MyoD 是一种成肌转录因子，具有强大的能力可诱导多种完全分化的非肌肉细胞系发生成肌转分化。参与该转分化过程的表观遗传学机制在很大程度上尚不清楚。本文介绍了一种双重亲和纯化方法，随后进行质谱分析，以全面表征 MyoD 的相互作用蛋白伙伴。
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摘要
摘要
骨骼肌终末分化的起始始于多能中胚层前体细胞向成肌细胞的定向分化。这些细胞仍具有增殖能力，也可进一步分化并融合形成多核的肌管，最终成熟为肌纤维。骨骼肌的终末分化过程由多种转录因子协同调控，尤其是肌肉调节因子（Muscle Regulatory Factors，MRFs）家族成员（MyoD、Myogenin、Myf5 和 MRF4），也称为成肌性bHLH转录因子家族。这些因子与染色质重塑复合物协同作用，构成复杂的转录调控网络，以实现骨骼肌的发生。其中，MyoD 被认为是启动骨骼肌终末分化的关键成肌转录因子。这一观点得到了 MyoD 能将非肌源性细胞转化为骨骼肌细胞这一能力的支持。本文介绍一种系统性鉴定 MyoD 蛋白相互作用伙伴的方法，旨在全面揭示参与骨骼肌终末分化的各类因子。长期目标是阐明调控骨骼肌基因表达的表观遗传机制。 即., MyoD 靶点。通过串联亲和纯化（TAP-Tag）结合质谱（MS）分析，从异源系统中鉴定 MyoD 相互作用蛋白，随后验证这些相关蛋白在骨骼肌终末分化过程中的作用。成肌因子的异常形式或其调控异常与多种肌肉疾病相关，包括先天性肌无力、强直性肌营养不良、横纹肌肉瘤以及肌肉再生缺陷。因此，成肌因子为肌肉疾病的治疗提供了潜在靶点库，不仅涉及致病机制本身，也涵盖可改善疾病治疗的再生机制。因此，深入理解成肌因子调控的分子间相互作用及其遗传程序，对于合理设计高效治疗策略至关重要。
引言
真核多细胞生物由不同的器官和组织构成。每种功能性组织都具有特定的基因表达模式，这种模式在每个分化阶段被确定。细胞分化涉及特定基因的激活、其表达的维持，以及通常对一组基因的沉默，例如参与细胞增殖的基因。因此，骨骼肌分化，即成肌作用，是一个多步骤过程，始于中胚层干细胞向成肌细胞的决定，随后这些成肌细胞逐步终末分化为单核、进而多核的肌管细胞。因此，成肌细胞是"已决定"的细胞，仍具有增殖能力，但已特化于骨骼肌谱系，因此只能在胚胎发育过程中或成体肌肉再生时分化为骨骼肌细胞。骨骼肌终末分化过程由特定的遗传程序调控，该程序始于成肌前体细胞永久性退出细胞周期，导致与增殖相关基因（如E2F靶基因）的永久沉默1。事实上，在终末分化过程中，成肌细胞的增殖停滞是关键步骤，先于骨骼肌特异性基因的表达以及成肌细胞融合形成肌管细胞2。这一程序使得成体肌肉干细胞（也称为卫星细胞）能够在骨骼肌损伤后的再生过程中进行分化。
哺乳动物的成肌作用关键依赖于一组成肌性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，即 MyoD、Myf5、MRF4 和肌生成素（Myogenin），这些因子常被称为骨骼肌决定因子家族或 MRFs（肌肉调控因子）3。它们各自在骨骼肌细胞的命运决定和分化过程中发挥着重要作用，并具有特定的表达模式45-7。Myf5 和 MyoD 的激活是细胞进入成肌谱系的决定性步骤，随后肌生成....
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方案
1. HeLa-S3 细胞核盐可提取组分和染色质结合组分的制备
- 细胞收集
- 在添加了10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素（生长培养基）中，37℃ °C 和 5% CO2 在湿润的培养箱中。
注意：稳定表达 Flag-HA-MyoD 的 HeLa-S3 细胞以及转导空载体的 HeLa-S3 细胞（HeLa-S3 Flag-HA）可通过以下方案建立：19,20，或由作者提供。 - 将每种细胞系（HeLa-S3 Flag-HA-MyoD 和 HeLa-S3 Flag-HA 细胞）扩增至最多10个完全汇合的150 mm培养皿。
- 收集上清液（含非贴壁亚群）至5 L旋转培养瓶中。
- 用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个 150 mm 培养皿中的贴壁细胞亚群，在室温下用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞 1 分钟（15 cm 培养皿使用 2 ml）。
- 每150 mm培养皿加入4 ml培养基，将细胞收集至50 ml离心管中。
- 将步骤 1.1.3（5 L 旋转瓶中）的上清液与步骤 1.1.5 的细胞合并，为每种细胞系加入 500 ml 新鲜预热的生长培养基。
- 将细胞悬液转移至5 L旋转培养瓶中，在37℃下培养至少60小时 °C 和 5% ....
- 在添加了10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素（生长培养基）中，37℃ °C 和 5% CO2 在湿润的培养箱中。
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结果
为了理解 MyoD 活性的调控机制，我们采用生化纯化方法对 MyoD 复合物进行了全面表征，该方法基于对双标签形式的 MyoD 进行免疫纯化，随后进行质谱分析（MS）。利用表达 Flag-HA 标签 MyoD 的 HeLa-S3 细胞系以及表达 Flag-HA 的对照细胞系，可以获得足够的材料，通过针对 Flag-HA-MyoD 的双亲和纯化来分离 MyoD 复合物。
我们将细胞提取物分离为细胞质和细胞核组分，随后进一步将细胞核组分分离为盐提取组分（核盐提取物，SE）和核小体富集组分（核小体富集，NE）。从这些分离的细胞核组分中进行TAP-Tag纯化（图1，表1 和 2) 使得在某一特定核内区域局部浓度相对较低的相互作用伙伴得以被揭示。此外，该策略还被用于发现非结合型（SE）的相互作用伙伴。 与 通过检测与DNA结合的（核提取物中的）MyoD，以深入了解MyoD活性的.......
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讨论
所介绍的方法能够全面鉴定转录因子 MyoD 的相互作用蛋白。该方法在一种对 MyoD 诱导分化具有抗性的异源系统（即 HeLa-S3 细胞）中揭示了 MyoD 的相互作用蛋白。因此，根据定义，所鉴定出的 MyoD 相互作用蛋白为普遍表达的蛋白，包括通用转录因子和序列特异性转录因子、染色质修饰酶、RNA 加工蛋白、激酶（表1 和 2）。由于HeLa-S3细胞对MyoD诱导的转分化具有抗性，MyoD的活性主要表现为抑制作用，因此所鉴定出的互作蛋白很可能是MyoD的共抑制因子。这一点由Id蛋白的存在得以凸显（表1 和 2，图 2），已知可抑制 MyoD 的转录激活能力8重要的是，这种抑制状态对应于增殖期成肌细胞中 MyoD 的状态。事实上，我们证实了通过所述方法鉴定出的 MyoD 互作蛋白 CBFβ 与 MyoD 的相互作用可在增殖期 C2C12 成肌细胞中被检测到，但在细胞发生分化后该相互作用则消失（见 图 3D）。然而，需要注意的是，本研究所提出方法.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Ait-Si-Ali 实验室的工作得到了法国肌病协会 Téléthon（AFM-Téléthon）；法国国家癌症研究院（INCa）；法国国家科研署（ANR）；癌症研究协会基金会（Fondation ARC）；法国企业抗癌联合会（GEFLUC）；法国国家科学研究中心（CNRS）；巴黎狄德罗大学；以及由法国政府通过“未来投资”计划资助、ANR 管理的“我是谁？”卓越实验室 #ANR-11-LABX-0071（项目编号 #ANR-11-IDEX-0005-01）的支持。EB 获得了 INCa 基金项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞系 | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| 设备 | |||
| 旋转培养瓶 | Corning | 778531 | |
| 匀浆器： Dounce 匀浆器 | Wheaton | 432-1273 和 432-1271 | |
| 旋转培养瓶振荡装置 | Bellco | 778531 | |
| 超声破碎仪 | Diagenode | UCD 200 | |
| 血细胞计数板 | Marienfeld Superior | 640610 | |
| 低吸附离心管 | Sorenson | 27210 | |
| 空离心柱 | Bio-Rad | 7326204 | |
| 试剂 | |||
| SDS-聚丙烯酰胺 4-12% 凝胶 | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x 上样缓冲液 | Life technologies | NP0007 | |
| 10x 还原剂 | Life technologies | NP0004 | |
| 银染试剂盒 | Life technologies | A8592 | |
| 离心过滤装置，10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G 琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G 树脂 | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag 树脂（抗 Flag M2-琼脂糖亲和凝胶） | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA 树脂（单克隆抗 HA 琼脂糖） | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag 游离肽（DYKDDDDK） | Ansynth Service BV | 定制合成 | 用 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）溶解至浓度不超过 4 mg/ml |
| HA 游离肽（YPYDVPDYA） | Ansynth Service BV | 定制合成 | 用 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）溶解至浓度不超过 4 mg/ml |
| 基于双辛可宁酸的蛋白定量检测试剂盒：BCA 试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| 基于鲁米诺的增强型化学发光（ECL）HRP 底物 | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| 剪切的鲑鱼精子 DNA（鲑鱼精脱氧核糖核酸钠盐） | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| 四盐酸精胺 | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS 电泳缓冲液 | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM（高糖） | Sigma-Aldrich | D0822 | 使用前于 37 °C 预热 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05% 酚红） | Life technologies | 25300-054 | |
| 血清 | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | 每批血清在使用前均需针对您的细胞进行测试。 |
| 青霉素和链霉素 | Life technologies | 15140-122 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| 水（无菌过滤） | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| 抗体 | |||
| 来自大鼠的 HA（12CA5） | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | 用于 Western 印迹 |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | 用于免疫共沉淀和 Western 印迹 |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| 微管蛋白 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| 肌动蛋白 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 小鼠 IgG | Santa Cruz | SC-2025 | |
| 兔 IgG | Santa Cruz | SC-2027 | |
| 山羊抗大鼠-HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| 山羊抗兔-HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| 山羊抗小鼠-HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
参考文献
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regul....
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