小鼠后肢长骨解剖与骨髓分离

摘要

本文介绍了一种从小鼠后肢长骨（股骨和胫骨）中进行解剖的实验方案。此外，我们还描述了一种快速分离这些骨骼中骨髓的技术，该技术利用离心法将骨髓从骨髓腔中分离出来。

摘要

骨骼及骨髓的研究在基础骨骼生物学、免疫学、血液学、癌症转移、生物力学和干细胞生物学等多个研究领域中至关重要。然而，尽管骨骼在健康和疾病状态下均具有重要意义，但由于缺乏骨骼解剖和骨髓分离的专业知识，骨骼仍是一个研究相对不足的器官。小鼠是研究骨骼及骨髓影响的常用模式生物，因此需要一种标准化且高效的长骨解剖与骨髓分离方法，以处理大规模的实验样本。本文介绍了一种简便的解剖流程，用于完整取出股骨和胫骨，适用于包括但不限于组织形态学分析和力学强度测试在内的下游应用。此外，我们还概述了一种通过离心快速从长骨中分离骨 marrow 的方法，操作时间短，非常适合细胞分选、原代细胞培养或DNA、RNA及蛋白质提取。该方案经过优化，可实现样本的快速处理，以减少实验误差，并通过标准化操作最大限度地降低不同操作者之间的差异性。

引言

长骨及其骨髓细胞的研究是众多科研领域的重要核心，包括但不限于骨骼生物学、癌症生物学、免疫学、血液学和生物力学。骨骼是一种高度动态的器官，与软骨共同构成骨骼系统，为身体提供抵抗负荷的机械支撑，并保护内脏器官。此外，骨骼中的矿物质成分可作为关键信号分子钙和磷以及其他因子的储存库¹。最后，骨骼容纳骨髓，并与代谢活跃的成骨细胞和破骨细胞共同作用，形成维持造血细胞和淋巴细胞群体所必需的干细胞微环境。

许多疾病都会累及骨骼和骨髓，常导致骨髓功能障碍、严重骨痛以及病理性骨折。在多种实体瘤中，骨骼是转移的常见部位，尤其是乳腺癌和前列腺癌，其中肿瘤细胞直接与骨髓微环境相互作用，启动骨转移的恶性循环，并排挤造血干细胞^2,3。包括骨髓瘤和白血病在内的造血系统恶性肿瘤，其特征也是骨髓功能障碍以及正常骨重建过程的失调¹。其他非恶性骨骼疾病同样是当前研究的热点，例如骨关节炎、骨质疏松症、脊柱侧弯和佝偻病。即使在其他方面健康的人群中，骨骼的生物力学失效也会导致疼痛性骨折。上述所有疾病均为当前重点研究领域，旨在发现新的预防措施和治疗方案，以降低发病率和死亡率。

为了研究骨骼和骨髓在生理与病理条件下的多种功能，研究人员亟需一种简单、高效且标准化的小鼠长骨解剖方法，以便快速处理大量样本 体内 实验。此处概述的解剖方案适用于所有长骨分析，包括 离体 成像、组织学、组织形态计量学和强度测试等。同样，一种标准化的骨髓分离方法，具有较高的骨髓细胞回收率和较低的操作者间差异，对于荧光激活细胞分选（FACS）或定量PCR（qPCR）等实验分析，以及骨髓细胞原代培养等后续应用均至关重要。

方案

所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。

1. 后肢长骨解剖

1. 根据机构指南对小鼠实施安乐死。
2. 将小鼠置于仰卧位，通过踝关节以下的足垫用针固定四肢。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠，彻底浸湿腿部。
4. 在下腹部中线右侧、髋部上方稍作切口。
5. 沿腿部向下延伸切口，并越过踝关节。
6. 向后拉开皮肤，剪开附着在股骨近端的股四头肌，以暴露股骨前侧，并将腿固定在板上，插针时使针与板呈45度角。
7. 将剪刀的刀刃贴住股骨后侧，从膝关节处剪断腘绳肌。
8. 向后牵拉皮肤和附着于股骨近端的腘绳肌，以暴露股骨后侧，并将腿部固定于解剖板上，以与板面成45度角插入固定针。
9. 用镊子夹住股骨远端，位置在膝关节上方。将剪刀刀片沿股骨干两侧向髋关节方向剪开，注意不要剪到股骨本身。
10. 到达股骨头时，剪刀会略微张开，此时应旋转剪刀，使剪刀的上刃直接越过股骨头，以使股骨脱位，注意避免在股骨头下方折断骨骼。
11. 用镊子夹住股骨干上端，切断股骨头周围的软组织，使其从髋臼中分离。
12. 将整条腿骨（包括股骨、膝关节和胫骨）从身体上拉起并移开，小心切断连接腿部与皮肤的结缔组织和肌肉。
13. 过度背屈踝关节，再次使用剪刀以扭转动作使胫骨脱位。
14. 握住胫骨远端，注意不要切断肌腱，将胫骨向上并远离身体和插针板拉起。
15. 在膝关节处切断将长骨与小鼠相连的剩余结缔组织。
16. 去除附着在股骨和胫骨上的多余肌肉或结缔组织。
17. 对于任何需要保持骨骼完整性的应用（组织学、组织形态计量学、生物力学测试， 等等。），按照标准的实验室内部方案进行（如 ^4-7）。为分离骨髓，请进入第2节。

2. 骨髓分离用长骨的制备

1. 用镊子夹住股骨，使髌骨朝外，近端（股骨头）朝下。
2. 过度伸展膝关节，并用剪刀以扭转动作使胫骨与股骨脱位。
3. 剪断连接股骨和胫骨的任何结缔组织。
4. 用镊子夹住股骨，使前面朝外，近端（股骨头端）朝下。
5. 将剪刀沿股骨干向上引导至髁部。
6. 轻轻来回旋转剪刀，去除髁、髌骨及骨骺，以暴露干骺端。
7. 使用镊子、剪刀和Kimwipes去除附着在股骨上的其他肌肉或结缔组织。
8. 用镊子夹住胫骨，使前面朝外，远端（踝端）朝下。
9. 若胫骨骨骺完整，将剪刀沿胫骨干向上引导至髁部。
10. 轻轻来回旋转剪刀，去除髁和骨骺，以暴露干骺端。
11. 使用镊子、剪刀和Kimwipes去除附着在胫骨上的其他肌肉或结缔组织。

3. 骨髓分离

1. 将一根18 G针头从0.5 ml 微量离心管底部穿入。
2. 将长骨（最多2根股骨和2根胫骨）放入管中，膝端朝下，盖上管盖。
3. 将装有骨骼的0.5 ml微量离心管插入1.5 ml微量离心管中。
4. 将嵌套的双层管在微量离心机中以≥10,000 × g离心15秒。
5. 通过肉眼观察确认骨髓是否已从骨骼中甩出。骨骼应呈现白色，且外层大管中应可见明显的沉淀物。
6. 丢弃含有骨骼的0.5 ml微量离心管。
7. 将骨髓沉淀重悬于适当的溶液（例如，PBS、培养基、FACS缓冲液）中，并根据实验方案进行后续操作（DNA、RNA或蛋白质提取、FACS分析或原代细胞培养）。

结果

本方案经过优化，可快速分离小鼠股骨和胫骨，并最大程度减少对骨组织的损伤。该技术适用于多种后续分析，包括生物力学研究、骨组织形态计量学（图1A - B）和组织学（图1C）^4,7。代表性骨组织形态计量学微计算机断层扫描（microCT）三维重建图像（图1A - B）显示，松质骨和皮质骨壳均得以完整保留，从而能够准确量化标准化的骨结构参数，包括骨小梁数量、厚度和间距、骨体积以及皮质厚度等其他指标⁸。代表性组织学切片显示经甲醛固定、脱钙并进行苏木精-伊红（H&E）染色的小鼠胫骨（图1C）。该图像表明钙化骨组织及细胞成分丰富的骨髓均保持完整，适用于组织学分析。

骨髓分离操作可保持骨髓腔的无菌状态，操作步骤少，可减少污染，且无需切割长骨，从而减少骨髓收获量的损失。所获得的骨髓适用于多种下游应用，包括流式细胞术⁵和PCR分析。此外，该操作还可用于分离骨髓细胞，以进行原代细胞培养，包括破骨细胞和成骨细胞的培养（图2A - B）^4,6。

图1. 小鼠长骨的组织形态学与组织学分析 小鼠胫骨的三维显微CT重建图像显示（A）外层皮质壳和（B) 小梁骨（比例尺 = 0.5 mm）。（C）组织学H&脱钙并切片的胫骨伊红染色（4倍）。图片由美国华盛顿大学医学院Katherine Weilbaecher提供。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2. 用于破骨细胞和成骨细胞分化的原代骨髓细胞培养。（A）在成破骨细胞培养基中培养7天后，对多核破骨细胞进行TRAP染色（4倍放大）。（B）在成骨培养基中培养21天后，成骨细胞的碱性磷酸酶染色（紫色）及矿化结节的茜素红染色（红色）。图片由美国华盛顿大学医学院Katherine Weilbaecher提供。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们介绍一种简单且高效的小鼠后肢长骨去除及后续骨髓分离方法。该方法能够保持骨骼和骨髓的高度结构完整性和细胞完整性，且操作时间短，最大限度地降低了因操作导致的骨折或骨表面划伤，从而避免对下游分析造成影响。此外，采用离心法分离骨髓时无需切割骨骼以暴露骨髓腔，也无需冲洗液冲出骨髓，减少了潜在的污染环节。同时，该离心技术通量相对较高，操作时间少于其他方法，因而缩短了整体处理时间。

由于小鼠个体间表型变异较大，体内小鼠实验本身具有较高的变异性。为了最大限度地提升昂贵且耗时的小鼠实验的研究价值，至关重要的是尽量减少技术性实验误差^9,10。从动物处死到后续分析或组织固定的耗时会引入实验变异，这种变异可能掩盖细微的变化，并削弱组间显著差异。因此，快速处理样本对于准确的数据分析至关重要。本文所述的长骨解剖和骨髓分离技术经过优化，可实现动物和样本的快速处理，从而降低技术变异。

该方案可广泛应用于多个研究领域，包括骨组织本身的研究或骨髓细胞的分析。此外，这种简单的长骨解剖方法将使相关领域的研究人员能够直接探究骨骼在其他尚未充分研究的病理条件下对骨髓功能障碍的贡献，从而拓展我们对该领域的认知。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
样品板
固定针
70% 乙醇
解剖剪
解剖镊
吸水纸	金佰利公司	34120
16 号针头
1.5 ml 微量离心管
0.5 ml 微量离心管
微量离心机