种或收集用于RNA分析。此外，该方法具有可扩展性，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GMEM	Life Technologies	11710
FBS	Life Technologies	10082
Glutamax	Life Technologies	35050
LIF	EMD Millipore	ESG1107
ß-巯基乙醇	Sigma	M3148
IMDM	Sigma	I3390
非必需氨基酸	Sigma	M7145
10 cm 组织培养板	Sarstedt	83.3902
10 cm 细菌培养皿	VWR	25384-342
6 cm 细菌培养皿	VWR	25384-092
6 孔组织培养板	Sarstedt	83.3920
Gremlin 2 重组蛋白	R&D Systems	2069-PR-050
无菌滤器	Thermo Fisher	09-741-02
明胶（来自猪皮）	Sigma	G1890
10X PBS，无菌	Sigma	P5493
BSA	Sigma	5470
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Life Technologies	25300054
不含钙、镁的 DPBS	Life Technologies	14200