兔眼视网膜下手术的逐步操作方案

摘要

视网膜色素上皮（RPE）替代策略和基于基因的治疗已被考虑用于多种视网膜变性疾病。在临床转化过程中，需要使用大型眼动物模型来研究适用于患者的手术技术。本文介绍了一种用于视网膜下手术的兔模型，该模型专为RPE移植设计，具有多功能性和成本效益。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性以及其他与视网膜色素上皮（RPE）相关的疾病是工业发达国家成年人不可逆视力丧失的最常见原因。RPE移植似乎是一种有前景的治疗方法，因为它可以替代功能异常的RPE，恢复其功能，从而改善视力。

本文描述了一种将体外培养的视网膜色素上皮（RPE）单层细胞接种于支架后移植至兔视网膜下腔（SRS）的方法。在完成玻璃体切除术后，使用自制推送装置将异种移植物经20G金属喷嘴送入视网膜下腔，该装置配备聚四氟乙烯（PTFE）涂层推杆。该技术在6年期间历经150余例兔眼手术不断优化而成。术后可采用无创、可重复的方法进行随访观察 体内 成像，如谱域光学相干断层扫描（SD-OCT），随后进行灌注固定组织学检查。

该方法具有明确的步骤，便于学习且成功率高。兔子被视为一种大眼动物模型，在临床前研究向临床应用转化中具有实用价值。在此背景下，兔子是一种经济高效且可能更为便捷的其他大眼动物模型替代方案。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是工业发达国家中50岁及以上成年人视力受损的最常见原因，因其可导致中心视力丧失。约15%的此类患者患有 "湿润" 一种疾病形式，其中新生血管从脉络膜起源并破坏视网膜功能¹该变异可通过玻璃体内重复注射抗血管生成药物进行高效治疗²然而，绝大多数患者（约85%）患有干性型，其特征是细胞外沉积物（例如，视网膜色素上皮（RPE）下方的沉积物（如玻璃膜疣）。这些沉积物导致RPE功能障碍，进而引起黄斑区视网膜萎缩。由于目前尚无任何可治愈的治疗手段，年龄相关性黄斑变性（AMD）已成为一个快速发展的研究领域，多种不同的治愈性治疗方法正在接受测试。手术性RPE替代是战胜这一致残性疾病的一个有前景的未来选择。³.

自体视网膜下色素上皮细胞移植可替代黄斑区功能障碍或缺失的色素上皮细胞，并有望恢复其生理功能^4-9该手术技术随着人胚胎干细胞（hESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）向视网膜色素上皮（RPE）分化的技术方案的建立而取得突破，为科学家提供了可用于移植的无限RPE细胞来源¹⁰视网膜色素上皮（RPE）移植目前被认为是一种极具前景的干细胞来源治疗产品的首次人体应用。眼部具有良好的手术通路和精密的 体内 监测工具^11-13.

移植视网膜色素上皮（RPE）的一种方法是采用细胞悬液进行微创递送；或者，为了更好地保留RPE的特性并维持移植后的功能，目前正在考虑使用人工载体基质（支架）进行RPE替代^4,14,15。在临床前验证中需要使用大型动物模型，但迄今为止，有关动物操作和手术技术的详细技术信息仍然缺乏^16-23。

我们及其他研究者^11,24（尽管存在一些相反的证据²⁵）建议使用一种刚性 yet 具有弹性的载体基质，因其可提供更安全的操作性，并维持单层细胞的完整性与功能。多年来，我们测试了多种自行设计的器械及辅助技术，用于将细胞载体支撑的视网膜色素上皮（RPE）移植物植入视网膜下腔（SRS）。我们通过术中视频记录、体内扫描激光检眼镜结合谱域光学相干断层成像（SLO/SD-OCT）以及组织学方法，评估了移植效果^14,26,27。本文提供了我们在兔模型中进行视网膜下RPE植入的当前推荐方案，该方案已在5种不同的兔品系、7种细胞载体材料和4种RPE细胞来源中进行了超过150次手术的验证。

方案

眼科研究中动物操作的伦理规范：本研究已获得波恩大学医学院伦理委员会的批准，并遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）所规定的指南。此外，所有实验程序均经北莱茵-威斯特法伦州的州级监管机构批准。动物饲养于室内专用设施中，房间配备空调，温度控制在18 - 20 °C，接受正常昼夜光照，饲养在标准化的独立笼具中，可自由获取食物和水。

注意：为确保实验动物的健康状况，需遵循动物健康评分表，其中包括以下明确的动物排除标准：与入院时体重相比体重减轻20%；动物出现明显发绀；动物发抖、抽搐或无法协调运动；共济失调/感觉异常，例如，瘫痪；精神萎靡；严重的自残行为（皮肤伤口、肢体断裂）。

1. 仪器灭菌

1. 将可重复使用的器械放入超声波清洗机中。
2. 加入 500 ml 蒸馏水和 2 ml 器械消毒剂。
3. 使用扫频功能清洗器械，持续 15 分钟。
4. 从超声波清洗机中取出器械，并用蒸馏水彻底冲洗 5 分钟。
5. 将器械放入高压灭菌器中，使用标准程序（在 121 ºC 下对器械灭菌 20 分钟）。

2. 仪器准备

1. 通过在封闭房间内操作、穿着手术刷手服、佩戴口罩和头套来建立并维持无菌区域。佩戴无菌外科手套前需对手部进行消毒。具体操作方法参见²⁸。
2. 将已灭菌的器械放置于无菌铺巾上。
3. 在铺巾上放置一支装有40 mg曲安奈德并连接27 G针头用于注射的1 ml注射器、一支含平衡盐溶液（BSS）的10 ml注射器，以及一支5 ml润滑剂注射器。
4. 在铺巾上放置3-0丝线、7-0薇乔线、眼科止血棒（用于控制结膜/巩膜出血）、扭绞纱布海绵、伤口闭合贴（用于固定玻璃体切割头管路）以及吊灯式内照明光纤导线。
5. 用无菌技术打开25 G吊灯式内照明器包装，并使用无菌技术将其连接至光源设备（参见步骤2.1）。使用无菌技术将玻璃体切割装置（包括高速玻璃体切割头和文丘里负压盒）连接至玻璃体切割机（参见步骤2.1）。
6. 打开500 ml BSS瓶，按照制造商说明将液体连接至文丘里负压盒。

3. 麻醉准备与动物体位摆放

1. 称量动物体重，以确保给药剂量准确。
2. 准备肌内注射（IM）麻醉剂：使用一支带有27 G针头的注射器，加入0.35 mg/kg的氯胺酮和0.25 mg/kg的美托咪啶作为起始剂量。翻转注射器以混匀药液。
3. 另准备两支注射器，每支含有初始剂量的1/3，用于术中维持麻醉。
4. 准备一支含有20 ml 5%葡萄糖溶液的注射器，并装配18 G针头，用于皮下注射，作为静脉输液的替代方案。
5. 玻璃体切除术前，给予散瞳眼药水，每次1滴，共3次，以实现瞳孔扩张。
6. 麻醉注射前，用毯子覆盖兔子以使其镇静，随后在后肢（臀肌）注射，并在注射部位周围按摩30秒。
   注意：首次肌内麻醉作用持续时间约为1–2小时，具体时长取决于兔子的体型、药物耐受性、脂肪层厚度、应激状态及体温。麻醉开始减退的首个征象为眼球震颤（需由术者密切监测），后续追加注射可维持约30–45分钟。
7. 通过确认动物处于催眠状态、反射减弱、无痛感及肌肉松弛，以判断麻醉效果是否充分。
8. 待兔子意识丧失后，在颈部皮肤皱褶处进行皮下注射（见第3.3节）。
9. 每5–10分钟向手术眼滴加甲基纤维素润滑剂；非手术眼则需滴加润滑剂并用胶带固定眼睑。
10. 将覆盖好的兔子置于手术台上，台面铺有棉毯等覆盖物，调整至最佳体位（通过毯子塑形使鼻部略抬高，与眼球表面齐平），并在手术显微镜下使眼球与物镜垂直对齐。
11. 使用直肠温度计监测核心体温，确保其处于正常范围（39 ± 1 ºC）²⁹。
12. 使用剪刀剪除眼睫毛（刀片上可涂抹少许药膏），以减少术后感染风险。
13. 采用0.1 g/ml聚维酮碘溶液滴眼2–3滴，局部作用1分钟进行眼部消毒，随后用无菌BSS冲洗。
14. 用无菌洞巾覆盖眼部，其中央预切开口对准眼睛，再覆盖12 × 17 cm的（粘性）手术切口巾。

4. 玻璃体切除术

1. 使用倒持镊子以3-0丝线固定并保护眼球，然后行结膜环切术。
   1. 用Vannas剪刀在靠近角膜缘但距离血管约1毫米处切开结膜。
   2. 通过切开结膜进行分离 "T形切口"首先，用剪刀平行于角膜缘扩大结膜切口，然后垂直剪开结膜，形成一个 "T" 约6-7毫米。钝性小心分离结膜。
2. 使用23 G微型玻璃体视网膜（MVR）刀，在右眼（OD）8点钟位置（左眼OS为4点钟位置）行巩膜切口，将刀尖朝向视神经方向小心插入。随后沿相同方向缓慢退出刀具，避免扩大巩膜切口。
3. 植入并缝合定制侧端输注套管²⁷ 使用7-0丝线缝合，并将眼内压（IOP）设定为24 mmHg。
4. 在右眼2点钟位置（左眼10点钟位置）使用25 G平头套管针进行巩膜切口，步骤与4.2类似。
5. 将25 G吊灯式光源插入平头套管针，用胶带固定，并打开光源 约 30%.
6. 必要时，使用#20手术刀去除水肿的角膜上皮，以改善眼内结构的可视化。
7. 在右眼10点钟位置（左眼2点钟位置）进行巩膜切口，操作步骤与4.2步类似，预置或放置U形7-0缝线环绕切口但暂不打结，随后插入玻璃体切割头。
8. 开始玻璃体切除术³⁰ 在入口处周围，然后继续越过视盘和髓状纤维，使用高速玻璃体切割器，以最大2,000 - 3,000次/分钟的切割速率将玻璃体切割成小块，同时以最大200 mmHg的负压进行抽吸，采用上述玻璃体切除机的参数设置（表1)
9. 通过将高速玻璃体切割头置于视盘后极部上方，并（如可行则轻柔地）在视盘上方进行操作，使玻璃体与视网膜分离，完成后部玻璃体脱离（PVD）³¹ 仅在不超过 200 mmHg 的负压下抽吸，不得切割。
10. 注射 约 50 µl（20 mg）曲安奈德或稀释的荧光素约 0.1 mg/ml）玻璃体内注射以可视化并辅助（接近完全）切除玻璃体切除术中位于后极部和中周部的游离玻璃体。避免在晶状体下方穿行。若需气体填充，建议由（熟练）助手进行巩膜压陷以切除周边玻璃体。
11. 在步骤4.10期间或之后，将20单位/毫升肝素和0.5毫克肾上腺素加入BSS灌注液中，使肾上腺素终浓度为0.001毫克/毫升。
    注意：由于肝素/肾上腺素未进行眼内注射，其作用效果取决于输注流速，因而出现延迟。

5. 加载射击器

注意：本文所述工作不符合《赫尔辛基宣言》的原则；未涉及人类患者。此处，标准的视网膜色素上皮（RPE）细胞是从人胎儿眼球中分离获得，并根据我们先前发表的方案¹⁴，在未包被的10 µm厚聚酯（PET）插入式培养小室中进行培养和分化。使用人胎儿组织的许可已由波恩大学伦理委员会批准。 alternatively，hES-RPE细胞由Skottman实验室提供（论文在准备中），这些细胞按照Vaajasaari et al.³²描述的技术进行培养；对于这些细胞，已获得德国柏林R. Koch研究所的许可。

1. 在制备植入物之前，用眼科级BSS冲洗细胞培养物3次。
2. 用10 ml眼科级BSS填充标准细胞培养皿（100 × 20 mm）。
3. 将细胞培养小室放入BSS中，并在光学显微镜下将培养皿居中。
4. 使用钝头、椭圆形的定制针头切取一个2.4 × 1.1 mm的植入物，以获得一个扁平的豆形基底，具有两条长边和两条圆边。
5. 通过第二个端口用BSS轻轻冲洗针头，将植入物冲入盛有BSS的定制装载站中图1).
6. 可选择性地将植入物的一端圆形部分剪切<0.5 mm），仅用于获得第三条边。
7. 确保植入物方向正确，使单层细胞位于细胞载体的上方。如需调整位置，应小心使用两把手术刀。
8. 使用持针器将植入物轻轻且完全推入推进器装置内，直至整个植入物完全固定于装置尖端内部。此时推进器的推杆应保持回缩状态。
9. 保持 "已加载" 在植入前，将推注头置于BSS下的装填站中。

6. 植入

1. 使用连接至气密注射器的可伸展41G视网膜下注射针接近神经视网膜（确保管路中的所有气泡均已排出！）。
2. 向视网膜下注射平衡盐溶液（含钙和镁/CM），从而形成直径约为2–3个视盘直径（DD）的视网膜下隆起性脱离（bRD）。每只眼安全地建立两个bRD。
3. 使用垂直23G玻璃体视网膜剪将视网膜切开扩大至1.5 mm。此时视网膜下腔已可进入，便于植入或进一步操作。
4. 使用1.4 mm切口刀精确扩大巩膜切口，至20G入路尺寸。
5. 尝试使用20G装载器模拟头通过巩膜切口，必要时扩大切口，以确保装载后的植入器能够顺畅且紧密地通过。
6. 在理想眼内压为24 mmHg时，将装载好的植入器²⁷经巩膜切口送入。
7. 接近视网膜切口边缘，从视网膜表面位置将植入物释放至视网膜下腔。
8. 使用半闭合的23G剪刀、镊子或41G针调整植入物位置，确保其良好地位于视网膜下方，并与视网膜切口保持适当距离。

7. 结束操作

1. 移除25G吊灯式灌注套管。
2. 缝合所有巩膜切口。
3. 通过8点钟方向的巩膜切口（在缝合最后一个巩膜切口之前）注射25 µl（10 mg）曲安奈德。
4. 通过触诊检查并调整眼内压，必要时使用30G针头/注射器注入BSS。
5. 使用7-0薇乔线缝合结膜。
6. 缓慢移除用于眼球牵引的3-0丝线吊带（避免损伤深部眶静脉丛！）。
7. 在眼睑下方涂抹地塞米松/抗生素眼膏。
8. 术后体位：用毯子覆盖，保持手术眼朝上（无气体时）或朝下（使用空气/气体时），持续1小时。
9. 在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看护。
10. 在麻醉完全消退前不得运输兔子；可通过注射与所用美托咪定等量的逆转剂来加速苏醒过程。

8. 术后动物护理

1. 将兔子置于适宜的条件下（温度、光照、食物、水、空间， 等等以及在专业机构中进行严密监测。
2. 确保动物充分休息， 即，无需长时间的食物或水剥夺。
3. 检查任何伤口或损伤，尤其是注射部位。
4. 保持伤口干燥以预防感染。怀疑感染时给予抗生素：术后每周两次在眼表涂抹地塞米松1 mg/g、硫酸新霉素3,500 I.U./g、硫酸多粘菌素B 6,000 I.U./g软膏。
5. 术后7天内每日两次涂抹地塞米松/抗生素眼膏，以促进眼表再生并减轻术后疼痛。
6. 在最初48小时内给予全身性镇痛药（卡洛芬，4 mg/kg，每日两次）。
7. 在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
8. 动物在手术后未完全恢复前，不得放回与其他动物同处的环境中。
9. 不要让动物遭受不必要的痛苦。

9. SLO/SD-OCT 引导

1. 准备并注射肌内（IM）麻醉剂：使用一支含有0.175 mg/kg氯胺酮和0.125 mg/kg美托咪啶的1 mL注射器作为起始剂量。翻转注射器以混匀药液。
2. 至少每5分钟添加一次润滑剂，以保持眼球湿润并维持清晰的谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）成像；可选择性使用定制的接触镜。
3. 将钢制平台固定在头托上，以稳定动物所需体位。
4. 将兔置于钢制平台上，使其眼睛与探头垂直。
5. 从下颌骨（mandibula）部位固定兔的头部，避免压迫气管。
6. 将动物头部向SD-OCT探头方向倾斜约45º，以优化对植入物的观察角度。
7. 使用30度镜头进行OCT成像，并采用以下参数设置[HS]：单线扫描采用30度设置，ART模式设为100（平均次数）；体积扫描采用20 × 20度设置，ART模式设为15；无需使用高分辨率模式。
8. 利用SLO红外反射成像定位植入物的焦平面（图2A）；当（所有）植入物边缘清晰锐利时，即达到最佳焦点¹⁴。
9. 操作结束后，在眼睑下方涂抹含地塞米松1 mg/g、硫酸新霉素3,500 I.U./g、硫酸多粘菌素B 6,000 I.U./g的软膏。

结果

所述视网膜下植入方法的结果如表2所示。当进行核心玻璃体切除时，视网膜下的移植成功率为约61%；若诱导产生后玻璃体脱离，则成功率上升至76%。这些数据包括约21%在手术中或术后前3天内死亡的动物。该技术可用于在单眼中同时于不同视网膜区域植入两个支架。

根据 Stanzel et al.²⁷ 所述的方法，对兔子进行术后 体内 随访，采用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）及组织学处理（图2）。图2A 显示的是在未发生并发症的移植术后，种植于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜上的培养视网膜色素上皮（RPE）的扫描激光检眼镜红外反射图像。植入物周围的晕环对应光感受器萎缩区域。图2B 显示相应的SD-OCT图像，可见视网膜尤其是外核层（ONL）变薄，植入物上方SD-OCT上出现高反射带，而邻近植入物的神经视网膜则显示接近正常的反射带。这些结果提示移植过程未造成明显创伤。图2C 为植入物的苏木精/伊红（H/E）染色图像，显示视网膜下瘢痕形成以及视网膜切开部位周围的外核层萎缩，可能由医源性操作引起；在PET膜上可见连续但不规则的色素层。植入物下方的布鲁赫膜也表现为连续状态，脉络膜毛细血管中含有少量散在的红细胞。这些形态学结果与SD-OCT表现一致，进一步支持了无创性递送的结论。

图1： 将培养在PET细胞载体上的人iPSC-RPE装载入注射装置。A) 显示使用定制针头打孔获取移植片。 B) 从细胞培养物中切割出的豆形移植片。 C) 装载前移植片的定位。 D) 将移植片装入注射装置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2： 人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hES-RPE）在兔视网膜下腔培养 4 周后于 PET 细胞载体上的情况。A) 显示 SLO 红外反射图像，绿色线条标示出 图 2B 中所示横截面的位置。B) 对应的谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）图像。C) H/E 染色图像，详见正文或^26,27。请点击此处查看该图的放大版本。

参数	使用设置
玻璃体切除术	6,000 次/分钟
负压	200 mmHg
上升时间	1 秒
空气	24 mmHg
灌注	24 cmH2O
电凝	30%

表1：玻璃体切除机的参数设置。

玻璃体切除术	植入物	手术兔数量	植入成功	植入失败	死亡	成功率%
核心玻璃体切除术	PET	30	19	4	7	63.33
	PET + RPE	70	42	12	16	60
后玻璃体脱离，联合或不联合纤溶酶的玻璃体切除术	PET	28	21	2	5	75
	PET + RPE	22	17	2	3	77.27

表2：最近150例手术的总结，包括手术方法和植入物类型。

讨论

采用兔模型，本文介绍了一种安全且可重复的方法，通过定制设计的推送装置，将培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞及其载体经玻璃体腔递送至视网膜下腔。所述方法提供了一种简短且优化的手术技术，易于学习，因其涉及玻璃体切除术中的标准操作及视网膜下操作步骤。手术效果得益于清晰的玻璃体-视网膜界面，以及避免在植入部位产生液体湍流的眼内灌注；在低眼压下诱导形成水泡样视网膜脱离（bRD），防止因干燥导致的视网膜和巩膜损伤，并确保兔体位的恰当摆放。

然而，我们提醒注意，术中可能出现多种并发症，随时可能影响植入手术的成功，例如眼内出血、在植入等关键步骤期间麻醉效果减退、因器械操作或眼球低眼压导致的bRD塌陷、因麻醉剂量过大导致的兔死亡、长时间手术期间低血压引发的脑缺氧损伤，或高热。然而，随着手术团队经验的积累，这些并发症的发生率会随着时间推移而逐渐减少，且能够被迅速发现并妥善处理。

遵循一些简单但至关重要的步骤，可减少部分并发症。手术过程中应每隔5至10分钟添加润滑剂，以防止角膜、巩膜和结膜损伤，并维持清晰的眼内介质；干燥或变黑的巩膜可能导致切口裂开，进而引发眼球低眼压和/或巩膜切口术中渗漏。应加入肝素以防止纤维蛋白膜形成，该膜会显著增加视网膜下植入的难度；同时加入肾上腺素以减少肝素使用期间的出血¹⁶。应避免过长的肝素/肾上腺素暴露时间（>1小时），以防内皮失代偿导致角膜水肿³³、高血压危象或术中死亡。在器械（进入）端口处应彻底清除玻璃体，以避免视网膜和/或脉络膜脱离。眼内器械应指向眼球后极部，以避免接触晶状体（导致医源性白内障形成）或损伤进入部位的视网膜。应使用眼内侧端灌注导管，因其可减弱植入区域周围的射流，从而防止视网膜切开处不受控制的撕裂以及bRD塌陷。应避免在中线（视神经垂直轴）或靠近视神经髓质纤维处诱导bRD，以防止广泛的医源性视网膜脱离。最后但同样重要的是，应在低眼内压下诱导bRD，避免因使用过高的灌注流速注入视网膜下BSS而导致视网膜损伤（例如，因牵拉所致）。

多种研究变量，如细胞载体变体、源自胎儿、成人或干细胞的视网膜色素上皮（RPE）细胞来源、免疫抑制剂的选择， 等等，可以进行探索 ^14,26,27,34进一步改进，如无血清RPE培养方法、异种RPE在视网膜下腔的表征、宿主RPE层的去除¹⁴ 或关于种植体支抗的策略目前正处于研究阶段。

迄今为止，所述技术已应用于5种不同的兔品系，包括青紫蓝兔、青紫蓝兔/KBL杂交兔、新西兰白兔/红十字兔、新西兰白兔（白化）和荷兰带纹兔。手术对象包括雄性和雌性兔子，体重至少达1.5 kg或年龄满2个月（视品种而定）。大多数手术在有色毛发的兔子（青紫蓝兔或青紫蓝兔杂交兔）上进行，体重范围为2.5–3 kg。

我们有机会接触的所有兔品系似乎都具有一些特殊性。鉴于2009至2013年间德国仅有杂交青紫蓝兔（chinchilla bastard）这一有色兔品系可供使用，我们对该品系动物积累了最丰富的经验。遗憾的是，该品系目前已不再供应，因其繁育工作已被终止。除巩膜较厚、眼内容积较大等更有利的特征外，该品系与新西兰白兔/红十字兔相比并无明显差异。杂交青紫蓝兔在术中易出现明显的纤维蛋白形成，因此需按上文所述使用肝素/肾上腺素，以确保顺利实施视网膜下操作。本方案亦已在非色素性白化兔（新西兰白兔）中实施，但由于对比度较低，特别是在布鲁赫膜破裂（bRD）创建及视网膜下植入过程中更具挑战性。据我们观察，诱导后部玻璃体脱离的可行性似乎不依赖于兔品系。

经玻璃体的视网膜下递送可能是未来首选的手术策略，因为目前临床上进入视网膜最常用的途径即为此法。因此，许多其他研究团队已在动物实验中报道了此类技术，用于递送载体支撑的培养RPE细胞^11,15,23,35。Aramant 等.³⁶开发了一种器械，可将水凝胶包裹的柔软植入物精确放置而非推入视网膜下目标位置。Thumann 等.的设计则采用一种中空铲状器械，通过液体注射使载体支撑的移植物漂浮释放¹⁹。前述两种策略均需将器械插入视网膜下，而我们认为，与视网膜表面贴附的器械相比，这种方法更容易引发并发症。Montezuma 等.²²曾描述一种用于在猪眼中递送视网膜下芯片植入物的视网膜下植入器械，但据我们所知，此后未见进一步的研究报道。我们已在原有技术基础上稍作改进，并成功将其应用于猪模型。

我们首选的细胞载体是厚度为10微米的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜。从外科手术的角度来看，这种材料具有理想的刚性和弹性参数，并且在细胞培养实验中具有广泛的适用性。我们发现，膨体聚四氟乙烯（ePTFE）³⁷、由PET、聚乳酸/己内酯共聚物（PLCL）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）通过静电纺丝制成的纳米纤维膜，以及复合纳米纤维（PLGA或PET）和超薄PET膜²⁶也具有类似的效果。当PET膜与我们的金属推送装置联合使用时，偶尔会表现出静电荷倾向，这会影响其从推送装置中的顺利释放²⁷。在我们手中，超薄聚酰亚胺膜无法采用上述方案植入视网膜下腔（论文待发表）。

Marmor 等 对医源性局限性视网膜脱离中视网膜下液的自发性吸收进行了系统研究^38-41。即使在视网膜下腔操作后，若手术过程顺利，这些液体通常在术后第4天即被完全重吸收。激光视网膜固定术不用于封闭视网膜切开边缘。尽管这与人类手术中的做法看似相反，但无需进行空气/气体填充支撑。除非能够彻底清除周边部玻璃体（尤其是上象限），否则实际上可能导致视网膜切开部位发生巨大视网膜裂孔。仅在术中发生医源性视网膜脱离需要挽救，或需要固定特定植入物位置时，才建议进行液体-空气交换，随后使用20% SF6气体进行填充支撑。

尽管机械性诱导的视网膜神经层剥离可能在兔模型中引起视网膜色素上皮（RPE）和光感受器的损伤^42,43，但其损伤程度差异较大（即使使用常规BSS），并受眼内压（IOP）、所用注射器类型、注射体积导致的视网膜牵拉等因素影响。etc。我们还测试了常被推荐的无钙镁BSS辅助剥离方法^42–44，但发现其可导致术中晶状体混浊（尤其在温度升高时），并显著延迟甚至损害视网膜复位²⁷。因此建议使用100 µl注射器缓慢向视网膜下腔注射20–30 µl常规BSS；注射针头移动应尽量减少，以使视网膜切口在其周围封闭，防止布鲁赫膜受损。部分医源性损伤可通过RPE的伤口愈合过程得以修复，且复位后外核层（ONL）厚度相对保留的现象表明，RPE/光感受器复合体能够耐受此类损伤，这与其他研究者的描述一致⁴⁵。

基于细胞的治疗或视网膜假体在获得监管批准并开展人体安全性研究之前，需要进行临床前动物试验。不同国家对此类试验的要求各不相同。本文所述的兔模型可作为一种成本较低且操作难度较小的平台，用于建立甚至完成监管机构所要求的全部试验内容。此外，该模型还可用于多中心临床试验中外科医生的技术培训，或在研究过程中进一步优化相关技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
s30 超声波清洗仪	Elmasonic	100 4631	2.75 L
DE-23  高压灭菌器	Systec	C 2209	23 L
注射器	BD	300013 300995  301285 300294 300330	1 ml ×3 2 ml ×3 5 ml ×1 10 ml ×1 20 ml ×1
针头	BD	305196 305136	18 G ×1  27 G ×5
手术刀	Feather	2975#20	刀片#20 ×3
手术巾	HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER	277 502 25 440	60 × 40 cm ×2 12 × 17 cm
眼用棉签	LOHMANN & RAUSCHER	16 516	66 × 5 mm
扭绞纱布海绵	HARTMANN	481 274	×2
闭合胶带	HARTMANN	540 686	×4
Opmi Visu CS 显微镜	Zeiss	N/a	含眼底成像系统 BIOM II
吊灯式眼内照明器	Geuder	G-S03503 + G-S03504	25 G，含套管针
光源机	Geuder	G-26033	Xenotron III
玻璃体切除仪	Geuder	G-60000	MegaTRON S4 S4/ HPS
玻璃体切割头	Geuder	G-46301	MACH2 玻璃体切割器 23 G
Venturi 吸液盒	Geuder	G-60700
侧口灌注套管	Geuder	custom	23 G ×1
3-0 丝线缝合线	ETHICON	V546G	×1
卡尺	Geuder	G-19135	×2
Vannas 剪刀	Geuder	G-19777	×1
巩膜切开刀	Ziemer	21-2301	1× 23 G 1× 20 G
7-0 丝线缝合线	ETHICON	EH6162H	×1
持针器	Geuder	G-32320	×2
虹膜镊	Geuder	G-18910	×1
Colibri 镊子	Geuder	G-18950	×1
可伸展式视网膜下注射针	DORC	1270.EXT	41 G
VR 剪刀	Geuder	G-36542	25 G
Grieshaber 镊子手柄	Alcon	712.00.41	23 G
弯头剪刀镊尖	Alcon	723.52	23 G
植入物装载站	Dow Corning	3097358-1004	SYLGARD 184 硅胶弹性体套件
钝头椭圆形植入物环钻	Geuder	custom-made	2.4 × 1.1 mm
植入物推注模拟器	Geuder	G-32227	×1
植入物推注器	Geuder	G-S03443	×1
抽吸针	DORC	1281.SD	20 G（真空）
手动微量注射器	Hamilton	24535	100 µl
组织培养皿	Greiner bio-one	664160	100 × 20 mm
Spectralis 多模态 成像系统	Heidelberg Engineering	N/a	Spectralis HRA  + OCT
药品与溶液
名称	公司	活性成分	备注
Mucadont-IS	Merz Hygiene	杀病毒性器械消毒剂	2 L
Mucocit T	Merz Hygiene	无醛器械消毒剂	2 L
氯胺酮 10%	WDT	氯胺酮	10 ml (100 mg/ml)
Domitor	Orion Pharma	盐酸美托咪啶	10 ml (1 mg/ml)
Antisedan	Orion Pharma	盐酸阿替美唑	10 ml (5 mg/ml)
Neosynephrin POS 10%	URSAPHARM	盐酸去氧肾上腺素	10 ml
Mydriacyl	Alcon	托吡卡胺	10 ml (5 mg/ml)
Methocel 2%	Omni Vision	羟丙基甲基纤维素	10 g
PURI CLEAR	ZEISS	平衡盐溶液 (BSS)	500 ml
葡萄糖 5%	B.Braun	5%  葡萄糖溶液	100 ml
Heparin-Natrium-25,000	Ratiopharm	肝素	5 ml (2,500 单位/ml)
Suprarenin	SANOFI	肾上腺素	1 ml (1 mg/ml)
曲安奈德	波恩大学药房	无防腐剂曲安奈德	1 ml (40 mg/ml)
Isoptomax 眼膏	Alcon	地塞米松 1 mg/g 硫酸新霉素 3,500 IU/g 硫酸多粘菌素 B 6,000 IU/g	10 ml
Betaisodona	Mundipharma	聚维酮碘	30 ml (1 g/10 ml)
Optive	ALLERGAN	羧甲基纤维素钠甘油	10 ml