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方法文章

正常小鼠70%部分肝切除术后血管与实质再生的可视化

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DOI：

10.3791/53935

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2016年9月13日

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1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

本文内容

摘要

用于观察血管再生的工具需要对血管树进行对比成像的方法。本视频展示了一种精细的注射技术，可用于实现血管树的最佳对比效果，并阐述了利用µCT及连续组织学切片对所得样本进行详细分析所带来的潜在优势。

摘要

采用改良的硅胶灌注方法以可视化肝血管树。该方法包括通过26 G导管向门静脉或肝静脉进行硅胶化合物的活体（in-vivo）注射。硅胶灌注后，器官被取出并制备用于离体（ex-vivo）微计算机断层扫描（µCT）。硅胶灌注操作在技术上具有挑战性，成功实施该操作要求术者具备丰富的显微外科经验。该操作的难点之一在于确定硅胶化合物合适的灌注速率。硅胶化合物的灌注速率需根据目标血管系统的血流动力学特征来设定。不适当的灌注速率可能导致灌注不完全、血管树的人工扩张或破裂。

血管系统的三维重建基于CT扫描，并使用HepaVision等临床前软件实现。重建血管树的质量直接取决于硅胶灌注的质量。随后，基于血管重建结果计算反映血管生长的血管参数，如总血管体积。通过硅胶对比显示血管树，可在µCT扫描后对样本进行后续组织学处理。样本可进行连续切片、组织学分析和全片扫描，进而基于组织学图像实现血管树的三维重建。这是检测分子事件及其相对于血管树分布的前提条件。这种改良的硅胶注射方法也可用于可视化和重建其他器官的血管系统。该技术有望广泛应用于各种动物模型和疾病模型中血管解剖结构与生长的研究。

引言

肝脏再生通常通过测量肝脏重量和体积的增加以及评估肝细胞增殖率来确定16。然而，肝脏再生不仅包括实质组织的再生，还包括血管再生6。因此，有必要进一步研究血管生长在肝脏再生进程中的作用。可视化肝血管系统对于深入理解血管再生至关重要。目前已有多种间接方法用于研究肝血管再生的分子机制。传统上，主要依赖检测细胞因子（如血管内皮生长因子，VEGF）14、趋化因子及其受体（CXCR4/CXCR7/CXCL12）4来研究血管再生。然而，结合血管系统的三维模型与定量分析，将提供关键的解剖学信息，有助于更深入理解肝实质再生与血管再生之间的重要关系。

为可视化需要对比血管树的肝血管系统，将不透射线的硅橡胶造影剂直接注入小鼠门静脉或肝静脉血管树。硅橡胶聚合后取出器官，将肝脏样本置于CT扫描仪中进行显微计算机断层扫描（µCT）。扫描结果生成体素图像数据 硅胶注射标本的9.

为进行质量控制，首先使用临床前软件对血管系统进行三维可视化。通过设定软组织强度与血管强度之间的阈值来完成分割。利用表面渲染技术对生成的血管掩膜进行可视化。该软件还允许手动确定血管生长的两个参数：最大血管长度和半径。

随后使用一款临床前软件对血管树进行三维重建，并计算供血或引流血管区域13。此外，该软件可自动测定血管生长的某些参数，例如所有可见血管结构的总长度（亦称总边长或总血管体积）。

在未处理小鼠以及接受70%部分肝切除术（PH）的小鼠中进行了硅胶灌注操作。在切除术后不同观察时间点收集肝脏，以利用上述可视化与定量技术分析肝脏血管和实质的再生情况。

本视频的主要目标是：（1）演示实现最佳对比效果所需的精细注射技术；（2）展示利用微计算机断层扫描（µCT）和连续组织学切片对制备出的标本进行详细分析所带来的潜在优势。观看本视频后，读者应能更好地掌握如何将硅胶化合物注射至特定血管系统，以及理解该技术的实用性与应用价值。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得德国图林根州消费者保护局动物健康与动物保护部门的批准。由于门静脉系统与肝静脉系统需分别显像，因此不同血管树的研究需要使用不同的动物。

1. 试剂准备

  1. 肝素-生理盐水溶液
    1. 将 0.1 ml 肝素加入 10 ml 生理盐水中（5 IU/ml）。
  2. 硅胶化合物混合液
    1. 取 2 ml MV-120 加入一个 5 ml 离心管中。加入 3 ml MV 稀释液稀释 MV-120，制成 40% 的溶液。

2. 门静脉系统硅胶灌注

  1. 剖腹手术
    1. 将小鼠放入麻醉诱导室，使用2%异氟烷和0.3 L/min氧气进行麻醉。
    2. 用胶带将麻醉小鼠固定在手术台上，持续吸入2%异氟烷和0.3 L/min氧气。检查小鼠脚趾夹捏回缩反射，若反射消失，则开始手术。
    3. 使用剪刀在腹部做横向切口，皮肤层用剪刀，肌肉层用电凝器。用棉签将肠管移至左侧，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖肠管。
  2. 导管插入
    1. 在显微镜下用显微镊分离门静脉。在肝外门静脉距离其分叉处约1 mm的位置下方放置一根6-0丝线，松扎备用。
    2. 通过阴茎静脉（雄性）或下腔静脉（雌性）注射制备好的肝素-生理盐水溶液，进行全身肝素化，持续5 min。
    3. 将26号（26 G）带针导管插入门静脉，并用夹子固定
  3. 肝素-生理盐水溶液与硅胶化合物灌注
    1. 用5 ml注射器抽取肝素盐水溶液，并打开灌注装置。用肝素盐水溶液完全填充导管，以避免产生气泡。
    2. 连接延长管与导管，并牢固固定。以0.4 ml/min的灌注速率开始肝素-生理盐水灌注。
    3. 结扎预先放置的6-0丝线缝合线，以双重固定导管并阻断脾静脉和肠系膜静脉的血流。在麻醉状态下通过灌注放血处死小鼠。
    4. 在整个灌注过程中使用生理盐水冲洗肝脏，以保持其湿润。
    5. 向 MV-120 管中加入 0.1 ml 固化剂。将肝素-生理盐水注射器更换为硅胶注射器。
    6. 以0.2 ml/min的灌注速率开始硅胶灌注，持续约1分钟，以预填充导管系统并充盈门静脉系统。当表面血管变为蓝色时，停止硅胶灌注。
  4. 采样
    1. 保留肝脏 原位 待硅胶完全聚合，约需15至30分钟。仔细解剖连接肝脏与邻近器官的韧带，以保持肝脏完整。将肝脏取出并置于甲醛中固定。

3. 肝静脉系统硅胶灌注

  1. 按照步骤 2.1 进行开腹手术，并充分暴露手术视野。
  2. 导管插入
    1. 在显微镜下使用显微镊解剖门静脉。在门静脉分叉处约 1 mm 处的肝外门静脉下方放置一根 6-0 丝线缝线，并松松结扎以备后续使用。
    2. 通过阴茎静脉（雄性）或下腔静脉（雌性）注射预先配制的肝素-生理盐水溶液，进行全身肝素化，持续 5 分钟。
    3. 将一根带有针头的 26 G 导管（导管 1）插入门静脉，并用夹子固定。将另一根带有针头的 26 G 导管（导管 2）插入下腔静脉，并用夹子固定。
    4. 使用 6-0 合成单丝不可吸收聚丙烯缝线结扎下腔静脉的分支（包括左、右肾静脉）及其远端。
  3. 肝素-生理盐水溶液和硅胶化合物灌注
    1. 将肝素-生理盐水溶液装入 5 ml 注射器中，并启动灌注装置。用肝素-生理盐水溶液完全填充导管 1，避免产生气泡。将延长管连接至导管 1 并牢固固定。以 0.4 ml/min 的速度开始肝素-生理盐水灌注。
    2. 结扎预先放置的 6-0 丝线缝线，以双重固定导管并阻断来自脾静脉和肠系膜静脉的血流。在麻醉状态下通过灌注放血处死小鼠。
    3. 在整个灌注过程中用生理盐水冲洗肝脏，以保持其湿润。向 MV-120 管中加入 0.1 ml 固化剂。将肝素-生理盐水注射器更换为硅胶注射器。
    4. 在肝上段下腔静脉处放置夹子，以阻断肝脏的流出道。
    5. 将延长管连接至导管 2，并以 0.2 ml/min 的灌注速率开始硅胶灌注，持续约 2 分钟，以达到文献报道的目标肝血管容积。当肝脏表面血管变为蓝色时，停止硅胶灌注。
  4. 取样
    1. 解剖肝韧带时避免对肝脏造成任何损伤。取出肝脏并置于福尔马林中固定。

4. 微型计算机断层扫描（µCT）

使用µCT扫描移植后的肝脏样本，需要执行以下步骤。

  1. 将肝组织样本从固定液中取出，放置于µCT样品床上，再将载有肝组织样本的µCT样品床放入µCT设备中。
  2. 扫描前获取定位像。小肝样本使用一次子扫描，大样本使用两次子扫描。
  3. 选择一种高分辨率的 µCT 协议（例如，HQD-6565-390-90）。该方案在一次完整旋转过程中采集720个投影，每个投影的像素为1,032 × 1,012，每次子扫描的扫描时间为90秒。启动µCT扫描。

5. 组织学连续切片

  1. 在进行µCT扫描后，将肝脏标本整体包埋于石蜡中。将整块石蜡样品切成4µm厚的切片，共获得2,000至2,500张连续切片。
  2. 采用适当的染色技术对切片进行染色，以显示感兴趣的分子事件，例如以Ki-67作为增殖标志物，HMGB1作为缺血损伤标志物。根据科学问题确定染色顺序。
  3. 使用全片扫描仪对染色切片进行数字化。
  4. 对血管树（已可实现）进行三维重建，并研究分子事件相对于血管树的三维分布（正在进行中）。

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结果

质量标准

在操作过程中，可通过肉眼判断硅胶注射的质量。肝脏表面的小血管会逐渐被蓝色化合物充盈。若在肝脏表面观察到正常的血管结构，则表明硅胶注射质量良好。若灌注量不足，则肝脏表面的小血管未被完全充盈。相反，过度充盈会导致血管破裂，表现为器官表面出现不规则的蓝色斑点。上述两种情况均会给三维重建带来困难，最终导致实验失败。

为了更好地评估灌注质量，采用小动物成像软件进行µCT扫描，并随后进行三维血管重建。当分割结果能够显示完整且连续的血管树，且无因明显外渗所致的破裂结构时，判定灌注成功。若血管树显示不完整（图1A），则提示灌注体积不足；若出现多个血管树或观察到外渗现象（图1B），则提示灌注体积或压力不充分，这是导致失败最可能的原因。理论上...

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讨论

通过硅胶灌注结合µCT扫描来对比血管树的方法，已在肿瘤模型和神经系统疾病模型中广泛应用，以研究血管生成的进展过程5,7,8,10。本研究对硅胶灌注的方法学进行了改进，以更有效地可视化并定量分析小鼠部分肝切除术后血管的生长情况。

要获得良好的灌注质量，需要注意若干关键步骤。首先，强烈建议在用肝素或生理盐水冲洗肝脏之前进行全身肝素化，以避免肝脏内血液凝固。排除管路中的气泡对于实现高质量的硅胶灌注也至关重要。灌注速率和压力的确定应首先基于生理血流动力学参数17。灌注时间反映了总注入体积，估算时需考虑预期的血管内体积以及导管系统的预充体积。

硅胶是一种黏度很高的化合物，其性质与血液或生理盐水不同。因此，需要进行多次试验以调整灌注速率和压力。必须保持恒定的注射流速和压力，以防止小血管严重扩张甚至破裂。灌注时间应根据预估所需的注射体积来设定。然而，一旦在肝脏表面的血管中观察到蓝色化合物，应立即停止灌注。否则，硅胶可能流入窦状隙或其他血管系统，从而干扰后续的重建与分析。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢德国联邦教育与研究部（BMBF）通过系统生物学网络“虚拟肝脏”项目提供的资助，资助编号为 0315743（ExMI）、0315765（耶拿大学医院）、0315769（MEVIS）。作者还感谢 Frank Schubert 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PERFUSOR® VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
移液管Greiner606180
显微剪刀Fine Science Tools (F·S·L)No. 14058-09
显微止血夹Fine Science Tools (F·S·L)No.18055-05
显微夹持器施加器Fine Science Tools (F·S·L)No. 18057-14
直头显微镊Fine Science Tools (F·S·L)No. 00632-11
弯头显微镊Fine Science Tools (F·S·L)No. 00649-11
持针器Fine Science Tools (F·S·L)No. 12061-01
1 ml 注射器B.Braun9161406V
5 ml 注射器B.Braun4606051V
延长连接管B.Braun425600030 cm，内径 ø 1.2 mm
6-0 丝线（Perma-Hand Seide）Ethicon639H
6-0 Prolene 缝线Ethicon8711H
Microfil® MV 稀释剂FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120FLOW TECH, INCMV - 120（蓝色）
MV 固化剂FLOW TECH, INC
肝素 2500 I.E./5 mlRotexmedicaETI3L318-15
生理盐水Fresenius Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics Preclinical 软件Experimental Molecular Imaging, RWTH 亚琛大学，德国
HepaVision弗劳恩霍夫 MEVIS，不来梅，德国
NanoZoomer 2.0-HT 数字切片扫描仪滨松电子出版社，日本 C9600
Tomoscope Duo CT CT Imaging GmbH，埃朗根，德国TomoScope® Synergy

参考文献

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