通过结合中红外激光解吸与电喷雾后电离技术，开发了一种在常压下运行的质谱成像（MSI）离子源。采用外源性冰基质作为吸能介质，以促进组织相关物质的共振解吸。本文提供了对新生小鼠整体进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）的逐步操作方案。
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本文内容
摘要
摘要
质谱（MS）的常压电离源在过去十年中备受关注。基质辅助激光解吸电喷雾电离（MALDESI）便是此类方法之一，它结合了基质辅助激光解吸/电离（MALDI）的特点（例如， 解吸的脉冲特性）和电喷雾电离（ESI）（例如， 软电离）相结合。MALDESI 的主要优势之一在于其内在的多功能性。在 MALDESI 实验中，可使用紫外（UV）或红外（IR）激光共振激发内源性或外源性基质。基质的选择不依赖于待分析物，而仅取决于用于激发的激光波长。在 IR-MALDESI 实验中，样品表面会沉积一层薄冰作为吸能基质。IR-MALDESI 源的几何结构已通过实验设计统计方法（DOE）优化，适用于液体样品及生物组织样本的分析。此外，已开发出一种稳定的 IR-MALDESI 成像源，其中可调谐的中红外激光器与计算机控制的 XY 平移台及高分辨能力质谱仪同步运行。定制的图形用户界面（GUI）允许用户选择激光重复频率、每个体素的激光 shots 数、样品台步长以及解吸事件与扫描事件之间的时间延迟。IR-MALDESI 已应用于多种场景，如纤维和染料的法医学分析以及生物组织切片的质谱成像（MSI）。该技术可用于测量并定量组织切片中从内源性代谢物到外源性异生物质等多种分析物的分布情况。本论文所述方案详细描述了对全动物体组织切片进行 IR-MALDESI 质谱成像所需的主要步骤。
引言
质谱成像（MSI）的微探针模式通过一束（激光或离子）在样品表面的离散位置逐点脱附样品。在每个光栅扫描点上生成一张质谱图，所获得的质谱数据及其对应的采集空间位置可用于同时绘制样品中多种分析物的空间分布图。这种无需标记的成像方式结合质谱技术的高灵敏度与高特异性，使得质谱成像已成为质谱领域发展最为迅速的方向之一1,2。
基质辅助激光解吸/电离（MALDI）是质谱成像（MSI）分析中最常用的电离方法。然而，MALDI 方法需要使用有机基质，并且要求在真空条件下操作，这些条件对方法的可重复性、样品通量以及可分析的样品类型带来了显著限制。近年来，已开发出多种常压（AP）电离技术以克服这些限制3。这些常压电离方法使得生物样品能够在更接近其天然状态的环境中进行分析，并简化了分析前的样品制备步骤。基质辅助激光解吸电喷雾电离（MALDESI）便是此类电离方法的一个实例4,5。
在红外基质辅助激光解吸电离喷雾电离（IR-MALDESI）实验中，会在组织表面沉积一层薄冰，作为能量吸收基质。中红外激光脉冲被冰基质吸收，通过共振激发水分子的O-H伸缩振动模式，促进中性物质从表面解吸。解吸的中性分子进入正交电喷雾产生的带电液滴中，并以类似电喷雾电离（ESI）的方式发生后续电离4-6。相较于仅依赖组织内源性水分子，外源性冰基质的引入更为理想，因为它可弥补不同组织区域....
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方案
注意：以下方案描述了进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）实验所需的全部必要步骤。有关IR-MALDESI源的优化几何构型及其与激光器、样品台和质谱仪同步的详细信息，可参见其他文献5,6。本方案中所使用的动物组织样本均依照机构动物护理与使用委员会（IACUC）及北卡罗来纳州立大学的相关规定获取。
1. 组织制备
- 在通风橱内，将约 200 ml 异戊烷倒入洁净的烧杯中，置于盛有干冰的次级容器内，制备异戊烷/干冰冷却浴。操作异戊烷/干冰浴及组织时，必须始终佩戴防护手套和安全护目镜。
- 以过量Avertin（7.5 mg/g体重）处死2日龄新生小鼠，随后将组织置于异戊烷/干冰浴中速冻以保存组织结构。使用预先清洁的镊子将小鼠放入冷冻模具，并从异戊烷/干冰浴中取出。将速冻组织储存在-80 °C。80 °C 直至分析前。
- 佩戴防护手套，将一层最佳切割温度（OCT）包埋介质涂抹于40 mm冷冻切片机样本盘上。轻轻将冷冻的整只小鼠放置于涂有OCT的样本托上，使小鼠以所需方向固定于样本盘。
注意：OCT仅用于将组织粘附于样本盘上以便切片。切勿将组织完全包埋于OCT中，并避免过量使用，因为已知OCT会对质谱成像（MSI）分析产生不利影响。其他介质（如明胶）也可用于在切片前对组织进行冷冻包埋。9.
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结果
所展示的图像 图4 显示全身组织切片中不同器官内代谢物的空间分布。独特 m/z 使用MSiReader PeakFinder将数值分配至身体的特定区域，随后进行批量处理以生成图像。图像叠加工具（图3-4) 用于将冰基质沉积前拍摄的光学图像与生成的离子图像进行对齐。胆固醇在所有组织类型中均有观察到，这与其在动物细胞膜结构中的作用相符（图 4A），而其他代谢物则在特定器官或组织区室中表现出不同的分布模式（图4B-D).
.......
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讨论
上述方案描述了进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI MSI）实验的关键步骤。基质施加过程（第3节）大约需要20分钟，与通常通过升华或使用自动喷涂仪进行喷雾涂布的MALDI MSI实验中的基质施加过程耗时相近。此外，IR-MALDESI不依赖于分析物在基质晶体中的分配6，且冰基质可普遍适用于所有分析物，无论其质量、大小或化学性质如何。另外，使用冰基质可消除典型MALDI实验中在较低m/z范围内观察到的基质相关离子23。
尽管实验中的所有步骤对于生成高质量的质谱成像数据都是必需的，但在整个实验过程中，电喷雾的稳定性对于可重复的红外基质辅助激光解吸电离（IR-MALDESI）离子生成至关重要。在成像实验过程中需要持续监测相对湿度，以维持稳定的冰基质层。IR-MALDESI解吸对冰层厚度相对不敏感6；然而，某些成像实验可能持续数小时，若不加以监测，冰层可能会带来干扰。为此，近期已在离子源中集成比例-积分-微分（PID）控制器，用于监测密闭腔体内的温度和相对湿度，并根据需要进行调节.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者感谢北卡罗来纳州立大学分子生物医学科学系的 H. Troy Ghashghaei 教授提供完整的小鼠组织。作者还衷心感谢美国国立卫生研究院（R01GM087964）、W.M. Keck 基金会以及北卡罗来纳州立大学提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 红外基质辅助激光解吸电离源（IR-MALDESI） | 定制 | 不适用 | 有关 IR-MALDESI 源开发的深入讨论，请参见参考文献 4 和 12。 |
| Q Exactive Plus | Thermo Scientific | Q Exactive Plus 混合四极杆-轨道阱质谱仪 | |
| 水，HPLC 级 | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| 甲醇，HPLC 级 | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| 甲酸 | Sigma Aldrich | 56302 | |
| 可调谐中红外激光器 | Opotek 公司 | IR Opolette | 波长可调谐 2,700–3,100 nm 红外光参量振荡器（OPO）激光器 |
| 氮气 | Arc3 Gases | AG S-NI300-5.0 | 5.0 级高纯氮气钢瓶（300） |
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM 1950 | 冷冻切片机 |
| 高轮廓切片刀片 | Leica Biosystems | 3802123 | Leica DB80HS |
| 包埋介质（OCT） | Leica Biosystems | 3801480 | Surgipath FSC 22 包埋介质 |
| 冷冻切片机样本盘 | Leica Biosystems | 14047740045 | 直径 40 mm |
| 玻璃显微镜载玻片 | VWR | 48312-003 | 磨砂面，精选，预清洁 |
参考文献
- Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A. Imaging Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 26, 606-643 (2007).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. A. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem. Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C.
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重印与许可
