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基于红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）的全身体质谱成像

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DOI：

10.3791/53942

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2016年3月24日

 ,  , 
1W. M. Keck FTMS Laboratory for Human Health Research, Department of Chemistry, North Carolina State University

本文内容

摘要

通过结合中红外激光解吸与电喷雾后电离技术，开发了一种在常压下运行的质谱成像（MSI）离子源。采用外源性冰基质作为吸能介质，以促进组织相关物质的共振解吸。本文提供了对新生小鼠整体进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）的逐步操作方案。

摘要

质谱（MS）的常压电离源在过去十年中备受关注。基质辅助激光解吸电喷雾电离（MALDESI）便是此类方法之一，它结合了基质辅助激光解吸/电离（MALDI）的特点（例如， 解吸的脉冲特性）和电喷雾电离（ESI）（例如， 软电离）相结合。MALDESI 的主要优势之一在于其内在的多功能性。在 MALDESI 实验中，可使用紫外（UV）或红外（IR）激光共振激发内源性或外源性基质。基质的选择不依赖于待分析物，而仅取决于用于激发的激光波长。在 IR-MALDESI 实验中，样品表面会沉积一层薄冰作为吸能基质。IR-MALDESI 源的几何结构已通过实验设计统计方法（DOE）优化，适用于液体样品及生物组织样本的分析。此外，已开发出一种稳定的 IR-MALDESI 成像源，其中可调谐的中红外激光器与计算机控制的 XY 平移台及高分辨能力质谱仪同步运行。定制的图形用户界面（GUI）允许用户选择激光重复频率、每个体素的激光 shots 数、样品台步长以及解吸事件与扫描事件之间的时间延迟。IR-MALDESI 已应用于多种场景，如纤维和染料的法医学分析以及生物组织切片的质谱成像（MSI）。该技术可用于测量并定量组织切片中从内源性代谢物到外源性异生物质等多种分析物的分布情况。本论文所述方案详细描述了对全动物体组织切片进行 IR-MALDESI 质谱成像所需的主要步骤。

引言

质谱成像（MSI）的微探针模式通过一束（激光或离子）在样品表面的离散位置逐点脱附样品。在每个光栅扫描点上生成一张质谱图，所获得的质谱数据及其对应的采集空间位置可用于同时绘制样品中多种分析物的空间分布图。这种无需标记的成像方式结合质谱技术的高灵敏度与高特异性，使得质谱成像已成为质谱领域发展最为迅速的方向之一1,2。

基质辅助激光解吸/电离（MALDI）是质谱成像（MSI）分析中最常用的电离方法。然而，MALDI 方法需要使用有机基质，并且要求在真空条件下操作，这些条件对方法的可重复性、样品通量以及可分析的样品类型带来了显著限制。近年来，已开发出多种常压（AP）电离技术以克服这些限制3。这些常压电离方法使得生物样品能够在更接近其天然状态的环境中进行分析，并简化了分析前的样品制备步骤。基质辅助激光解吸电喷雾电离（MALDESI）便是此类电离方法的一个实例4,5。

在红外基质辅助激光解吸电离喷雾电离（IR-MALDESI）实验中，会在组织表面沉积一层薄冰，作为能量吸收基质。中红外激光脉冲被冰基质吸收，通过共振激发水分子的O-H伸缩振动模式，促进中性物质从表面解吸。解吸的中性分子进入正交电喷雾产生的带电液滴中，并以类似电喷雾电离（ESI）的方式发生后续电离4-6。相较于仅依赖组织内源性水分子，外源性冰基质的引入更为理想，因为它可弥补不同组织区域间含水量的差异，且已被证明可增强解吸效果6，并在组织成像实验中使离子丰度提高约15倍7,8。

在本研究中，我们利用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）技术揭示新生小鼠全身体内不同器官中代谢物的分布情况。文中介绍了IR-MALDESI源的可调参数概览，并演示了对组织切片进行成功成像所需的各项操作步骤。

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方案

注意：以下方案描述了进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）实验所需的全部必要步骤。有关IR-MALDESI源的优化几何构型及其与激光器、样品台和质谱仪同步的详细信息，可参见其他文献5,6。本方案中所使用的动物组织样本均依照机构动物护理与使用委员会（IACUC）及北卡罗来纳州立大学的相关规定获取。

1. 组织制备

  1. 在通风橱内，将约 200 ml 异戊烷倒入洁净的烧杯中，置于盛有干冰的次级容器内，制备异戊烷/干冰冷却浴。操作异戊烷/干冰浴及组织时，必须始终佩戴防护手套和安全护目镜。
    1. 以过量Avertin（7.5 mg/g体重）处死2日龄新生小鼠，随后将组织置于异戊烷/干冰浴中速冻以保存组织结构。使用预先清洁的镊子将小鼠放入冷冻模具，并从异戊烷/干冰浴中取出。将速冻组织储存在-80 °C。80 °C 直至分析前。
  2. 佩戴防护手套，将一层最佳切割温度（OCT）包埋介质涂抹于40 mm冷冻切片机样本盘上。轻轻将冷冻的整只小鼠放置于涂有OCT的样本托上，使小鼠以所需方向固定于样本盘。
    注意：OCT仅用于将组织粘附于样本盘上以便切片。切勿将组织完全包埋于OCT中，并避免过量使用，因为已知OCT会对质谱成像（MSI）分析产生不利影响。其他介质（如明胶）也可用于在切片前对组织进行冷冻包埋。9.
  3. 将带有OCT包埋剂和组织切片的样本置于冷冻切片机的帕尔帖样本台上，按下帕尔帖电源按钮。等待10分钟，使样本达到热平衡。
  4. 将载有组织的标本盘放入盘 holder 中，并使组织面向下对准所需分析平面。在 -20 °C 使用安装在冷冻切片机内的旋转式切片机10.
    注意：对于全身体部分析，将组织切成25-μm-厚切片以保持组织完整性。对于较小区域（例如，肝脏，脑，肾脏），将组织切成10-μm厚切片。
    1. 使用防卷玻璃板防止切片组织卷曲。使用冷冻切片机的真空管和刷子清除多余的组织碎屑。组织切片完成后，使用刀片保护罩盖住锋利的切片刀，以避免造成人身伤害。
  5. 将小鼠切片置于样品板上并定向，通过将载玻片尽可能靠近组织切片（不接触）的方式，解冻贴附于预先清洁的玻璃载玻片上10.
    注意：对于定量质谱成像实验，应在组织贴片前使用自动气动喷雾器将内标物喷涂于载玻片表面，并将组织切片 thaw-mount 在已涂覆的载玻片上11.
  6. 使用刀片弹出器取下用于切片组织的切片机刀片，并将刀片安全弃置于指定的“锐器废物”容器中。
  7. 将玻璃载玻片置于冷冻切片机内直至步骤3.2，以维持组织的低温保存状态。

2. IR-MALDESI 制备/校准

  1. 打开中红外激光器，并在计算机上启动激光控制程序。使用制造商提供的激光控制程序选择所需的波长。红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）实验通常在2,940 nm波长下进行。
    注：近期实验研究了中红外激光波长和冰基质的依赖性，观察到的差异似乎与分析物特异性相关8.
  2. 打开载物台控制器，启动自定义用户控制程序（RASTIR），并使用归零按钮校准载物台位置。
  3. 配制电喷雾溶液。通常，在正离子模式下使用体积比为50:50（v/v）的甲醇/水溶液，并添加0.2%甲酸作为电喷雾溶剂。根据具体实验选择合适的电喷雾溶剂组成。例如，在负离子模式成像应用中，可使用5 mM氢氧化铵作为电喷雾添加剂。
    注意：对于极性切换的 IR-MALDESI 质谱成像，使用 1 mM 乙酸作为改性剂。该改性剂在正离子和负离子模式下均能获得稳定且可重复的信号，已被证明为最优选择。12.
  4. 用1 ml注射器吸入电喷雾溶剂，并用新溶剂冲洗石英毛细管。
  5. 使用已通过统计实验设计（DOE）优化的源参数（如ESI探针与质谱入口之间的距离、探针与入口间距离、样品高度以及溶剂流速），将ESI喷雾器与质谱进样口同轴对齐，用于组织切片分析6. 注意：参见 图1 有关描绘这些参数及组织切片 MSI 优化值的示意图。
  6. 启动电喷雾并评估其稳定性（>10 分钟）监测总离子流（TIC），此时TIC仅由环境化合物组成。通常，TIC的波动幅度为 <10分钟至15分钟内变化不超过10%是稳定性良好的一个指标。

电喷雾电离过程；组织成像的ESI参数示意图；溶剂流
图 1. IR-MALDESI 示意图及参数。（A）IR-MALDESI 源装置示意图（未按比例绘制）及可调参数。（B）组织切片成像的优化参数值。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 冰基质的沉积

  1. 注意：在将样品放置于载物台上之前，需关闭电喷雾。
  2. 将解冻后的组织置于红外激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）样品板上，并确保位于摄像头视野范围内。
  3. 确保双手远离电喷雾发射器，然后重新启动电喷雾。
  4. 关闭 IR-MALDESI 源的访问门，并用干燥氮气吹扫腔体，以防止水分在组织表面冷凝。当腔体内的相对湿度降至 <3% 时，打开 Peltier 板的直流电源（约 12 V），使样品板冷却。注：Peltier 冷却载物台的冷却过程在其他文献中有详细讨论13。
  5. 将载物台冷却至 -9 °C，并使固定好的组织达到热平衡状态（约 5–10 分钟）。
  6. 停止氮气吹扫，通过打开源端访问门使组织暴露于环境相对湿度中。由于空气中水蒸气的凝华作用，Peltier 载物台的冷表面及固定组织切片上将形成一层薄冰。
    注：若实验室内的相对湿度低于 10–15%，可在腔体内放置一个盛有温水的烧杯，以促进冰基质层的形成。
  7. 冰基质层形成后，关闭访问门并重新启动干燥氮气流动，将相对湿度降至 10±2%。调节氮气流速以维持该湿度水平，经实验确定此条件可平衡冰的形成与升华，从而在整个实验过程中保持稳定的冰层6。

4. 质谱成像数据采集

  1. 使用 RASTIR 图形用户界面（图 2），通过点击“LASER position”按钮将载物台移动至分析位置。利用激光的调节二极管确保在非组织区域进行消融。在非组织区域发射一次激光脉冲，以校准激光位置相对于相机视野的偏移量。点击“Laser Test Fire”按钮以更新激光位置。
  2. 返回“CAMERA position”，并在 RASTIR 中通过将激光对准十字线置于激光消融点上来更新激光位置（图 2-1）。
  3. 点击感兴趣区域（ROI）按钮，并根据待分析的组织切片调整 ROI 的大小和位置（图 2-2）。输入适当的实验参数，例如 X 和 Y 方向的步长（单位：mm）（图 2-3），并在“Project Name”框中命名质谱成像（MSI）文件（图 2-4）。
    1. 绘制 ROI 时，应包含一部分非组织区域作为对照。此非组织区域将用于峰提取（步骤 5.4）。
      注意：激光在组织上的解吸直径（光斑尺寸）约为 150 µm；然而，可通过使用过采样方法获得更高的空间分辨率14,15。
  4. 从下拉框中选择合适的激光频率、每个体素的激光脉冲数（整数值）以及激光触发与质谱信号采集之间的延迟时间（图 2-5）。通常在 IR-MALDESI 质谱成像实验中，每个体素使用两个激光脉冲，频率为 20 Hz，以完全解吸材料，并设置 10 毫秒的延迟时间，使生成的离子能够到达质谱分析器进行检测5。
    注意：选择激光所能运行的最高重复频率。最近研究表明，使用更高的重复频率可提高分析物的可检测性16。

用于成像的激光扫描装置；包含像素校准、扫描模式和频率细节的示意图。
图2. IR-MALDESI质谱成像（MSI）操作的用户界面。 显示的是RASTIR扫描控制程序的截图。进行质谱成像实验的步骤包括：（1）定位激光光斑，（2）绘制感兴趣区域（ROI），（3）选择载物台步长（单位为 mm），（4）为文件命名，（5）选择每个体素所需的激光脉冲数及期望的重复频率，以及（6）核对成像与质谱设置的列表项。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在质谱仪软件中选择质谱参数，如电离模式、电喷雾电压、溶剂流速、毛细管温度以及质谱仪中的进样时间。有关全动物红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）中所用参数的示例，请参见表1。
    注意：由于生物样品的复杂性以及质谱成像（MSI）分析中缺乏分离方法，IR-MALDESI 源通常与高分辨能力和高质荷比精度的仪器联用。可加载采集方法用于诸如平行反应监测（PRM）7 或极性切换质谱成像（MSI）12 等分析。
  2. 在完成所有参数（激光、样品台和质谱仪）设置后，将质谱仪置于“握手”模式以实现同步，并启动质谱采集。
  3. 使用 RASTIR 成像软件，通过勾选复选框确认清单中所有步骤（图2-6）均已完成后加载程序。程序加载完毕后，“运行”按钮将变为可用。点击“运行”以开始质谱成像信号采集。
  4. 成像实验完成后，停止质谱仪采集，并将仪器置于待机模式。关闭对密闭腔体的氮气吹扫，关闭帕尔贴板电源，关闭样品台控制器和激光器。
  5. 打开访问门，从源密闭腔体内取出电喷雾发射器尖端，并佩戴防护手套取出延伸的加热金属质谱进样口。注意：延伸的金属质谱进样口温度会非常高。
  6. 佩戴手套和护目镜，将延伸的金属毛细管进样口依次在15%硝酸中超声清洗10分钟，随后在HPLC级水中超声清洗10分钟，最后在HPLC级甲醇中超声清洗10分钟。用氮气流吹干金属毛细管进样口后重新插入质谱仪。注意：随后应将废液倒入适当的废液容器中处理。
参数数值
电离模式正离子模式
电喷雾电压3.8-4.2 kV
溶剂流速2 μl/min
毛细管温度275 °C
扫描范围m/z 250-1,000
扫描类型全扫描
注入时间110 msec
分辨率140,000

表1. 全身IR-MALDESI质谱成像中使用的仪器参数。

5. 数据分析

  1. 使用免费软件（如 MSConvert17 和 imzML converter19）将仪器生成的原始数据文件转换为 mzXML17 或 imzML18 等数据格式。
  2. 在专用处理计算机上启动 MSiReader v1.0——一种为高分辨能力质谱成像（MSI）数据分析开发的开源软件20，并将成像文件加载至 MSiReader 中。有关 MSiReader 的用户界面及其部分内置功能，请参见图 3。
  3. 通过输入目标分析物的 m/z 值，并选择适当的 m/z 窗口（以百万分之一（ppm）或 Thomson（Th）为单位），生成相应的离子分布图（图 3-1）。对于高分辨能力（RP）仪器，应选择较低 ppm 范围的窗口。
    注意：m/z 窗口的合理选择取决于 IR-MALDESI 源所连接仪器的分辨能力（RP）和质量测量精度（MMA）。
  4. 利用软件内置功能进一步解析数据，例如插值（图 3-2）、归一化（图 3-3）、光学图像叠加（图 3-4）和峰提取（图 3-5）20。

质谱成像分析，MSiReader 软件界面，质谱数据可视化，示意图。
图 3. MSiReader 软件的用户界面；v1.020。将文件加载至软件后，可通过（1）输入目标分析物的 m/z 值及以 ppm 或 Th 为单位的容差，来显示其离子分布图。还可进行进一步分析，例如（2）插值或（3）归一化处理。也可导入组织的光学图像，并与离子分布图叠加（4），以实现更佳的可视化效果。对于非靶向分析，可使用峰提取功能（5），通过选择组织区域（品红色线条）和组织外参考区域（绿色框），提取出组织特异性峰。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用峰提取功能生成组织特异性峰列表 m/z 使用用户自定义标准进行数值分析。注意：PeakFinder 算法利用两个区域平均质谱的差异。这些 m/z 随后可将数值与代谢物数据库（如 METLIN）进行比对21 或 LIPID MAPS。22
    1. 参见 图3 用于示例选择被检测的组织区域（品红色多边形 ROI）和组织外参考区域（绿色多边形 ROI）。

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结果

所展示的图像 图4 显示全身组织切片中不同器官内代谢物的空间分布。独特 m/z 使用MSiReader PeakFinder将数值分配至身体的特定区域，随后进行批量处理以生成图像。图像叠加工具（图3-4) 用于将冰基质沉积前拍摄的光学图像与生成的离子图像进行对齐。胆固醇在所有组织类型中均有观察到，这与其在动物细胞膜结构中的作用相符（图 4A），而其他代谢物则在特定器官或组织区室中表现出不同的分布模式（图4B-D).

脂质、甾醇、神经酰胺、鞘磷脂的质谱成像；离子分布图谱。
...

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讨论

上述方案描述了进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）实验的关键步骤。基质施加过程（第3节）大约需要20分钟，与通常通过升华或使用自动喷涂仪进行喷雾涂布的MALDI MSI实验中的基质施加过程耗时相近。此外，IR-MALDESI不依赖于分析物在基质晶体中的分配6，且冰基质可普遍适用于所有分析物，无论其质量、大小或化学性质如何。另外，使用冰基质可消除典型MALDI实验中在较低m/z范围内观察到的基质相关离子23。

尽管实验中的所有步骤对于生成高质量的质谱成像数据都是必需的，但在整个实验过程中，电喷雾的稳定性对于可重复的红外基质辅助激光解吸电离（IR-MALDESI）离子生成至关重要。在成像实验过程中需要持续监测相对湿度，以维持稳定的冰基质层。IR-MALDESI解吸对冰层厚度相对不敏感6；然而，某些成像实验可能持续数小时，若不加以监测，冰层可能会带来干扰。为此，近期已在离子源中集成比例-积分-微分（PID）控制器，用于监测密闭腔体内的温度和相对湿度，并根据需要进行调节...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢北卡罗来纳州立大学分子生物医学科学系的 H. Troy Ghashghaei 教授提供完整的小鼠组织。作者还衷心感谢美国国立卫生研究院（R01GM087964）、W.M. Keck 基金会以及北卡罗来纳州立大学提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
红外基质辅助激光解吸电离源（IR-MALDESI）定制不适用有关 IR-MALDESI 源开发的深入讨论，请参见参考文献 4 和 12。
Q Exactive Plus Thermo ScientificQ Exactive Plus 混合四极杆-轨道阱质谱仪
水，HPLC 级Burdick & Jackson AH365-4
甲醇，HPLC 级Burdick & Jackson AH230-4
甲酸Sigma Aldrich 56302
可调谐中红外激光器Opotek 公司IR Opolette波长可调谐 2,700–3,100 nm 红外光参量振荡器（OPO）激光器
氮气Arc3 GasesAG S-NI300-5.05.0 级高纯氮气钢瓶（300）
冷冻切片机Leica BiosystemsCM 1950冷冻切片机
高轮廓切片刀片Leica Biosystems3802123Leica DB80HS
包埋介质（OCT）Leica Biosystems3801480Surgipath FSC 22 包埋介质
冷冻切片机样本盘Leica Biosystems14047740045直径 40 mm
玻璃显微镜载玻片VWR48312-003磨砂面，精选，预清洁

参考文献

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