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方法文章

利用串联亲和纯化联合质谱技术鉴定MyoD相互作用组

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DOI：

10.3791/53924

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2016年5月17日

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

本文内容

摘要

MyoD 是一种成肌转录因子，具有强大的能力可诱导多种完全分化的非肌肉细胞系发生成肌转分化。参与该转分化过程的表观遗传学机制在很大程度上尚不清楚。本文介绍了一种双重亲和纯化方法，随后进行质谱分析，以全面表征 MyoD 的相互作用蛋白伙伴。

摘要

骨骼肌终末分化的起始始于多能中胚层前体细胞向成肌细胞的定向分化。这些细胞仍具有增殖能力，也可进一步分化并融合形成多核的肌管，最终成熟为肌纤维。骨骼肌的终末分化过程由多种转录因子协同调控，尤其是肌肉调节因子（Muscle Regulatory Factors，MRFs）家族成员（MyoD、Myogenin、Myf5 和 MRF4），也称为成肌性bHLH转录因子家族。这些因子与染色质重塑复合物协同作用，构成复杂的转录调控网络，以实现骨骼肌的发生。其中，MyoD 被认为是启动骨骼肌终末分化的关键成肌转录因子。这一观点得到了 MyoD 能将非肌源性细胞转化为骨骼肌细胞这一能力的支持。本文介绍一种系统性鉴定 MyoD 蛋白相互作用伙伴的方法，旨在全面揭示参与骨骼肌终末分化的各类因子。长期目标是阐明调控骨骼肌基因表达的表观遗传机制。 即., MyoD 靶点。通过串联亲和纯化（TAP-Tag）结合质谱（MS）分析，从异源系统中鉴定 MyoD 相互作用蛋白，随后验证这些相关蛋白在骨骼肌终末分化过程中的作用。成肌因子的异常形式或其调控异常与多种肌肉疾病相关，包括先天性肌无力、强直性肌营养不良、横纹肌肉瘤以及肌肉再生缺陷。因此，成肌因子为肌肉疾病的治疗提供了潜在靶点库，不仅涉及致病机制本身，也涵盖可改善疾病治疗的再生机制。因此，深入理解成肌因子调控的分子间相互作用及其遗传程序，对于合理设计高效治疗策略至关重要。

引言

真核多细胞生物由不同的器官和组织构成。每种功能性组织都具有特定的基因表达模式，这种模式在每个分化阶段被确定。细胞分化涉及特定基因的激活、其表达的维持，以及通常对一组基因的沉默，例如参与细胞增殖的基因。因此，骨骼肌分化，即成肌作用，是一个多步骤过程，始于中胚层干细胞向成肌细胞的决定，随后这些成肌细胞逐步终末分化为单核、进而多核的肌管细胞。因此，成肌细胞是"已决定"的细胞，仍具有增殖能力，但已特化于骨骼肌谱系，因此只能在胚胎发育过程中或成体肌肉再生时分化为骨骼肌细胞。骨骼肌终末分化过程由特定的遗传程序调控，该程序始于成肌前体细胞永久性退出细胞周期，导致与增殖相关基因（如E2F靶基因）的永久沉默1。事实上，在终末分化过程中，成肌细胞的增殖停滞是关键步骤，先于骨骼肌特异性基因的表达以及成肌细胞融合形成肌管细胞2。这一程序使得成体肌肉干细胞（也称为卫星细胞）能够在骨骼肌损伤后的再生过程中进行分化。

哺乳动物的成肌作用关键依赖于一组成肌性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，即 MyoD、Myf5、MRF4 和肌生成素（Myogenin），这些因子常被称为骨骼肌决定因子家族或 MRFs（肌肉调控因子）3。它们各自在骨骼肌细胞的命运决定和分化过程中发挥着重要作用，并具有特定的表达模式45-7。Myf5 和 MyoD 的激活是细胞进入成肌谱系的决定性步骤，随后肌生成素的表达启动成肌过程，并激活骨骼肌特异性基因（如 MCK，即肌肉肌酸激酶）的表达。成肌性 bHLH 转录因子与 MEF2 家族成员协同作用，激活原本处于沉默状态的肌肉基因位点8。它们还可与普遍存在的 bHLH 蛋白 E12 和 E47（称为 E 蛋白）形成异源二聚体，结合到多种基因调控区域中的所谓 E-box 序列，从而促进骨骼肌基因的转录8。Twist、Id（分化抑制因子）及其他因子则通过与 MyoD 竞争结合 E 蛋白的方式，负向调控这一过程8。

MyoD 被认为是触发肌肉终末分化的关键因子9，因为它能够在许多完全分化的非肌细胞系统中诱导成肌决定/分化（转分化）程序10-13。事实上，强制表达 MyoD 可诱导多种细胞类型的转分化，甚至包括来自不同胚胎起源的细胞12。例如，MyoD 可将肝细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、神经母细胞和脂肪细胞转化为类肌细胞。MyoD 的转分化作用涉及在非肌细胞环境中异常激活成肌遗传程序（尤其是其靶基因），同时伴随原有遗传程序（特别是增殖相关基因）的沉默。

在增殖的成肌细胞中，MyoD 虽然表达，但即使结合到靶基因的启动子上，也无法激活这些基因的表达14-16。因此，MyoD 在未分化成肌细胞中持续表达的必要性仍不明确。在增殖的成肌细胞中，MyoD 可能通过招募抑制性染色质修饰酶，从而在激活性染色质重塑酶加载之前抑制其靶基因的表达14,17。例如，在增殖的成肌细胞中，MyoD 与转录共抑制因子 KAP-1、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）以及抑制性赖氨酸甲基转移酶（KMTs）相关联，包括组蛋白 H3 赖氨酸 9（H3K9）和 H3K27 甲基转移酶，并通过建立局部抑制性染色质结构主动抑制其靶基因的表达14,17。重要的是，最近一项研究表明，MyoD 本身可被 H3K9 甲基转移酶 G9a 直接甲基化，从而抑制其转录激活活性16。

MyoD介导非肌细胞转分化过程中的表观遗传机制在很大程度上尚不清楚。值得注意的是，某些细胞系对MyoD诱导的转分化具有抗性。例如，在HeLa细胞中，由于染色质重塑复合物SWI/SNF的BAF60C亚基表达缺失，MyoD可能处于失活状态，甚至可能发挥转录抑制因子而非激活因子的功能18。因此，该模型可用于深入表征MyoD诱导基因抑制的分子机制。此外，该模型也适用于检测MyoD与其协同因子共同在其靶向位点建立抑制性染色质环境的能力，从而揭示在增殖性成肌细胞中依赖MyoD的抑制机制，以精确调控终末分化过程。

本文描述了利用串联亲和纯化（TAP-Tag）结合质谱分析（MS）鉴定MyoD相互作用蛋白的实验方案。通过使用稳定表达Flag-HA-MyoD的HeLa-S3细胞，可获得足量材料，从分级的核提取物中纯化MyoD复合物。在异源系统中鉴定出MyoD相互作用蛋白后，进一步在相关生物学系统中进行验证。

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方案

1. HeLa-S3 细胞核盐可提取组分和染色质结合组分的制备

  1. 细胞收集
    1. 在添加了10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素（生长培养基）中，37℃ °C 和 5% CO2 在湿润的培养箱中。
      注意：稳定表达 Flag-HA-MyoD 的 HeLa-S3 细胞以及转导空载体的 HeLa-S3 细胞（HeLa-S3 Flag-HA）可通过以下方案建立：19,20，或由作者提供。
    2. 将每种细胞系（HeLa-S3 Flag-HA-MyoD 和 HeLa-S3 Flag-HA 细胞）扩增至最多10个完全汇合的150 mm培养皿。
    3. 收集上清液（含非贴壁亚群）至5 L旋转培养瓶中。
    4. 用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个 150 mm 培养皿中的贴壁细胞亚群，在室温下用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞 1 分钟（15 cm 培养皿使用 2 ml）。
    5. 每150 mm培养皿加入4 ml培养基，将细胞收集至50 ml离心管中。
    6. 将步骤 1.1.3（5 L 旋转瓶中）的上清液与步骤 1.1.5 的细胞合并，为每种细胞系加入 500 ml 新鲜预热的生长培养基。
    7. 将细胞悬液转移至5 L旋转培养瓶中，在37℃下培养至少60小时 °C 和 5% CO2 在湿润的培养箱中。
    8. 加入500 ml新鲜生长培养基，培养细胞24小时。
    9. 加入1升新鲜生长培养基，培养细胞24小时。
    10. 取出1 ml细胞悬液用于细胞计数和检测细胞活力。颜色30 µ细胞悬液的30微升 µ加入0.4%台盼蓝溶液，使用血细胞计数板在显微镜下计数未染色（非蓝色）的活细胞。
    11. 保持细胞密度在 2 - 6 x 105 细胞/ml，通过每天添加新鲜的生长培养基；不要超过 1 x 106 细胞/毫升。每个5 L搅拌瓶的最大工作体积为2.5 L。
      注意：以下步骤需分批进行，每批培养体积为 2 - 2.5 L，细胞密度为 1 x 106 细胞/毫升。重复步骤 1.1.12 - 1.1.14，收集约 20 升 (≈ 每种细胞系在进行下一步之前，需准备20 g干菌体沉淀。
    12. 500 × g 离心 5 分钟，4 ℃ 收集细胞 °C 并弃去上清液。
    13. 用移液器将细胞重悬于 100 ml 冰冷的 PBS 中，于 4 ℃、500 × g 离心 5 分钟 °C 以洗涤沉淀。
    14. 用25 ml预冷的PBS重悬细胞，转移至50 ml离心管中，于4 °C以500 × g离心5 min，重复洗涤一次。 °C.
      注意：细胞沉淀可立即使用，或在液氮中速冻后于 -80 ℃ 保存 °C 培养数天。
  2. 细胞核的分离
    注意：步骤 1.2.1 - 1.4.3 需在冷室中进行。
    1. 预冷缓冲液和匀浆器。
    2. 若使用冷冻样品，需将细胞沉淀在37℃水浴中快速解冻 °C.
    3. 重悬20 g（≈ 20 ml) 细胞加入 20 ml（体积等于细胞沉淀大小）的低渗缓冲液 A 中表3首先使用10 ml缓冲液，然后加入5 ml，再加入另外5 ml。用新鲜缓冲液充分清洗移液管，以获得尽可能多的细胞。
    4. 将40 ml细胞悬液转移至预冷的带有严密切合研杵的匀浆器中。
    5. 使用匀浆器将细胞匀浆20次（20次进出运动），并将细胞悬液转移至50 ml离心管中。
    6. 用7 ml清洗匀浆器 蔗糖缓冲液（初始细胞体积的1/3， 表3) 以回收尽可能多的细胞。迅速将此悬液转移至步骤 1.2.5 中的 50 ml 离心管中，以保护细胞核并减少泄漏。
    7. 染色30 µl 一份等量样品与 30 µ加入0.4%台盼蓝溶液，显微镜下观察以检测裂解效率（若裂解成功，所有细胞核均应呈蓝色）。如有必要，重复匀浆步骤。
    8. 在 4°C、10,000 × g 条件下离心 7 分钟 °C，离心以沉淀细胞核。将上清液保存为细胞质组分。
  3. 核盐可提取组分（SE）的制备
    1. 将核沉淀重悬于8 ml蔗糖缓冲液中（体积等于核沉淀的体积）。在涡旋振荡器上充分混匀的同时，逐滴加入8 ml高盐缓冲液（1个核沉淀体积）， 表3) 使 NaCl 的终浓度为 300 mM。冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟混匀一次。
    2. 将蔗糖缓冲液 8 ml（总体积的 1/3）加入，使 NaCl 浓度降至 150 mM。在 4 °C、13,000 × g 条件下离心 10 分钟 °C. 收集上清液（核盐提取物组分，SE）。
      注意：可选择继续进行步骤 1.3.3，或在制备染色质结合组分期间将 SE 组分置于冰上，随后同时对两个组分进行超速离心。
    3. 在4℃下以85,000 × g离心30分钟 °C. 取上清液（≈ 26 ml
    4. 冻存100 µ将分装样品置于液氮中，继续进行第2步。 "蛋白质复合物纯化"，使用剩余的提取物。
      注意：该等分试样将在步骤 5.1.1 中用作输入对照。
  4. 染色质结合组分的制备
    1. 将沉淀物（来自步骤 1.3.5）仔细重悬于 7 ml 蔗糖缓冲液中（体积与沉淀物大小相等）。
    2. 加入 CaCl2 至终浓度为 1 mM（28 µ0.5 M CaCl 溶液2 加入14 ml悬浮液以激活MNase（步骤1.4.4），混匀。
    3. 37℃预热悬浮液1分钟 °C.
    4. 加入70 µl 微球菌核酸酶（MNase）以获得终浓度为 0.0025 U/µl（0.5 U 的 1/200 稀释）µl 储液）并混匀。
    5. 在37℃下准确孵育12分钟 °C. 每4分钟混匀一次。
    6. 立即将反应物置于冰上。
    7. 为了终止MNase活性，加入112 µ加入0.5 M EDTA（pH 8.0）至终浓度为4 mM（1/125稀释）。冰上孵育5分钟。
    8. 超声处理5次，每次1分钟，高振幅；两次超声处理之间间隔1分钟（总计10分钟）。
    9. 在 4°C、85,000 × g 条件下超速离心 30 分钟 °C.
    10. 收集上清液（核小体富集组分，NE） ≈ 12 ml
    11. 冻存50 µ将等分试样放入液氮中，继续进行第2步。 "蛋白质复合物纯化"，使用提取物的剩余部分。
      注意：该等分试样将在步骤 5.1.1 中用作输入对照。

2. 蛋白质复合物纯化

注意：需平行处理每种细胞系的提取物（HeLa-S3 Flag-HA-MyoD 及对照 HeLa-S3 Flag-HA）。

  1. 基于 Flag 标签的纯化
    1. 预清洗 Flag 树脂。每个实验点（每种细胞系的 SE 和 NE 组分）使用 600 µl 的 Flag 树脂（来自市售的 50% 储液）。
    2. 将树脂转移至 15 ml 离心管中，用 13 ml 冷 TEGN 缓冲液（表 3）重悬，于 1,000 × g 离心 2 分钟，弃上清。重复此步骤 5 次。最后一次清洗后，将 Flag 树脂重悬于等体积的 TEGN 缓冲液中（每个实验点 300 µl）。
    3. 对于每个实验点，将 600 µl 已清洗的 Flag 树脂与相应的蛋白提取物混合（12 ml NE 组分使用 15 ml 管，26 ml SE 组分使用 50 ml 管）。于 4 °C 在旋转摇床上孵育过夜。
    4. 于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，将上清液保留并置于 4 °C，待后续用于检测纯化效率（2.2 节）。
    5. 对于 SE 样品，用 4 ml TEGN 重悬 Flag 树脂，并转移至 15 ml 管中。重复此步骤 3 次，每次均转移至同一 15 ml 管中以避免珠粒损失。每次均于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，弃上清。
    6. 在 15 ml 管中使用 13 ml TEGN 缓冲液洗涤 Flag 树脂 7 次，每次均于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，弃上清。
    7. 最后一次洗涤后，用 1 ml TEGN 重悬，转移至 1.5 ml 低吸附离心管中。于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，弃上清。
    8. 每个实验点用 200 µl pH 7.8 的 Flag 肽溶液（4 mg/ml）重悬珠粒。混合珠粒与肽溶液。加入 200 µl TEGN 缓冲液，于 4 °C 孵育至少 4 小时或过夜，以洗脱结合的蛋白。
    9. 于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，将树脂和上清液（Flag 洗脱液）转移至置于 2 ml 管中的空自旋柱中。
    10. 离心柱体，收集残余上清液至 2 ml 管中。
    11. 通过向柱中加入 TEGN 缓冲液回收 Flag 树脂，并对每个实验点使用 200 µl Flag 肽溶液（4 mg/ml）于 4 °C 孵育过夜，进行第二次 Flag 洗脱。
    12. 重复步骤 2.1.9–2.1.10 以收集第二次洗脱液。合并第一次和第二次洗脱液。
  2. 纯化效率检测
    注意：在步骤 2.1.11–2.1.12 期间，进行 SDS-PAGE 和银染（2.2.1–2.2.2）。
    1. 取 15 µl 洗脱液，加入 5 µl 4× 上样缓冲液和 2 µl 10× 还原剂，于 96 °C 煮沸 5 分钟，按照制造商说明在 4–12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
    2. 使用银染试剂盒对凝胶染色（遵循制造商说明）。若 Flag-HA-MyoD 与 Flag-HA 空载对照洗脱液之间的蛋白图谱存在明显差异，特别是 Flag-HA MyoD 条带（约 50 kDa，图 1A），则继续下一步操作。
  3. 基于血凝素（HA）标签的纯化
    1. 将 HA 树脂转移至 15 ml 管中，用 13 ml TEGN 缓冲液重悬，并于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟进行清洗。重复清洗 5 次。最后一次清洗后，将珠粒重悬于等体积的 TEGN 缓冲液中。
      注意：体积需根据 Flag 标签纯化效率进行调整。每个实验点初始使用市售 50% 储液中的 300 µl。
    2. 将每个实验点的 HA 树脂转移至 1.5 ml 低吸附离心管中。于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，尽可能去除清洗缓冲液（表 3），然后将 Flag 标签纯化所得的洗脱液加入 HA 树脂中。
    3. 于 4 °C 在旋转摇床上孵育过夜。
    4. 于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，将上清液保留并置于 4 °C，待后续用于检测纯化效率（2.3.12 节）。
    5. 用 0.5 ml TEGN 重悬 HA 树脂，转移至新的 1.5 ml 低吸附管中。再次重悬并加入同一 1.5 ml 管中以避免珠粒损失，于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，弃上清。
    6. 每次使用 1 ml TEGN 缓冲液洗涤珠粒 8 次，每次均于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，弃上清（注意避免珠粒损失）。最后一次洗涤后，将珠粒转移至 0.5 ml 管中。
    7. 尽可能去除上清液。在珠粒中加入 100 µl pH 7.8 的 HA 游离肽溶液（4 mg/ml）以洗脱结合的蛋白。于 4 °C 在旋转摇床上孵育过夜。
      注意：HA 肽的用量需根据复合物丰度进行调整。
    8. 于 4 °C 以 1,000 × g 离心 2 分钟，将树脂和上清液（HA 洗脱液）转移至置于 2 ml 管中的空自旋柱中。
    9. 离心柱体，收集残余上清液至 2 ml 管中。
    10. 对每个实验点使用 100 µl HA 肽（4 mg/ml）进行第二次洗脱。于 4 °C 在旋转摇床上孵育过夜。重复步骤 2.3.8–2.3.9 以收集第二次洗脱液。
    11. 合并第一次和第二次洗脱液。
    12. 通过 SDS-PAGE 和银染检测纯化效率（参见步骤 2.2）（图 1A）。
    13. 使用截留分子量为 10 kDa（标称分子量极限，NMWL）的离心过滤装置，按照制造商说明将 HA 洗脱液浓缩至 30 µl。
    14. 将浓缩样品分为两部分：22.5 µl（3/4）和 7.5 µl（1/4）。将 1/4 样品在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。其余 3/4 样品用于步骤 3。
      注意：冷冻的 1/4 样品将用于通过 Western 印迹验证质谱结果（参见步骤 5.1）。

3. 质谱分析

注意：以下步骤应与将进行分析的质谱平台共同商议。

  1. 取样品的3/4（22.5 µl），加入7.5 µl 4x 上样缓冲液和3.3 µl 10x还原剂，于96 °C煮沸5分钟。
  2. 将样品上样至4 - 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，以150 V恒压电泳5分钟，使所有蛋白质进入凝胶而暂不分离。
  3. 用去离子水洗涤凝胶；用固定液（10%乙酸、50%甲醇、40%超纯水）固定20 - 30分钟，然后用超纯水将固定后的凝胶洗涤5次。
  4. 切下含有蛋白质的条带，置于1.5 ml离心管中，加入1 ml水保存，并送至质谱分析平台。

4. 数据分析

注意：这是分析的一般性指导。具体步骤将取决于用于执行分析的质谱平台所提供的数据模式（例如 21,22）。

  1. 将“MyoD”洗脱液中鉴定出的蛋白质列表与相应阴性对照样品获得的列表进行比较，排除两个列表中均出现的蛋白质。
  2. 从剩余列表中剔除鉴定肽段总数≤2的蛋白质。
  3. 利用DAVID生物信息学资源（http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）获取所得蛋白质列表的功能注释和功能分类，并对蛋白质列表进行分类23,24。
  4. （可选）从列表中去除“搭车蛋白”（hitchhikers），即具有强非特异性结合负电荷DNA能力的带电荷非核蛋白25，包括细胞骨架、胞质、线粒体、膜和受体蛋白（见表1和表2中的蛋白质折叠、细胞骨架和杂类蛋白）。
  5. 比较SE和NE组分中获得的MyoD相互作用蛋白列表，以鉴定两组分共有的蛋白以及各组分特有的蛋白（图2）。

5. 通过蛋白质印迹验证已鉴定的相互作用蛋白

  1. 在 HeLa-S3 Flag-HA-MyoD 和 HeLa-S3 Flag-HA 细胞中的验证
    1. 将步骤 2.3.14 中获得的洗脱样品（7.5 µl）置于冰上解冻。加入 12 µl TEGN 缓冲液、10 µl 4x 上样缓冲液和 3 µl 10x 还原剂。在 96 °C 下煮沸 5 分钟。
    2. 为 Western 印迹准备上样样品。
      1. 解冻步骤 1.3.9 和 1.4.11 中保存的等分样品，并测定蛋白浓度，例如使用 BCA 试剂盒（遵循制造商说明）。
      2. 每道使用 15 µg 蛋白。量取适量提取物，并用 TEGN 缓冲液调整样品体积至 15 µl。
      3. 加入 5 µl 4x 上样缓冲液和 1.5 µl 10x 还原剂。在 96 °C 下煮沸 5 分钟。
    3. 使用感兴趣的抗体（针对质谱分析中鉴定出的候选互作蛋白）对 15 µl 洗脱样品进行 Western 印迹分析。使用输入提取物作为内源性蛋白水平的对照（图 3A）。
  2. 在相关细胞系统中的验证
    1. 制备 C2C12 小鼠成肌细胞的总核提取物。
      1. 在含 15% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素的 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 C2C12 小鼠成肌细胞。细胞融合度切勿超过 80%，以维持其增殖状态。
      2. 为一次免疫沉淀（IP）（一个抗体）至少培养两块 150 mm 培养皿的 C2C12 细胞。吸除培养基，用 10 ml PBS 洗涤细胞两次。
      3. 刮取细胞并收集至 15 ml 离心管中。在 4 °C 下以 250 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      4. 估算细胞沉淀的体积（= Vcell）。用 3 倍体积 Vcell 的低渗缓冲液 B 轻柔重悬沉淀，以破坏细胞质膜（表 3）。
      5. 加入 0.44 × Vcell 体积的 10% NP-40，使终浓度达到 1%（v/v）。轻轻颠倒混匀数次。
      6. 加入 0.89 × Vcell 体积的 SR 缓冲液（表 3），以保持细胞核完整性。轻轻颠倒混匀数次，然后在 2,000 x g 下离心 5 分钟以收集细胞核沉淀。
      7. 弃去上清液（细胞质组分）。估算细胞核沉淀的体积（= Vnuc）。用一体积 Vnuc 的蔗糖缓冲液重悬细胞核沉淀。
      8. 一边涡旋混匀，一边逐滴加入一体积 Vnuc 的高盐缓冲液，使 NaCl 终浓度达到 300 mM，冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟混匀一次。
      9. 加入一体积 Vnuc 的蔗糖缓冲液（将 NaCl 浓度降至 150 mM）和 CaCl2（终浓度 1 mM），混匀。
      10. 将悬液在 37 °C 预热 1 分钟，加入微球菌核酸酶（MNase），使其终浓度为 0.0025 U/µl（取 0.5 U/µl 储液的 1/200），混匀。
      11. 在 37 °C 精确孵育 12 分钟，每 3 分钟混匀一次。
      12. 立即置于冰上，加入 EDTA 至终浓度 4 mM，以终止 MNase 活性，冰上孵育 5 分钟。
      13. 高功率超声处理 5 次，每次 0.5 分钟，两次之间间隔 0.5 分钟（共 5 分钟）。
      14. 在 4 °C 下以 85,000 x g 超速离心 30 分钟，收集上清液（总核提取物）。
      15. 测定总核提取物的蛋白浓度，例如使用 BCA 试剂盒（遵循制造商说明），并立即进行步骤 5.2.2。
    2. 内源性 MyoD 的免疫沉淀（IP）。
      1. 为预清除提取物，每 IP 点需洗涤 10 µl 蛋白 G 琼脂糖珠。
        1. 将所需体积的蛋白 G 琼脂糖珠转移至 1.5 ml 离心管中，用 1.4 ml 冷 TEGN 重悬，1,800 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。重复 3 次。
      2. 将预洗过的蛋白 G 琼脂糖珠与适量的总核提取物混合。每 IP 点使用 500 µg 总核提取物蛋白。
      3. 在 4 °C 下旋转孵育 2 小时，以预清除提取物。
      4. 在 4 °C 下以 1,800 x g 离心 5 分钟，保留上清液。
      5. 在 1.5 ml 低吸附离心管中，将 5 µg MyoD 抗体或 5 µg 兔 IgG 与 500 µg 预清除的总核提取物混合，用 TEGN 缓冲液定容至 1 ml。在 4 °C 下旋转过夜孵育。
        注：在步骤 5.2.2.3 进行期间执行以下步骤。
      6. 每 IP 点预洗 7.5 µl 蛋白 A/G 储液珠。
        1. 将所需体积的珠子转移至 1.5 ml 离心管中，用 1 ml TEGN 重悬，在 4 °C 下以 1,800 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。重复 3 次。
      7. 将蛋白 A/G 珠子重悬于 1.5 ml 封闭溶液（表 3）中，在 4 °C 下旋转过夜孵育。
      8. 将与抗体孵育后的总核提取物（步骤 5.2.2.5）在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟，保留上清液。
      9. 将封闭后的蛋白 A/G 树脂（步骤 5.2.2.7）在 4 °C 下以 1,800 x g 离心 2 分钟，弃去上清液，用 1 ml TEGN 缓冲液重悬，再次在 4 °C 下以 1,800 x g 离心 2 分钟以洗去封闭液。
      10. 将封闭后的蛋白 A/G 树脂重悬于 1 ml TEGN 缓冲液中，分装至新的低蛋白吸附离心管中，每 IP 点 7.5 µl。在 4 °C 下以 1,800 x g 离心 2 分钟，尽可能吸除上清液。
      11. 将与抗体（或对照 IgG）孵育后的总核提取物加入 A/G 树脂中，混匀后在室温（RT）下旋转孵育 2 小时。
      12. 在室温下以 1,800 x g 离心 2 分钟，弃去上清液，用 1 ml 洗涤缓冲液重悬，并转移至新的低吸附离心管中。在室温下旋转孵育 5 分钟。
      13. 在室温下以 1,800 x g 离心 2 分钟，用 1 ml 洗涤缓冲液重悬，在室温下旋转孵育 5 分钟。重复此步骤共 4 次。最后一次洗涤时转移至新的低吸附离心管中。
      14. 尽可能吸除上清液。向珠子中加入 7 µl 洗涤缓冲液、7 µl 4x 上样缓冲液和 3 µl 10x 还原剂，混匀后在 96 °C 下煮沸 5 分钟。
      15. 使用感兴趣的抗体（针对免疫沉淀蛋白的候选互作蛋白）进行 Western 印迹分析。使用 1%（5 μg）的输入提取物作为内源性蛋白水平的对照（图 3B）。

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结果

为了理解 MyoD 活性的调控机制，我们采用生化纯化方法对 MyoD 复合物进行了全面表征，该方法基于对双标签形式的 MyoD 进行免疫纯化，随后进行质谱分析（MS）。利用表达 Flag-HA 标签 MyoD 的 HeLa-S3 细胞系以及表达 Flag-HA 的对照细胞系，可以获得足够的材料，通过针对 Flag-HA-MyoD 的双亲和纯化来分离 MyoD 复合物。

我们将细胞提取物分离为细胞质和细胞核组分，随后进一步将细胞核组分分离为盐提取组分（核盐提取物，SE）和核小体富集组分（核小体富集，NE）。从这些分离的细胞核组分中进行TAP-Tag纯化（图1，表1 和 2) 使得在某一特定核内区域局部浓度相对较低的相互作用伙伴得以被揭示。此外，该策略还被用于发现非结合型（SE）的相互作用伙伴。 与 通过检测与DNA结合的（核提取物中的）MyoD，以深入了解MyoD活性的...

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讨论

所介绍的方法能够全面鉴定转录因子 MyoD 的相互作用蛋白。该方法在一种对 MyoD 诱导分化具有抗性的异源系统（即 HeLa-S3 细胞）中揭示了 MyoD 的相互作用蛋白。因此，根据定义，所鉴定出的 MyoD 相互作用蛋白为普遍表达的蛋白，包括通用转录因子和序列特异性转录因子、染色质修饰酶、RNA 加工蛋白、激酶（表1 和 2）。由于HeLa-S3细胞对MyoD诱导的转分化具有抗性，MyoD的活性主要表现为抑制作用，因此所鉴定出的互作蛋白很可能是MyoD的共抑制因子。这一点由Id蛋白的存在得以凸显（表1 和 2，图 2），已知可抑制 MyoD 的转录激活能力8重要的是，这种抑制状态对应于增殖期成肌细胞中 MyoD 的状态。事实上，我们证实了通过所述方法鉴定出的 MyoD 互作蛋白 CBFβ 与 MyoD 的相互作用可在增殖期 C2C12 成肌细胞中被检测到，但在细胞发生分化后该相互作用则消失（见 图 3D）。然而，需要注意的是，本研究所提出方法...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Ait-Si-Ali 实验室的工作得到了法国肌病协会 Téléthon（AFM-Téléthon）；法国国家癌症研究院（INCa）；法国国家科研署（ANR）；癌症研究协会基金会（Fondation ARC）；法国企业抗癌联合会（GEFLUC）；法国国家科学研究中心（CNRS）；巴黎狄德罗大学；以及由法国政府通过“未来投资”计划资助、ANR 管理的“我是谁？”卓越实验室 #ANR-11-LABX-0071（项目编号 #ANR-11-IDEX-0005-01）的支持。EB 获得了 INCa 基金项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞系
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
设备
旋转培养瓶Corning778531
匀浆器： Dounce 匀浆器 Wheaton432-1273 和 432-1271
旋转培养瓶振荡装置Bellco778531
超声破碎仪DiagenodeUCD 200
血细胞计数板Marienfeld Superior 640610
低吸附离心管Sorenson27210
空离心柱Bio-Rad7326204
试剂
SDS-聚丙烯酰胺 4-12% 凝胶Life technologiesNP0336BOX
4x 上样缓冲液 Life technologiesNP0007
10x 还原剂Life technologiesNP0004
银染试剂盒Life technologiesA8592
离心过滤装置，10KMilliporeUFC501024
Protein G 琼脂糖珠Sigma-AldrichP4691
Protein A/G 树脂Thermo Scientific53132
Flag 树脂（抗 Flag M2-琼脂糖亲和凝胶）Sigma-AldrichA2220
HA 树脂（单克隆抗 HA 琼脂糖）Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Flag 游离肽（DYKDDDDK）Ansynth Service BV定制合成用 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）溶解至浓度不超过 4 mg/ml
HA 游离肽（YPYDVPDYA）Ansynth Service BV定制合成用 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）溶解至浓度不超过 4 mg/ml
基于双辛可宁酸的蛋白定量检测试剂盒：BCA 试剂盒Thermo Scientific23225
蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichS8830
基于鲁米诺的增强型化学发光（ECL）HRP 底物Life technologies34075
BSASigma-AldrichA9647
剪切的鲑鱼精子 DNA（鲑鱼精脱氧核糖核酸钠盐）Sigma-AldrichD1626
四盐酸精胺Sigma-AldrichS1141
亚精胺Sigma-AldrichS0266
甘油Sigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS 电泳缓冲液Life technologiesNP0001
DMEM（高糖）Sigma-AldrichD0822使用前于 37 °C 预热 
胰蛋白酶-EDTA（0.05% 酚红）Life technologies25300-054
血清GE healthcare life sciences PAA A15-102每批血清在使用前均需针对您的细胞进行测试。
青霉素和链霉素 Life technologies15140-122
台盼蓝溶液，0.4%Life technologies15250-061
水（无菌过滤）Sigma-AldrichW3500
抗体
来自大鼠的 HA（12CA5）Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758用于 Western 印迹
MyoDSanta CruzSC-760用于免疫共沉淀和 Western 印迹
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Cell Signaling Technology8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
微管蛋白Sigma-AldrichT9026
肌动蛋白Sigma-AldrichA5441
小鼠 IgGSanta CruzSC-2025
兔 IgGSanta CruzSC-2027
山羊抗大鼠-HRPSigma-AldrichA9037
山羊抗兔-HRPSigma-AldrichA6154 
山羊抗小鼠-HRPSigma-AldrichA4416

参考文献

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