RAPID 血液处理方法可用于人类，能够获得更高的肽水平，同时允许对正确的分子形式进行评估。因此，该方法将成为肽类研究中一种有价值的工具。
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摘要
摘要
食物摄入调控领域的研究正日益受到重视。这类研究通常包括对调控食物摄入的肽类物质进行测定。为了准确测定某种肽的浓度，该肽在血液处理过程中应保持稳定。然而，多种肽类物质在内源性肽酶的作用下会迅速降解，难以满足这一要求。近期，我们开发了一种用于大鼠的血液处理方法，该方法结合了低温、酸化、蛋白酶抑制、同位素标记的外源性对照和稀释（RAPID）等步骤。本文中，我们将该技术成功应用于人类，并评估了食欲调控激素的回收率、分子形态及其循环浓度。与标准处理方法（EDTA抗凝血置于冰上）相比，RAPID方法显著提高了125I标记的生长抑素-28（+39%）、胰高血糖素样肽-1（+35%）、酰化饥饿素和胰高血糖素（+32%）、胰岛素和吻素（+29%）、nesfatin-1（+28%）、瘦素（+21%）以及肽YY3-36（+19%）的回收率（p <0.001）。高效液相色谱分析显示，在采用RAPID方法处理后，内源性酰化饥饿素在预期位置出峰；而在标准处理后，62%的酰化饥饿素已被降解，出现较早的洗脱峰，可能代表去酰化饥饿素。经RAPID方法处理后，正常体重受试者血液中酰化/去酰化饥饿素的比例为1:3，而标准处理后为1:23（p = 0.03）。此外，与标准处理相比，RAPID处理后内源性吻素水平也更高（+99%，p = 0.02）。RAPID血液处理方法适用于人类，可获得更高的肽类水平，并能准确评估其分子形态。
引言
鉴于全球肥胖患病率不断上升的趋势1,2，食物摄入调控领域的研究正日益受到重视。迄今为止，已知仅有一种在外周产生并作用于中枢以促进食物摄入的肽，即胃饥饿素（ghrelin）。3在过去的几十年中，已鉴定出多种能够减少摄食量的肽类物质， 例如瘦素、肽YY（PYY）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）以及胰岛素4因此，在研究饥饿与饱腹感调控机制时，通常会检测相关肽类的水平，同时假定所研究的肽在血浆制备过程中具有稳定性且回收率较高。然而，实际情况往往并非如此，因为内源性快速降解会显著影响其稳定性，此前已有研究证实了这一点 例如. 酰化型胃饥饿素降解为去酰化型胃饥饿素5因此，我们近期描述了一种用于大鼠血液处理的 RAPID 方法 R降低的温度， A钙化， P蛋白酶抑制， I同位素标记的外源性对照和 D稀释6该方法提高了12种测试肽段中11种的回收率，并能够确定与标准血液处理（EDTA抗凝血置于冰上）相比的正确循环分子形式6该方法已在多项后续研究中被采用7-12 用于检测循环生长素释放肽及促肾上腺皮质激素释放因子13因此，该方法在啮齿类动物的肽类研究中已被证明具有实用价值。然而，由于啮齿类动物的研究结果并不总能外推至其他物种，该方法也应建立并应用于人类血液中。
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方案
该方案已获得当地人体研究伦理委员会批准（方案编号 EA1/114/10）。
1. 血液处理
- 在隔夜空腹后，于上午 07:00 至 08:00 之间从前臂静脉采集静脉血，并根据标准程序或 RAPID 方法进行处理。要求受试者在采血前避免运动和吸烟。
- 对于标准处理，将血液采集至预冷的含 EDTA 管中，并在 10 分钟内于 4 °C 以 3,000 x g 离心 10 分钟。收集上清液，并在进一步进行放射免疫分析前保存于 -80 °C。
- 对于 RAPID 处理，在采血后 1 分钟内立即用冰浴缓冲液（pH 3.6）将血液按 1:10 比例稀释，缓冲液含 0.1 M 醋酸铵、0.5 M NaCl 及酶抑制剂（diprotin A、E-64-d、antipain、leupeptin、chymostatin，各 1 µg/ml）。随后在 10 分钟内于 4 °C 以 3,000 x g 离心 10 分钟，并使用移液器将上清液收集至聚丙烯管中，具体操作如先前在大鼠中所述6。
- 使用 100% 乙腈（流速 10 ml/min）对层析柱（360 mg，55-105 µm）进行活化，再用 0.1% 三氟乙酸（TFA，流速 10 ml/min）平衡，并使用注射泵以恒定流速 1 ml/min 上样上清液。
- 随后用 3 ml 0.1% TFA（流速 10 ml/min）洗涤层析柱，并用含 0.1% TFA 的 70....
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结果
与标准血液处理相比，快速血液处理（RAPID）可提高人全血中125I标记肽的回收率。
在标准血液处理（EDTA抗凝血置于冰上）后，9种肽中有9种的放射标记肽回收率约为60%（范围为48–68%，图1A–K）。RAPID处理使所有125I标记肽的回收率均得到提升，具体表现为：生长抑素-28（+39%，图1A）、胰高血糖素样肽-1（+35%，图1B）、酰化饥饿素（正辛酰饥饿素，+32%，图1C）、胰高血糖素（+32%，图1D）、胰岛素（+29%，图1E）、吻素（+29%，图1F）、神经降压素-1（+28%，图1G）、瘦素（+21%，图1H）以及肽YY3-36（+19%，.......
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讨论
我们此前曾报道，在大鼠中，与标准血液处理方法相比，RAPID 血液处理方法可提高 12 种肽中 11 种的回收率6。在本研究中，我们证明该方法同样适用于人类。经 RAPID 处理后，所检测的 9 种 125I 标记肽的回收率均优于标准血液处理方法（EDTA 抗凝血置于冰上）。观察到的回收率提升幅度为 19–39%，这一差异可能具有重要意义，尤其是在预期差异较小时更为关键，因为当肽的回收率较低时，微小差异可能会被掩盖。
我们还发现，在快速（RAPID）血液处理后，经高效液相色谱（HPLC）检测，ghrelin 在正确的洗脱位置被检测到，表明其分子形式正确（酰化型 ghrelin）；而在标准血液处理后，约有三分之二的 ghrelin 降解为去酰化型 ghrelin。由于酰基对于 ghrelin 与其受体的结合至关重要28，去酰化预计将显著改变该肽段的生物学功能。然而，越来越多的研究也认识到去酰化型 ghrelin 本身具有生物学活性29。有趣的是，已有研究提示去酰化型 ghrelin 可能拮抗 gh.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会 STE 1765/3-1（A.S.）和德国联邦教育与研究部 03IPT614A（C.G.）资助。我们感谢 Reinhard Lommel 和 Petra Buße 提供出色的技术支持，同时感谢 Karin Johansson 和 Christina Hentzschel 在人体测量数据的组织与实施过程中提供的帮助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二肽基肽酶抑制剂A（Diprotin A） | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| 抑氨肽酶素（Antipain） | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| 亮抑蛋白酶肽（Leupeptin） | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| 抑胃蛋白酶肽（Chymostatin） | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 小柱 | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| 酰化饥饿素（Acyl-ghrelin） | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | 放射性 |
| 胰高血糖素样肽-1（GLP-1） | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | 放射性 |
| 胰高血糖素（Glucagon） | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | 放射性 |
| 胰岛素（Insulin） | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | 放射性 |
| 瘦素（Leptin） | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | 放射性 |
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | 放射性 |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | 放射性 |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | 放射性 |
| 生长抑素-28（Somatostatin-28） | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | 放射性 |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 色谱柱 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 高效液相色谱系统，包含多个组件，因此无单一货号 | |
| Kisspeptin 放射免疫分析试剂盒（RIA） | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | 放射性 |
| 总饥饿素放射免疫分析试剂盒（Total ghrelin RIA） | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | 放射性 |
| 活性饥饿素放射免疫分析试剂盒（Active ghrelin RIA） | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | 放射性 |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | 在线下载 |
参考文献
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P.
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