本文介绍了一种利用miRNA检测乳腺癌患者样本中miRNA表达水平的实验方案 原位 杂交。
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摘要
摘要
本文详细描述了一种利用miRNA检测乳腺癌组织的实验方案 原位 使用地高辛标记的锁核酸（LNA，Locked Nucleic Acid）探针进行杂交。该探针由抗地高辛碱性磷酸酶抗体识别，随后通过碱性磷酸酶底物显色产生荧光信号。本研究中采用了miRNA 原位 杂交（MISH）技术分析乳腺癌患者组织中miR-489的表达。该技术可检测目标miRNA在单个组织样本中的定位情况，可用于比较目标miRNA在肿瘤组织与邻近正常组织中的表达水平，并鉴定表达该miRNA的特定结构。该技术在回答某些临床科学问题方面具有重要价值，例如特定miRNA在癌症发生过程中的作用。我们的结果表明，乳腺上皮细胞中miR-489的表达水平显著高于邻近的肿瘤细胞。
引言
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年报告的乳腺癌病例超过130万例1,2。尽管传统上认为肿瘤细胞在生物学上是同质的且高度增殖，但现已明确乳腺癌在遗传学和临床上均具有异质性。对常用抗癌药物的耐药性是晚期乳腺癌的显著特征，这种耐药性促进了癌症的进展和远处转移，导致大多数患者死亡3。
microRNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的小分子RNA，通过阻断mRNA翻译或介导mRNA降解来调控基因表达4。迄今为止，已在人类中鉴定出2000多种不同的miRNA，这些miRNA与人类疾病相关5。越来越多的研究表明，miRNA可作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用，并且在肿瘤中常常出现表达失调6。miRNA通过调控细胞周期进程、衰老、凋亡和自噬的关键调节因子，以及肿瘤细胞的运动性、侵袭和转移相关因子，对主要的肿瘤发生过程产生强烈影响7。
异常的miRNA表达也与临床意义相关，例如肿瘤分期、分化程度、预后以及对辅助治疗的反应8特别是，miR-146 表达水平升高与肺癌患者的不良预后相关。9另一项研究表明，miRNA-let7b 表达的缺失与恶性表型相关，并因此导致较差的生存预后。6理解表达miRNA的细胞类型和结构是阐明miRNA表达改变如何影响细胞和组织表型机制的重要组成部分10某些在基质细胞中分泌的miRNA可被上皮细胞摄取，并特异性作用于其靶标。同样，miR-212和miR-132由基质细胞分泌，调控乳腺发育过程中导管向外生长所必需的上皮-基质相互作用11本文的总体目标是通过miRNA技术，阐述一种在乳腺癌组织中检测miRNA表达的详细实验方案。 原位 杂交。我们已优化所有条件，用于检测乳腺癌患者样本中miRNA-489的表达水平。为此，实验中采用了地高辛（DIG）标记的锁核酸（locked nucleic acid, LNA）探针。该探针的部分核苷酸经过LNA修饰，即核糖骨架的2'氧原子与4'碳原子之间通过亚甲基桥连接，从而使核苷酸构象固定，保持其稳定状态 "固定到位" 杂交后，杂交复合物更难以发生变性12,13.
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方案
本研究获得了全南大学和顺医院和南卡罗来纳大学机构审查委员会的批准。乳腺癌及配对的相邻正常乳腺组织的组织微阵列样本由全南大学和顺医院生物样本库提供，该样本库是韩国生物样本库网络的成员。
1. 溶液配制
- 准备1 L无DNase和RNase的水。所有化学溶液均使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水配制。取1 L水加入500 µl DEPC，室温孵育3小时，随后将水进行高压灭菌以灭活DEPC。
注意：DEPC为已知致癌物，切勿吸入。 - 使用DEPC处理过的水将10x PBS稀释配制成1x PBS。
- 使用DEPC处理过的水配制20x SSC（将175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠溶解于800 ml水中，用几滴14 N HCl溶液调节pH至7.0，再加水定容至1 L）、4%多聚甲醛、95%乙醇和80%乙醇。
- 在590 ml DEPC处理过的水中加入8 ml三乙醇胺和1.05 ml HCl，再加入1.5 ml乙酸酐用于乙酰化处理。
- 在缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，用DEPC处理过的水配制）中配制50 µg/µl的蛋白酶K溶液。
- 配制杂交缓冲液：包含500 µl甲酰胺、250 µl 20x SSC、100 µl 50x Denhardt's溶液、12.5 µl t-RNA、2.5 µl鲱鱼精子DNA、30 µl RVC、0.02 g封闭剂以及50 µl DEPC水。现配现用。
2. 乳腺组织切片
- 使用切片机切割5 µm厚的甲醛固定石蜡包埋切片，并将切片贴附于带电荷的载玻片上14。
注意：本实验所用乳腺组织先前由韩国生物样本库网络制备。
3. 组织制备
- 将切片浸入新鲜二甲苯中，置于 Coplin 染色缸内脱蜡两次，每次 10 分钟，然后将组织切片依次在 ddH2O 配制的递减浓度乙醇（100%、95% 和 80%）中各孵育 5 分钟进行水化。此步骤应在通风橱中进行。
- 将组织浸入 DEPC 处理的水中 5 分钟。此时使用疏水屏障笔在组织切片周围画出边界。
- 用 4% 多聚甲醛（PFA）固定组织 15 分钟，随后用 PBS 洗涤。
- 将组织浸入含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液中 10 分钟，随后用 PBS 洗涤。
- 在 37 °C 下用 50 µg/µl 蛋白酶 K 溶液孵育样本 15 分钟，然后在室温下用三乙醇胺和乙酸酐处理组织切片 5 分钟，随后用 PBS 洗涤。蛋白酶 K 处理与三乙醇胺/乙酸酐处理之间无需 PBS 洗涤。
4. 杂交
- 彻底清洗组织，并将组织切片在室温下用杂交缓冲液孵育2至3小时。通常120 µl杂交缓冲液足以覆盖组织切片。
- 将5'-DIG标记的LNA探针用120 µl杂交溶液稀释至终浓度为3 pM。由于探针原液浓度通常为40 ng/µl，可取3 µl原液加入120 µl杂交缓冲液中，混合物于95 °C孵育5分钟。
- 将组织切片在湿盒中于54 °C（Tm）过夜孵育。通常120 µl即可覆盖一个切片。使用两张湿润的纸巾以维持湿盒内湿度。湿盒的理想尺寸为10英寸×8英寸。
- 注意：不同miRNA的Tm值可能不同。54 °C是针对miR-489给出的温度。
5. 严谨性洗涤
- 用 5x SSC 清洗组织 7 分钟（杂交步骤后，不再需要 RNase 无污染条件）。
- 在 57 °C 下，用 1x SSC 清洗组织切片，每次 7 分钟，重复两次。
- 在 57 °C 下，用 0.2x SSC 清洗组织切片 7 分钟。
- 在室温下，用 0.2x SSC 清洗组织切片 7 分钟。
- 将组织切片在 PBS 中孵育 10 分钟。
6. 封闭
- 在湿盒中，室温下用封闭缓冲液孵育组织切片1小时（配制封闭缓冲液：将2 ml FBS、10 µl Tween-20和3 µl BSA加入18 ml PBS中。将封闭缓冲液储存于4 °C）。
7. 一抗孵育与显色
- 将抗DIG-AP抗体用封闭缓冲液按1:300稀释，4 °C下与组织切片孵育过夜。
- 用洗涤缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟（缓冲液由显色试剂盒提供）。
- 使用商品化的碱性磷酸酶显色试剂盒对组织切片进行显色，该试剂盒可产生CY-3荧光信号。
- 用洗涤缓冲液洗涤切片5分钟。加入100 µl浓度为2.5 ng/µl的Hoechst染料染色5分钟，随后用洗涤缓冲液再洗涤5分钟。
- 按照制造商说明书使用封片缓冲液封片，每张组织切片使用15 µl，用擦镜纸擦去多余的封片液，并用透明指甲油封固载玻片以防止液体泄漏。
- 使用10倍物镜在荧光显微镜下观察切片，总放大倍数为100倍。
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结果
采用人乳腺癌组织检测miRNA-489的表达水平。在两名患者中发现，乳腺导管和上皮细胞中的miRNA-489表达水平显著高于相邻的肿瘤组织（图1A 和 1B）。这明确表明，miRNA-489在肿瘤组织中表达缺失，提示miRNA-489具有肿瘤抑制功能。为进一步验证这些结果，比较了同一患者肿瘤组织与其相邻正常组织的表达情况。如 图2A 和 2B 所示，正常组织中miRNA-489的表达量高于其相邻的肿瘤组织。图像中标注的10 µm表示比例尺。图像使用10X物镜拍摄。
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讨论
本研究的目的是利用miRNA检测乳腺癌组织中miRNA的表达水平 原位 杂交。需要注意的是，本实验中的所有条件均针对乳腺癌组织进行了优化，其他类型的组织可能需要进一步优化条件。所有溶液均须使用DEPC水配制，所有容器均须用DEPC处理过的水冲洗并随后进行高压灭菌。即使轻微的RNase污染也可能干扰实验的最终结果。由于miRNA序列非常短，必须使用LNA探针以促进与靶序列的更好杂交。此外，组织固定后，必须使用无RNase的蛋白酶K进行处理，否则蛋白质可能干扰探针与内源性miRNA的杂交。另外，在将组织切片与探针孵育之前，探针必须加热至95℃ °C 以解开任何二级结构。
孵育过夜后，重要的是使用不同浓度的 SSC 缓冲液，在上述方案中提到的温度下进行洗涤，以减少非特异性结合。为进行荧光显色，需将组织切片与底物孵育至少 1 小时。建议在孵育过程中持续观察切片，以避免过度显色。务必使用试剂盒中提供的封片介质对切片进行封片。
有一个限制因素需要考虑：如果目标 miRNA 在组织中的表达水平较低，则...
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致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助（5R01 CA178386-03）以及南加州大学ASPIRE-1资助项目对HC的支持。我们感谢Vrushab Gowda在手稿撰写过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | 用DEPC水重悬 |
| 鲱鱼精子DNA | Promega | D1815 | |
| Roche封闭剂 | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | 使用前在16.1 RCF下离心，取上清液 |
| miR-489探针 | Exiqon | 38599-01 | |
| 无核酸酶BSA | Roche | 711454 | |
| 一抗-抗DIG抗体 | Roche | 11093274910 | |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma | 1609478 |
参考文献
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重印与许可
