使用层压技术来执行人类巩膜共聚焦显微镜

Summary

人巩膜组织主要是胶原蛋白;因此，它不易用于免疫组织化学。为了实现对巩膜组织共聚焦显微镜进行免疫组织化学的目标，使用了层压技术。

Abstract

巩膜是致密结缔组织覆盖和保护眼睛。它主要由致密的胶原束（I型，III，IV，V，VI和VII）的。由于它的自身荧光，不透明，和厚度，它没有被发现适合于共焦显微镜。另一种方法的一个在这里提出，其使用石蜡包埋用于免疫组织化学福尔马林固定巩膜，具有技术挑战，预热抗原修复组织时尤其如此。由于巩膜在两个细胞和血管相对较差，使用较大的组织样本进行了探讨，以帮助防止俯瞰细胞，并了解他们有关的船只及其他解剖部位的定位。以允许共焦显微镜下放大的组织样本的分析，进行层压技术来创建从巩膜薄层。继CD31血管和淋巴管内皮hyalu的结果分析罗南受体1（LYVE1）阳性细胞，获得针对该批准科学检查，该方法的优点和局限性进行了讨论。

Introduction

巩膜是覆盖眼，它是由致密结缔组织的刚性外层。它有助于保护眼内的结构和保持眼压。因此，巩膜是明确的目标至关重要。它不含淋巴管^1,2，从而形成它与自由淋巴-内眼^3-7之间的外自由淋巴边界。它也提供了眼外肌附着位点，从而与筋共享解剖相似之处。 因为巩膜主要由I型胶原的致密束和具有型胶原III，IV，V，VI，VIII族 ^8,9和弹性^10,11的较小的数字，这个组织是不容易使用用于免疫组织化学。

解剖学，巩膜可以分为三个主要层:（1）浅血管巩膜外层，实测结膜和眼球筋膜囊下方并朝向侧面和第面对轨道眼睛E回; （2）巩膜间质，巩膜的主要部分;及（3）的薄层fusca的，这是直接位于葡萄膜上方的薄的着色层。我们对巩膜解剖知识主要来源于20 ^世纪上半叶。在那个时候，研究人员研究了血管的解剖结构主要是利用墨汁注射¹²和血管铸造^13-15。后来，它血管造影研究^16-19进行了研究。

自那时以来，旧的技术进行了改进，新的问题被开发出来，使我们能够补充先前的解剖知识。例如，它仅仅是约十年，因为我们有过这样可靠淋巴标记淋巴血管内皮特定透明质酸受体^{1（LYVE1）20}或podoplanin ^21。

Protocol

使用人体组织，必须审查和机构审查委员会或等效的批准。这里所描述的工作被批准由当地伦理委员会批准了科学检查。这项工作是根据赫尔辛基宣言进行。人类巩膜标本采自世界各地的捐助者的眼中（最大验尸时间24小时），在科隆大学眼库眼科部，德国获得。

1.实验准备

1. 制备96％的乙醇，并在不同的管中的磷酸缓冲盐水（PBS）。制备在含有2％牛血清白蛋白（BSA）的PBS的推荐稀释的第一抗体，并保持在冰上的所有解决方案。准备每个样品100微升。
2. 清洁所有乐器和用锋利的手术刀。重复相同的手术刀切割后，改变手术刀。
3. 获得1-2 COLIBRI钳，直微解剖剪刀，＃10手术刀或眼科手术刀微羽毛，和四＆G针。
4. 包裹铝箔周围聚苯乙烯板或使用软木板上贴上组织。一个双目立体显微镜下工作。如果需要一个层流下工作无菌。

2.准备巩膜

1. 轻轻握住灯泡和角巩膜部分进行打孔环锯术，然后旋转环锯。仔细而均匀地旋转环锯在表面上进行同样切割的圆形。使用15.5毫米大小的环钻。与切弯剪剩下的附件。取出角巩膜环锯术。这将导致一个向前打开灯泡。
   1. 把巩膜与开放的部分向上棉签。取出视网膜和葡萄膜，使用镊子COLIBRI拉断从巩膜两个层（视网膜和色素膜）。不要离开在内巩膜色素葡萄膜。用弯剪去除乳头视网膜和葡萄膜。删除REM癌宁结膜，眼外肌，和从表面的巩膜榫的胶囊。
2. 通过使....

Results

在这里进行的实验的代表，也有因使用这种特殊层压技术的衍生论证好处。在第一个实验中示出的巩膜外血管丛的三种代表性的照片（ 图3）的不同的网络。这些船只是积极为CD31。

第二个实验中显示了免疫细胞，在巩膜和它们对CD31阳性血管关系的特定LYVE1 +细胞。这里是在10X放大率用的Z-Stack技术穿过组织进行扫描和理解的血管细胞和免疫细胞（ 图4）的立体关系。

巩膜，以及封闭眼外肌，可以分析血管或免疫细胞的存在; 图5示出了LYVE1阳性细胞和CD31阳性血管。

Discussion

层压人类巩膜是这个组织的执行共聚焦显微镜的方法。在这个过程中的一个关键步骤是使用乙醇代替福尔马林用于固定组织。根据我们的经验，使用乙醇代替福尔马林固定时获得更好的结果。钝解剖刀加剧过程，应避免使用。同样地，应避免巩膜的干涸，因为它的复杂性的方法，降低了图像的质量。

对于免疫组织化学染色，可以使用比这里施加的那些其他抗体。在一般情况下，胶原显示更加自体荧光和绿色通道的背景下，因此红色，蓝色，和远红色通道显示具有较少的背景更好的结果。

但是，也有该技术的一些限制。层压巩膜需要大量的练习的，因为它是一个microsc下进行显微外科方法OPE。因为这种技术是手动执行的，在单个层压片是不完全一样的尺寸和一块组织内的厚度不相同。具有完全相同的尺寸的组织中，环钻可能是另一种选择，虽然这些层的厚度仍然会有所不同。以实现用于巩膜部分的精确限定的厚度，一个自动角膜刀可能是未来的实验的替代方法。如果层压使用太多的厚层执行，则封面幻灯片可能脱臼，并且组织有可能干出。巩膜和基质之间的确切边界可能很难，一旦叠片进行区分。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% 乙醇	默克化学公司，德国达姆施塔特	P075.4
双目立体显微镜	Motic， 中国香港	n.a
26 G 针	Terumo， 鲁汶， 比利时	303800
15.5 mm trepan	Geuder， Heidelberg， Germany	n.a
no.10 手术刀	Feather， pfm medical， 日本大阪	2E+08
眼科手术刀微羽毛	Feather， pfm medical， 日本大阪	no. 7657BR
CD 31 抗体 （单克隆小鼠抗人）	Dako， USA	IR610
LYVE1 抗体 （多克隆兔抗人）	Zytomed，德国	RBK014-05
山羊抗小鼠 FITC 抗体	Sigma Aldrich，德国斯坦海姆	F0257
山羊抗兔 Cy3 抗体	Dianova，德国	111-165-003
山羊血清正常	Dako，Glostrup，丹麦	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH，卡尔斯鲁厄，德国	6335.1
显微镜幻灯片	恩格尔布赖特，Edermünde， 德国	WC7695002
玻片 24 mm x 24 mm	Th. Gayer， Lohmar， 德国	7695026
DAKO 荧光封固剂	美国 DAKO	S3023
LSM Meta 510 共聚焦显微镜	Carl Zeiss AG， 耶拿， 德国	n.a