一种评估半帕金森病大鼠深部脑刺激运动效果的新方法：阶梯测试与圆筒测试

摘要

脑深部电刺激（DBS）是帕金森病的一种有效治疗方案。我们建立了一项研究设计，用于在大鼠中筛选新型刺激范式。该方案描述了在经DBS治疗的偏侧帕金森病大鼠中，使用阶梯测试和圆筒测试进行运动功能评估的方法。

摘要

丘脑底核深部脑刺激是治疗帕金森病的有效方法。在我们的实验室中，我们建立了一种在单侧帕金森病（单侧损毁）大鼠模型中筛选不同神经刺激模式的实验方案。该方案包括通过向右侧内侧前脑束注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）建立单侧帕金森病损毁模型，将慢性刺激电极植入丘脑底核，并在持续24小时的有缆外部神经刺激结束后评估运动功能。刺激采用恒流模式进行，刺激强度设定为个体副作用阈值以下20%。运动功能评估采用Shallert描述的圆筒实验中对自发前爪使用行为的测定，以及Montoya描述的阶梯实验中对精细抓取能力的评估。本方案详细描述了阶梯箱训练、圆筒实验以及在单侧帕金森病大鼠中使用这两种行为学测试的方法。必须同时使用这两种测试，因为阶梯实验对精细运动功能障碍更为敏感，并且在神经刺激过程中对功能变化具有更高的检测灵敏度。结合单侧帕金森病模型与两种行为学测试，可对不同刺激参数进行标准化评估。

引言

丘脑底核（STN）的深部脑刺激是治疗帕金森病¹及其他运动障碍的有效方法。其潜在机制尚不明确且具有多因素性，但关键特征之一是通过刺激电极附近轴突的重复去极化来调节神经元网络活动^2-4。对于大多数脑靶点和深部脑刺激（DBS）适应证，需采用高频（>100 Hz）刺激才能产生有益效果。深部脑刺激的副作用源于其他纤维的意外共激活，这些纤维位于刺激容积范围内，并执行不同功能，例如锥体束。因此，理想情况是开发出能够优先激活有益神经元件、同时避免激活导致副作用元件的刺激参数^5,6。尽管神经生理学可能为DBS提供此类精细调节手段，但在过去二十年中科学进展甚微，主要原因在于临床编程策略主要依赖于患者中的“"试错"方法，且受限于 commercially available DBS 设备有限的编程选项，而非基于神经生理学认知和明确的实验条件系统性地探索完整的参数空间。

为了克服脑深部电刺激（DBS）研究中的转化障碍，我们提出了一种在临床探索之前利用帕金森病动物模型在啮齿类动物中筛选替代刺激参数的实验方案。通过向大鼠右侧中脑束注射6-羟基多巴胺建立单侧帕金森病模型^7,8。由此产生的损伤被称为偏侧帕金森状态，在阿扑吗啡测试中通过低剂量阿扑吗啡注射后评估旋转评分进行评估，并在死后通过酪氨酸羟化酶免疫组织化学加以确认。该方法操作简便、高度可重复，且死亡率和并发症发生率较低。所导致的运动功能障碍非常细微^7,8；动物在自发探索行为和复杂抓握行为过程中均表现出对侧左前肢轻微的功能障碍^9,10。

为了评估深部脑刺激方案的有效性，需要采用能够快速且可靠地测量运动功能变化的测试方法，并可在不同神经刺激参数下重复进行。多个研究团队已提出不同的刺激方法和用于评估大鼠运动功能的测试手段¹¹，但其结果存在高度变异且不一致^11-14。这促使我们必须选择一组具有高预测效度且相互补充的测试方法。此外，在深部脑刺激条件下评估运动功能时，优先选用动物可通过电缆连接刺激发生器即可完成的测试。基于上述目的，我们建立了一套测试组合，包括一项前肢使用不对称性测试和一项精细抓取能力测试。研究设计如图1所示。

对于自发性前肢使用，我们采用Shallert¹⁵描述的圆筒实验，该实验是评估动物在垂直探索过程中前肢使用情况的常用方法，无需对动物进行训练。为了评估更复杂的抓握行为，我们根据Montoya¹⁶建立了阶梯实验，本实验方案参照Kloth¹⁷进行了修改。大鼠需在实验箱中进行为期十二天的训练，学习伸手获取颗粒食物。训练期结束后，可通过统计摄取颗粒的数量（即成功率）来评估其复杂的抓握行为。本文详细介绍了在阶梯箱中的训练过程，以及在正常状态、偏侧帕金森病模型状态和深部脑刺激条件下两种行为学实验的操作与表现。

方案

动物实验已获得维尔茨堡大学和下弗兰肯行政区法定主管部门的批准，符合动物保护指南和欧洲共同体理事会指南（批准编号：55.2-2531.01 76/11）。所有操作均尽可能减少所用动物的疼痛或不适。

注意：电极植入操作如其他文献所述¹⁸。

1. 圆筒实验（图2）

1. 使用0.1%乙酸溶液清洗透明塑料玻璃圆筒（高度：40 cm，直径：19 cm）以进行准备。
2. 准备标有实验日期及每只大鼠编号的卡片。
3. 将两面镜子以90°夹角放置在圆筒后方。
4. 将摄像机置于圆筒前方，确保摄像机与圆筒之间的距离能够清晰拍摄到大鼠的爪子。
5. 将大鼠放入转运箱中。
   注意：实验前应由实验人员对动物进行预处理，以避免应激反应。
6. 使用转运箱将大鼠从饲养笼转移至圆筒处。
7. 将大鼠放入圆筒中（图3）。
   1. 所有行为学测试均应在每天同一时间进行，以避免活动的昼夜节律差异。若动物通过电缆连接刺激发生器，需确保实验过程中电缆未发生缠绕。
8. 按下摄像机上的 "record" 按钮，将标有实验当日日期及大鼠编号的卡片面向摄像机展示，随后开始录像。
9. 五分钟后，将大鼠从圆筒中取出，并使用转运箱将其放回饲养笼中。
10. 使用0.1%乙酸溶液清洁圆筒。
11. 通过回放录像评估大鼠爪子的使用情况，统计左侧和右侧爪子接触筒壁的次数（以爪子使用百分比表示），以及直立次数（以后肢站立，无论是否依靠筒壁支撑）。圆筒实验也可通过适当的软件进行自动分析。
    注意：健康大鼠双侧爪子使用频率基本相等；偏侧帕金森病大鼠因脑损伤导致患侧爪子使用频率降低。

2. 阶梯实验（图4）

1. 获取阶段
   1. 在训练前一天，让动物熟悉楼梯测试中使用的颗粒饲料。
      1. 可选：为提高动物的动机，可采用饮食限制（每日提供10–15 g标准实验室饲料，使体重维持在自由进食水平的90%¹⁶）。然而，实现积极的训练效果并非必须进行食物限制。本研究在未限制食物的情况下进行。
   2. 使用0.1%乙酸溶液清洁透明塑料玻璃楼梯箱（高度：34.5 cm，长度：35.5 cm，宽度：12 cm，窄隔间为6 cm）。注意：楼梯箱为双隔室结构，带有一个抬高的平台和窄隔间内的两级台阶。窄隔间中左侧的台阶只能用左爪触及，右侧的台阶只能用右爪触及。
      注意：标准楼梯箱由两个隔室组成并配有顶盖；若用于通过电缆刺激大鼠的实验，请使用无盖的高型箱体。
   3. 取出楼梯装置，并在每一级台阶的凹槽中各放入8粒45 mg的颗粒饲料。
   4. 重新插入楼梯装置，并在抬高的平台上额外放置8粒颗粒饲料。
   5. 将大鼠放入运输盒中。
   6. 使用运输盒将大鼠从饲养笼转移至楼梯箱。
   7. 将大鼠放入楼梯箱内（图5）。
   8. 五分钟后，使用运输盒将动物从楼梯箱中移出，并放回饲养笼。
   9. 记录从平台以及（可能情况下）右侧和左侧楼梯上被吃掉的颗粒数量。
   10. 通过在每一级台阶的凹槽中重新放入8粒45 mg的颗粒饲料，补充楼梯上的饲料。
   11. 用0.1%乙酸溶液清洁楼梯箱，并在平台上重新放置额外的颗粒饲料。
   12. 连续三天重复此程序（获取阶段）。
       注意：所有描述的实验均在雄性Sprague Dawley大鼠上进行。不同品系、性别和供应商的大鼠，其各训练模块的持续时间可能有所不同。
2. 自由选择测试
   1. 使用0.1%乙酸溶液清洁楼梯箱。
   2. 取出楼梯装置，并在每一级台阶的凹槽中各放入8粒45 mg的颗粒饲料。
   3. 将大鼠放入运输盒中。
   4. 使用运输盒将大鼠从饲养笼转移至楼梯箱。
   5. 将大鼠放入楼梯箱内。
   6. 五分钟后，使用运输盒将动物从楼梯箱中移出，并放回饲养笼。
      记录从右侧和左侧楼梯被吃掉的颗粒数量。
   7. 注意：如果动物在抓取颗粒方面仍有困难，可在平台上额外添加一些颗粒，以便其更容易获取。
   8. 通过在每一级台阶的凹槽中重新放入8粒45 mg的颗粒饲料，补充楼梯上的饲料。
   9. 为下一只动物使用前，用0.1%乙酸溶液清洁楼梯箱。
   10. 连续三天重复此程序（自由选择阶段）。
       注意：本文展示的结果是在各训练模块之间无休息期的条件下获得的。部分研究组倾向于在训练期间安排休息日以促进记忆巩固，从而支持训练过程。
3. 强制选择测试
   1. 使用0.1%乙酸溶液清洁楼梯箱。
   2. 取出楼梯装置，并在左侧楼梯每一级台阶的凹槽中放入8粒（模块前3天）或4粒（模块后续连续3天）45 mg的颗粒饲料。
      1. 在将要产生功能障碍的一侧进行强制选择测试。
         注意：我们对右侧大脑半球造成帕金森病损，因此选择性训练左爪。
   3. 将大鼠放入运输盒中。
   4. 使用运输盒将大鼠从饲养笼转移至楼梯箱。
   5. 将大鼠放入楼梯箱内。
   6. 五分钟后，使用运输盒将动物从楼梯箱中移出，并放回饲养笼。
   7. 记录从左侧楼梯被吃掉的颗粒数量。
   8. 根据训练天数，在每一级台阶的凹槽中补充8粒或4粒45 mg的颗粒饲料。
   9. 为下一只动物使用前，用0.1%乙酸溶液清洁楼梯箱。
   10. 连续六天重复此程序（强制选择阶段）。
4. 数据采集
   1. 按照强制选择模块所述方法进行实验（左侧楼梯每凹槽放置4粒颗粒饲料），连续进行两天。以两天的平均值计算成功率（吃掉的颗粒数量）。

结果

所有动物均进行了死后组织学检查，以验证多巴胺能损伤及电极位置。只有电极定位准确（位于丘脑底核内，图 6）且多巴胺能损伤完全（黑质中多巴胺能神经元损失 >90%）的动物才被纳入结果分析（图 7）。

在损伤条件下进行的圆筒实验显示，损伤侧左前肢的使用率从约 50%（未经处理的健康大鼠）下降至 15.11%（平均值）。在采用帕金森病患者的标准治疗方案（脉冲宽度 60 µsec，刺激频率 130 Hz，持续刺激 24 小时）进行常规刺激后，前肢使用率上升至 21.9%（图 8）。由于标准差较大，该差异在统计学上无显著性。直立次数在假刺激组与刺激组之间未见明显差异，但该参数将在后续研究中作为大鼠活动能力的评估指标予以保留。实验表现显然未受到刺激电缆的影响（图 9）。

讨论

本文介绍了一种用于圆筒试验和阶梯试验的详细训练方案。其中，阶梯试验旨在评估大鼠由于熟练伸抓行为所表现出的复杂抓握动作和精细运动功能^16,17。实验结果以测试期间摄取的颗粒数量表示，属于客观测量指标。该方案可用于帕金森病及其他运动障碍疾病的大鼠模型研究。圆筒试验采用一种简单方法来评估大鼠前肢的使用情况，无需预先训练，且可通过录像进行盲法评估，具有高度标准化的特点。我们在多种行为学检测方法（如开放旷场试验、单颗粒伸抓试验和步态分析）中选择这两种试验，原因如下：这两项试验均能可靠地反映我们在帕金森病模型中诱导出的前肢功能障碍¹⁰，结果相对稳定，并能以高度客观的方式获取。两项试验均可在短时间内重复进行。在阶梯试验中，随着学习阶段的进行，颗粒抓取数量逐渐增加，并最终达到个体化的平台期水平；因此，在达到平台期后，可直接用于评估，无需再考虑因训练带来的随时间推移而改善的表现^16,20。

尽管圆筒实验操作简便，但大鼠可能会变得厌倦和不活跃。可通过黑暗环境（在红光下进行实验）或在明暗周期的后期阶段来提高动物的动机。直立行为的测量有助于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无盖阶梯盒	Glas Keil, 德国		定制
圆柱盒	Glas Keil, 德国		定制
无尘精密颗粒，45 mg	Bio Serv	F0021