人巩膜组织主要成分为胶原，因此不易用于免疫组织化学检测。为了实现对巩膜组织进行共聚焦显微镜免疫组织化学分析的目标，采用了切片贴附技术。
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本文内容
摘要
摘要
巩膜是一种致密的结缔组织，覆盖并保护眼球，主要由致密的胶原纤维束（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ型）构成。由于其自发荧光性、不透明性及较厚的结构，巩膜被认为不适合用于共聚焦显微镜观察。一种替代方法是采用福尔马林固定、石蜡包埋的巩膜组织进行免疫组织化学染色，但该方法存在技术上的挑战，尤其是在抗原修复过程中需要对组织进行加热时。由于巩膜中细胞和血管均相对稀少，因此尝试使用较大的组织样本，以帮助避免遗漏细胞，并有助于理解细胞相对于血管及其他解剖位置的分布情况。为了能够在共聚焦显微镜下分析较大的组织样本，采用了一种切片贴合技术，以从巩膜制备出较薄的组织层。在分析了已获得科学研究许可的CD31标记的血管以及淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）阳性细胞的结果后，本文讨论了该方法的优势与局限性。
引言
巩膜是覆盖眼球的坚硬外层，由致密结缔组织构成。它有助于保护眼内结构并维持眼内压，因此对清晰视力至关重要。巩膜内无淋巴管 1,2 从而在其与无淋巴管的内眼之间形成一个无淋巴管的外层边界 3-7它还为眼外肌提供附着位点，因此在解剖结构上与肌腱具有相似性。 因为巩膜主要由密集的I型胶原纤维束构成，且含有较少数量的其他胶原类型 三、四、五、六、八 8,9 和弹性蛋白 10,11该组织不易用于免疫组织化学。
从解剖学上讲，巩膜可分为三层主要结构：（1）表层富含血管的巩膜上层（episclera），位于结膜和滕囊下方，分布于眼球侧面及朝向眼眶后部的区域；（2）巩膜基质，即巩膜的主要部分；（3）棕黑层（lamina fusca），为一层位于葡萄膜正上方的薄而有色素的结构。我们对巩膜的解剖学认识主要来源于20th世纪上半叶。当时，研究人员主要通过印度墨水注射12和血管铸型技术13-15来研究血管系统的解剖结构。此后，相关研究进一步通过血管造影研究得以开展16-19。
从那时起，旧的技术得到了改进，新的技术也相继出现，使我们能够补充以往的解剖学知识。例如，可靠的淋巴管标记物，如淋巴管内皮特异性透明质酸受体-1（LYVE1）
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方案
使用人体组织必须经过机构审查委员会或同等机构的审查和批准。本研究所描述的工作已获得当地伦理委员会的批准，并获准进行科学研究。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。人眼巩膜标本来自德国科隆大学眼科医院眼库的眼球捐献者（死后获取时间最长为24小时）。
1. 实验准备
- 在不同的离心管中分别准备96%乙醇和磷酸盐缓冲液（PBS）。将一抗用含有2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS按推荐稀释比例配制，并将所有溶液置于冰上。每份样品准备100 μl。
- 清洁所有器械，并使用锋利的手术刀片。同一把刀片反复切割后，应及时更换新刀片。
- 准备1-2把科尔比镊子、直头显微解剖剪、#10手术刀片或眼科用显微刀片（micro feather），以及四根26 G针头。
- 用铝箔包裹聚苯乙烯板或使用软木板以固定组织。在双目体视显微镜下操作。如需无菌操作，应在超净工作台的层流条件下进行。
2. 准备巩膜
- 轻轻握住眼球，对角巩膜部分进行穿孔性环钻，然后旋转环钻。小心且均匀地在表面旋转环钻，以获得一个均匀的圆形切口。使用直径为15.5 mm的环钻。用弯剪剪断剩余的连接组织，移除角巩膜环钻部分。这将使眼球前部打开。
- 将巩膜组织置于棉签上，开口朝上。使用蜂鸟镊子将视网膜和葡萄膜从巩膜上剥离（同时移除视网膜和葡萄膜两层），避免在巩膜内表面残留色素性葡萄膜。使用弯剪将视....
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结果
在本研究进行的代表性实验中，采用这种特定的层压技术可带来显著优势。第一个实验通过三幅代表性图像展示了巩膜上血管丛的复杂网络结构（图3）。这些血管对CD31呈阳性。
第二个实验展示了免疫细胞，特别是巩膜上层的LYVE1+细胞及其与CD31阳性血管的关系。此处采用Z-堆栈技术，在10倍放大倍数下对组织进行扫描，以了解血管与免疫细胞之间的三维空间关系（图4）。
可以分析巩膜以及包埋的眶外肌是否存在血管或免疫细胞。图5显示了LYVE1阳性细胞和CD31阳性血管。
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讨论
对人巩膜进行封片是对此组织进行共聚焦显微镜观察的一种方法。该过程中的一个关键步骤是使用乙醇而非福尔马林来固定组织。根据我们的经验，使用乙醇固定相比福尔马林可获得更好的结果。钝的手术刀会加重操作困难，应避免使用。同样，应避免巩膜干燥，因为干燥会使操作复杂化并降低图像质量。
关于免疫组织化学染色，除本实验所使用的抗体外，也可使用其他抗体。通常情况下，胶原蛋白在绿色通道中表现出更强的自发荧光和背景信号，因此使用红色、蓝色和远红通道可获得背景更低、效果更好的结果。
然而，该技术也存在一些局限性。由于巩膜分层是在显微镜下进行的显微外科操作，因此需要大量的练习才能掌握。由于该技术为手工操作，同一组织样本中各单层切片的尺寸并不完全一致，厚度也存在差异。若需获得尺寸完全相同的组织样本，可考虑采用环钻法作为替代方案，但其层厚仍可能存在变化。为了获得精确设定厚度的巩膜切片，未来实验中可考虑使用自动显微角膜刀作为替代方法。若分层时切取的组织过厚，则盖玻片可能发生移位，组织也存在干燥的风险。一旦完成分层操作，巩膜表层与基质层之间的确切边界可能较难区分.......
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披露
作者声明无财务披露。本文内容完全由作者负责。
致谢
德国研究基金会（FOR2240“眼内炎症性疾病的（淋巴）血管生成与细胞免疫”项目资助 CC 和 LMH；LMH 获 HE 6743/2-1 和 HE 7643/3-1 项目资助；CC 获 CU47/6-1 项目资助），德国抗癌协会（资助 LMH 和 CC），科隆大学 GEROK 项目（资助 SLS 和 LMH），以及欧盟 COST BM1302“角膜再生联合行动”项目（资助 CC）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96% 乙醇 | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| 双目体视显微镜 | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26 G 针头 | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5 mm 打孔器 | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| 10 号手术刀 | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| 眼科显微手术刀片（Micro Feather） | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD31 抗体（单克隆小鼠抗人） | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 抗体 （多克隆兔抗人） | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| 山羊抗小鼠 FITC 抗体 | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| 山羊抗兔 Cy3 抗体 | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| 正常山羊血清 | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| 显微镜载玻片 | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| 24 mm × 24 mm 盖玻片 | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO 荧光封片剂 | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |
参考文献
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al.
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重印与许可
