使用覆膜技术对人巩膜进行共聚焦显微镜观察

摘要

人巩膜组织主要成分为胶原，因此不易用于免疫组织化学检测。为了实现对巩膜组织进行共聚焦显微镜免疫组织化学分析的目标，采用了切片贴附技术。

摘要

巩膜是一种致密的结缔组织，覆盖并保护眼球，主要由致密的胶原纤维束（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ型）构成。由于其自发荧光性、不透明性及较厚的结构，巩膜被认为不适合用于共聚焦显微镜观察。一种替代方法是采用福尔马林固定、石蜡包埋的巩膜组织进行免疫组织化学染色，但该方法存在技术上的挑战，尤其是在抗原修复过程中需要对组织进行加热时。由于巩膜中细胞和血管均相对稀少，因此尝试使用较大的组织样本，以帮助避免遗漏细胞，并有助于理解细胞相对于血管及其他解剖位置的分布情况。为了能够在共聚焦显微镜下分析较大的组织样本，采用了一种切片贴合技术，以从巩膜制备出较薄的组织层。在分析了已获得科学研究许可的CD31标记的血管以及淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）阳性细胞的结果后，本文讨论了该方法的优势与局限性。

引言

巩膜是覆盖眼球的坚硬外层，由致密结缔组织构成。它有助于保护眼内结构并维持眼内压，因此对清晰视力至关重要。巩膜内无淋巴管 ^1,2 从而在其与无淋巴管的内眼之间形成一个无淋巴管的外层边界 ^3-7它还为眼外肌提供附着位点，因此在解剖结构上与肌腱具有相似性。 因为巩膜主要由密集的I型胶原纤维束构成，且含有较少数量的其他胶原类型 三、四、五、六、八 ^8,9 和弹性蛋白 ^10,11该组织不易用于免疫组织化学。

从解剖学上讲，巩膜可分为三层主要结构：（1）表层富含血管的巩膜上层（episclera），位于结膜和滕囊下方，分布于眼球侧面及朝向眼眶后部的区域；（2）巩膜基质，即巩膜的主要部分；（3）棕黑层（lamina fusca），为一层位于葡萄膜正上方的薄而有色素的结构。我们对巩膜的解剖学认识主要来源于20^th世纪上半叶。当时，研究人员主要通过印度墨水注射¹²和血管铸型技术^13-15来研究血管系统的解剖结构。此后，相关研究进一步通过血管造影研究得以开展^16-19。

从那时起，旧的技术得到了改进，新的技术也相继出现，使我们能够补充以往的解剖学知识。例如，可靠的淋巴管标记物，如淋巴管内皮特异性透明质酸受体-1（LYVE1）²⁰ 或足突蛋白（podoplanin）²¹，仅在过去大约十年间才得以应用。共聚焦显微镜为研究眼部不同组织的解剖特征提供了新的可能性。它允许多重染色，以区分细胞标记物，或确定细胞相对于血管及其他解剖结构的位置。当样本尺寸较大时，该技术可提供整体视野，并便于在寻找特定细胞类型时对样本进行逐层扫描。借助Z轴层扫技术，共聚焦显微镜可用于厚度达100–200 µm的样本。巩膜的厚度在肌肉附着处后方约为0.3 mm，而在后极部可达1 mm¹¹。由于其厚度和不透明性，巩膜不适合采用传统方法进行共聚焦显微镜观察。

为解决这一问题，将巩膜组织进行切片处理，以便利用共聚焦显微镜进行分析。该技术有助于更深入地理解人巩膜的生理及病理状态。

方案

使用人体组织必须经过机构审查委员会或同等机构的审查和批准。本研究所描述的工作已获得当地伦理委员会的批准，并获准进行科学研究。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。人眼巩膜标本来自德国科隆大学眼科医院眼库的眼球捐献者（死后获取时间最长为24小时）。

1. 实验准备

1. 在不同的离心管中分别准备96%乙醇和磷酸盐缓冲液（PBS）。将一抗用含有2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS按推荐稀释比例配制，并将所有溶液置于冰上。每份样品准备100 μl。
2. 清洁所有器械，并使用锋利的手术刀片。同一把刀片反复切割后，应及时更换新刀片。
3. 准备1-2把科尔比镊子、直头显微解剖剪、#10手术刀片或眼科用显微刀片（micro feather），以及四根26 G针头。
4. 用铝箔包裹聚苯乙烯板或使用软木板以固定组织。在双目体视显微镜下操作。如需无菌操作，应在超净工作台的层流条件下进行。

2. 准备巩膜

1. 轻轻握住眼球，对角巩膜部分进行穿孔性环钻，然后旋转环钻。小心且均匀地在表面旋转环钻，以获得一个均匀的圆形切口。使用直径为15.5 mm的环钻。用弯剪剪断剩余的连接组织，移除角巩膜环钻部分。这将使眼球前部打开。
   1. 将巩膜组织置于棉签上，开口朝上。使用蜂鸟镊子将视网膜和葡萄膜从巩膜上剥离（同时移除视网膜和葡萄膜两层），避免在巩膜内表面残留色素性葡萄膜。使用弯剪将视网膜和葡萄膜从视盘处清除。从巩膜表面去除残留的结膜、眼外肌和滕囊。
2. 使用直剪刀和蜂鸟镊子按所需大小取下巩膜样本。从不同部位取约2 cm²大小的巩膜样本。由于样本较小，应轻柔夹持巩膜，并用直剪刀将其剪成方形。角巩膜环钻切口定义了巩膜样本的前缘。
   1. 避免反复用镊子夹取组织，因为被镊子夹过的区域不适合进行共聚焦显微镜分析。根据实验类型（例如前部与后部比较，参见图1）以及所用抗体的量，准备所需数量的样本。
3. 将样本放入1.5 ml离心管中备用。在1.5 ml 96%乙醇中固定样本15分钟，然后在1.5 ml PBS中于摇床上洗涤三次，每次5分钟。若使用冷冻组织，应在速冻前完成此步骤。
4. 建议使用新鲜组织。若无法实现，则将巩膜在液氮中速冻，并保存于-20 °C备用。若使用冷冻组织，使用前需解冻。避免反复冻融循环。
5. 将每个样本置于含1.5 ml 5% BSA的PBS中，室温孵育2小时。此步骤可诱导样本膨胀，有助于后续分层操作，同时防止非特异性结合。
6. 待样本充分膨胀后，准备进行巩膜片的分层操作。在显微镜下操作，例如双目体视显微镜下。使用26 G针头将后部巩膜样本固定在铝箔包裹的聚苯乙烯膜或软木板上。
7. 弯曲针头边缘，使其不干扰显微镜下的视野。
8. 对全层巩膜样本进行分层。
   1. 首先用蜂鸟镊子夹住巩膜前缘，然后使用#10手术刀、眼科微羽手术刀或刮匙刀片小心地切取浅层巩膜的一薄层。保持刀片水平，尽可能薄地从深层组织上切下浅层组织。
   2. 从巩膜方片上解剖出一层薄的巩膜组织。该方法类似于小梁切除术中制作瓣膜的标准外科技术，所得组织层厚度应为30–80 µm（参见图2）。
9. 通过向组织中添加少量PBS（例如使用移液器加入50 µl PBS）防止巩膜干燥。
10. 将切下的各层组织放入96孔板中含100 µl PBS的孔内，并标记其方向（外侧与内侧）及层次（浅层与深层），例如使用防水彩色标记。
11. 重复步骤2.7–2.9，直至组织完全分层完毕。

3. 进行免疫组织化学染色

1. 加入100 µl所需的一抗至推荐的稀释比例中。此处， 例如 使用CD31（单克隆小鼠抗人）和LYVE1抗体（兔抗人），两者均以1:100的比例溶于含2% BSA的PBS中，4 °C孵育过夜。更换96孔板中的培养基时，将移液器管尖紧贴孔壁吸取液体。
2. 次日，在摇床上用 200–300 µl PBS 每次洗涤样品，共洗涤三次，每次 5 分钟。加入 100 µl 对应的二抗；此处使用山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）和山羊抗兔氰染料 3（Cy3），将样品在室温下孵育 1–2 小时。用含 2% 山羊血清的 PBS 将二抗按 1:300 稀释。
3. 将样品在摇床中用 200–300 µl PBS 各冲洗三次，每次 5 分钟。
4. 进行细胞核染色， 例如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:2,000 稀释，每孔加入 100 µl，室温孵育 10 分钟），然后在摇床上用 200–300 µl PBS 洗涤 2 次。
5. 将样品转移至载玻片上，加入1-2滴荧光封片剂，盖上盖玻片，用透明指甲油封固边缘，于4 °C保存以备后续使用，或直接用共聚焦显微镜观察。
6. 使用共聚焦显微镜（或同等设备）分析样品。选择所需的放大倍数， 例如 10-40倍放大倍数。
7. 为验证样品的厚度，使用共聚焦显微镜结合Z轴层扫进行测量。可能获得的巩膜切片数量取决于巩膜取材位置，因为赤道部与后部的巩膜厚度存在差异（参见引言部分）。

结果

在本研究进行的代表性实验中，采用这种特定的层压技术可带来显著优势。第一个实验通过三幅代表性图像展示了巩膜上血管丛的复杂网络结构（图3）。这些血管对CD31呈阳性。

第二个实验展示了免疫细胞，特别是巩膜上层的LYVE1+细胞及其与CD31阳性血管的关系。此处采用Z-堆栈技术，在10倍放大倍数下对组织进行扫描，以了解血管与免疫细胞之间的三维空间关系（图4）。

可以分析巩膜以及包埋的眶外肌是否存在血管或免疫细胞。图5显示了LYVE1阳性细胞和CD31阳性血管。

讨论

对人巩膜进行封片是对此组织进行共聚焦显微镜观察的一种方法。该过程中的一个关键步骤是使用乙醇而非福尔马林来固定组织。根据我们的经验，使用乙醇固定相比福尔马林可获得更好的结果。钝的手术刀会加重操作困难，应避免使用。同样，应避免巩膜干燥，因为干燥会使操作复杂化并降低图像质量。

关于免疫组织化学染色，除本实验所使用的抗体外，也可使用其他抗体。通常情况下，胶原蛋白在绿色通道中表现出更强的自发荧光和背景信号，因此使用红色、蓝色和远红通道可获得背景更低、效果更好的结果。

然而，该技术也存在一些局限性。由于巩膜分层是在显微镜下进行的显微外科操作，因此需要大量的练习才能掌握。由于该技术为手工操作，同一组织样本中各单层切片的尺寸并不完全一致，厚度也存在差异。若需获得尺寸完全相同的组织样本，可考虑采用环钻法作为替代方案，但其层厚仍可能存在变化。为了获得精确设定厚度的巩膜切片，未来实验中可考虑使用自动显微角膜刀作为替代方法。若分层时切取的组织过厚，则盖玻片可能发生移位，组织也存在干燥的风险。一旦完成分层操作，巩膜表层与基质层之间的确切边界可能较难区分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96% 乙醇	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
双目体视显微镜	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G 针头	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm 打孔器	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
10 号手术刀	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
眼科显微手术刀片（Micro Feather）	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD31 抗体（单克隆小鼠抗人）	Dako, USA	IR610
LYVE1 抗体 （多克隆兔抗人）	Zytomed, Germany	RBK014-05
山羊抗小鼠 FITC 抗体	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
山羊抗兔 Cy3 抗体	Dianova, Germany	111-165-003
正常山羊血清	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
显微镜载玻片	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
24 mm × 24 mm 盖玻片	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO 荧光封片剂	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 共聚焦显微镜	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a