方法文章

之后，正常小鼠70％部分肝切除血管和实质再生的可视化

DOI：

10.3791/53935

⸱

2016年9月13日

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1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

本文内容

摘要

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用于可视化维管再生的工具需要对比维管树的方法。该胶片展示了一种精细的注射技术，用于实现维管树的最佳对比，并说明了使用 μCT 和组织学连续切片对结果标本进行详细分析所带来的潜在好处。

摘要

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一种改进硅氧烷注射步骤，用于肝血管树的可视化。此过程包括在体内注射硅氧烷化合物组成，经由＆G导管，进入门或肝静脉。硅胶注射后，器官植及离体微CT（μCT）扫描准备。硅胶注射过程在技术上具有挑战性。取得成功的，需要从医生丰富的经验显微。之一的这个过程的挑战涉及确定为聚硅氧烷化合物的适当的灌注速率。需要基于感兴趣血管系统的血流动力学被定义为聚硅氧烷化合物的灌注速率。不适当的灌注率可导致一个不完整的灌注，人工扩张和破裂的血管树。

血管系统的三维重建是基于CT扫描和使用达到临床前的软件如HepaVision。重构的血管树的质量直接与硅氧烷灌注的质量。表示血管生长的随后计算血管的参数，如总血管体积，基于所述血管重建计算。对比用硅酮血管树允许试样μCT扫描后后续的组织学后处理。试样可以进行连续切片，组织学分析和整个幻灯片扫描，并在其后的三维重建基于组织学图像中的血管树。这是用于检测分子事件和它们相对于分配给所述血管树的前提。此改性硅氧烷注入步骤也可以用于可视化和重建其它器官的血管系统。该技术具有的潜力可广泛应用于研究关于在各种动物血管解剖学和生长第二疾病模型。

引言

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肝再生通常通过测量肝脏重量和体积的增加和通过评估肝细胞增殖率16确定。然而，肝再生不仅诱导再生实质，而且血管再生6。因此，血管生长应进一步相对于调查其在肝再生的进展的作用。肝血管系统的可视化是推进我们的血管再生的理解是至关重要的。许多间接方法已被开发，研究肝血管再生的分子机制。传统上，检测的细胞因子（血管内皮生长因子，血管内皮生长因子）14，趋化因子和它们的受体（CXCR4 / CXCR7 / CXCL12）4已经用于研究血管再生的支柱。然而，共同的3D模型与血管的定量分析将增加关键解剖信息更好地了解肝实质和血管再生的重要关系。

为了显现肝血管系统，这需要对比血管树，小鼠用不透射线的聚硅氧烷橡胶的造影剂直接注射到门户或肝静脉血管树。硅氧烷和器官的外植的聚合后，将肝脏样品用CT扫描仪进行μCT扫描。该扫描导致体素​​图像表示 硅氧烷喷射的试样9。

在质量控制方面，对血管系统最早是在使用3D软件的临床前可视化。分割通过设定所述软组织的强度和容器强度之间的阈值执行的。由此产生的容器面膜使用面绘制可视化。该软件还允许手工测定vascul两个参数AR增长:最大船舶长度和半径。

那么临床前软件进行三维重建血管树木和供给或引流血管分布区13后续计量。此外，该软件自动确定血管生长的某些参数，所有可见的血管结构也被称为总边缘长度或总容器体积的总长度，如。

在幼稚小鼠和在该行的70％部分肝切除（PH）的小鼠进行硅酮灌注过程。肝脏在不同的观察时间点切除使用上述可视化和定量技术分析血管和实质肝再生后收集。

该薄膜的主要目标是:（1）表明，以达到最佳反衬和（2）示出的潜在利益所得FR所需的微妙的注射技术嗡使用μCT和组织学连续切片所得样品的详细分析。看完这部片子后，读者应该有一个更好的了解如何注入聚硅氧烷化合物为特定的血管系统和技术的实用性和适用性。

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方案

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涉及受试动物的程序已通过图林根Landesamt献给Verbraucherschutz营连Tiergesundheit UND Tierschutz，德国。由于门静脉系统是由肝静脉系统分开可视化，还需要对不同的血管树单独的动物。

1.试剂准备

  1. 肝素盐溶液
    1. 加入0.1 ml肝素到10ml盐水（5单位/毫升）。
  2. 有机硅化合物的混合物
    1. 加2ml MV-120在1个5毫升的试管。通过添加造成的40％溶液3毫升MV稀释剂稀释的MV-120。

2.门静脉系统硅胶射出

  1. 剖腹
    1. 鼠标放置在麻醉诱导室，用2％异氟烷和0.3升/分钟的氧气麻醉它。
    2. 修正了在使用磁带连续吸入手术台麻醉小鼠的2％oflurane和0.3升/分钟的氧气。检查鼠标的脚趾捏撤回反射，如果反射是没有开始运作。
    3. 就用剪刀对皮肤层和电凝的肌肉层的腹部的横切口。搬出用棉提示肠内到左侧和盖用盐水浸泡的纱布肠子。
  2. 导管插入
    1. 解剖采用微型镊子在显微镜下门静脉。放置一个6-0丝线缝合肝外门静脉下方，在其分叉约为1毫米的距离和松散的领带以备后用。
    2. 注入用于全身肝素化通过阴茎静脉（男性）制备的肝素盐溶液或下腔静脉（女）5分钟。
    3. 将26号（26 G）与导管针进入门静脉，并用夹子固定它
  3. 肝素盐溶液和有机硅化合物灌注
    1. 负载肝素盐水溶胶ution在5ml注射器中，并打开灌注设备。与肝素盐水完全填充导管，以避免气泡。
    2. 延长管连接到导管，紧紧固定。为0.4毫升/分钟的灌注速率开始肝素盐水灌注。
    3. 结扎预置6-0丝线缝合双固定导管和脾静脉和肠系膜静脉阻断血流。通过灌注Euthanatize放血鼠标麻醉下。
    4. 冲洗整个灌注过程期间使用生理盐水肝脏以保持湿润。
    5. 添加0.1毫升固化剂成的MV-120管。更改肝素盐水的注射器来注射硅胶。
    6. 为0.2毫升/分钟的灌注速率为约1分钟到预填导管系统和填满门静脉系统启动硅氧烷灌注。停止硅氧烷灌注时的表面上的船只变为蓝色。
  4. 采样
    1. 保持原位 UNT肝IL硅氧烷完全后大约15至30分钟聚合。解剖连接肝脏和邻近器官小心保持完好肝韧带。植肝，放入福尔马林固定。

3.肝静脉系统硅胶射出

  1. 按照步骤执行2.1剖腹探查执行并充分暴露手术视野。
  2. 导管插入
    1. 解剖采用微型镊子在显微镜下门静脉。放置一个6-0丝线缝合肝外门静脉下方，在其分叉约为1毫米的距离和松散的领带以备后用。
    2. 注入用于全身肝素化通过阴茎静脉（男性）制备的肝素盐溶液或下腔静脉（女）5分钟。
    3. 插入一个＆G导管（导管1）用针进入门静脉，并用夹子固定。插入另一＆G导管（导管2）针刺入下腔静脉，并用夹子固定它。
    4. 结扎下腔静脉（包括左和右的肾静脉）和其远端的使用6-0合成的，单丝，非吸收性聚丙烯缝线的分支。
  3. 肝素盐溶液和有机硅化合物灌注
    1. 加载肝素盐溶液的5ml注射器中，并打开灌注设备。与肝素盐水填充导管1完全避免气泡产生。延长管连接到导管1，紧紧地修复它。以0.4毫升/分钟的速率开始肝素盐水灌注。
    2. 结扎预置6-0丝线缝合双固定导管和脾静脉和肠系膜静脉阻断血流。通过灌注Euthanatize放血鼠标麻醉下。
    3. 冲洗整个灌注过程期间使用生理盐水肝脏以保持湿润。添加0.1毫升固化剂成的MV-120管。交易所肝素盐水的注射器针筒硅胶。
    4. 将一个夹在suprahepatIC下腔静脉，阻碍肝脏的流出。
    5. 连接延伸管到导管2，并开始硅氧烷灌注0.2毫升/分钟的灌注速率为约2分钟以达到一个目标肝血管体积为报道。停止硅氧烷灌注时的表面上的船只变为蓝色。
  4. 采样
    1. 解剖肝韧带避免任何损害肝脏。植肝，放入福尔马林固定。

4.微CT（μCT）扫描

使用μCT扫描植肝脏样品，需要下列步骤。

  1. 取肝脏样品从固定的解决方案。将肝到μCT床。把μCT床与肝样品放入μCT。
  2. 在开始扫描之前获得topogram。用于小肝癌实验一子扫描和两个副扫描的​​大样本。
  3. 选择一个81; CT协议具有高分辨率（ 例如 ，HQD-6565-390-90）。该协议每副扫描90秒的扫描时间一整圈时获得720预测与1032点¯x1012像素。启动μCT扫描。

5.组织学连续切片

  1. 嵌入石蜡的肝标本整体μCT扫描之后。切整个石蜡样品放入4μm的切片，从而产生一系列的2000到2500的部分。
  2. 用适当的染色技术染色切片形象化感兴趣分子事件如Ki-67的作为增殖标志物和HMGB1的局部缺血性损伤的标记物。确定在尊重科学问题染色序列。
  3. 使用整个幻灯片扫描仪的数字化染色切片。
  4. 执行血管树（多个）（已经可行）的3D重建和可视化在相对于血管树（研究正在进行中）的分子事件的三维分布。

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结果

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质量标准

硅酮注射液的质量可以与过程中的肉眼进行判断。在肝表面的小血管的蓝色复合填写逐渐。如果对肝脏表面观察正常的血管结构，所述硅橡胶注入质量是好的。如果灌注量不足，对肝脏表面小血管没有完全填补。与此相反，在填充引起血管破裂的器官的表面上不规则蓝色斑点所示。两者都导致在3D重建，最终呈现的过程的失败的困难。

对于注射剂质量较好的评价，进行μCT扫描，随后使用临床前软件三维重建血管。注射被确定为成功WH恩分割产生了一个完整的完整的血管树的不可见光外渗表明破裂结构的可视化。如果血管树出现不完整（ 图1A），灌注体积是不够的。如果一个以上的血管树出现或外渗被看见（ 图1B），灌注体积或压力不足。这是一个失败的最可能的原因。灌注压力理论上...

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讨论

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通过对比硅胶注射和μCT扫描血管树已在肿瘤模型和神经系统疾病模型中引入经常研究进展血管5,7,8,10。在硅氧烷喷射的方法的改进，在本研究中提出的可视化和小鼠肝部分切除后定量血管生长。

有许多的关键步骤注意以达到良好的灌注质量。首先，全身肝素高度用肝素或盐水冲洗肝脏，以避免肝脏内凝血前推荐的。从管路气泡消除也是重要的实现硅氧烷灌注的优良品质。灌注速率和压力的确定应首先基于生理血液动力学参数17。灌注时间反映总的注射量，估计走的是预期的血管内体积和导管系统的预填量考虑在内。

硅氧烷是从血液或盐水的不同的高粘性化合物。因此，需要用于调节灌注速率和压力的几个试验。保持恒定的喷射流速和压力是必要的，以防止严重的扩张或甚小血管的破裂。灌注时间根据所估计的所需注入量设定。然而，灌注应该立即停止时的蓝色化合物变为在肝脏的表面上的船只可见。否则，硅能排入血窦和成另一种血管系统将与后重建和干扰分析。

典型地，硅氧烷是通过在最发表的报告1...

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披露

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

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作者感谢德国教育和研究部 （BMBF） 通过系统生物学网络"虚拟肝脏"提供的资助，资助编号为 0315743 （ExMI）、0315765 （英国耶拿）、0315769 （MEVIS）。作者还感谢 Frank Schubert 的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PERFUSOR®VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
PipetsGreiner606180
微型剪刀精细科学工具 （F·S·L）No. 14058-09
micro serrefineFine Science Tools （F·S·L）No.18055-05
微型夹具涂抹器Fine Science Tools （F·S·L）No. 18057-14
直微型镊子Fine Science Tools （F·S·L）No. 00632-11
弯曲的微型镊子Fine Science Tools （F·S·L）No. 00649-11
持针器精密科学工具 （F·S·L）编号 12061-01
1 ml 注射器B.Braun9161406V
5 ml 注射器B.Braun4606051V
延长线和连接线B.Braun425600030 厘米，内侧和斜线; 1.2 毫米
6-0 丝绸（永久手工赛德）Ethicon639H
6-0 proleneEthicon8711H
微滤®MV 稀释剂FLOW TECH， INC
Microfil®MV - 120FLOW TECH， INCMV - 120 （蓝色）
MV 固化剂FLOW TECH， INC
肝素 2500 IE/5 mlRotexmedicaETI3L318-15
盐水费森尤斯 Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics 临床前软件实验分子成像，德国亚琛工业大学，德国
HepaVisionFraunhofer MEVIS，德国
NanoZoomer 2.0-HT 数字载玻片扫描仪Hamamatsu Electronic Press， 日本 C9600
双 CT 断层镜 CT Imaging GmbH， Erlangen， GermanyTomoScope® 协同
不来梅

参考文献

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