聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

摘要

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。

摘要

聚糖是由一类称为糖基转移酶的酶通过非模板驱动过程合成的，在多种重要的细胞内和细胞外事件中发挥关键作用。许多病理状态（尤其是癌症）会影响基因表达，进而导致糖苷水解酶和糖基转移酶的相对丰度及活性水平失调。由失调的糖基转移酶（或其组合）产生的独特异常完整聚糖，常以痕量形式存在于复杂的生物流体中，使其检测变得困难且有时具有随机性。然而，通过适当的样品制备，质谱技术中最古老的形式之一——气相色谱-质谱联用（GC-MS）——能够常规检测复杂生物流体中存在的分支点和连接特异性的单糖单元（“聚糖节点”）。与传统的自上而下式糖组学技术相辅相成，本文讨论的方法涉及将样品中每个组成单元的聚糖节点收集并浓缩为单一独立的分析信号，从而提供关于整体糖组变化的详细结构和定量信息，并揭示可能失调的糖基转移酶。本文所提供的甲基化修饰及后续液/液萃取步骤的改进，通过尽量减少全甲基化聚糖暴露于碱性水相条件的时间，提高了实验的重复性和总体产率。对乙酰化步骤的优化进一步提升了反应程度和总体产率。尽管该方法具有良好的重复性，但结果显示，N-乙酰己糖胺（HexNAc）部分甲基化醇乙酸酯（PMAA）的总体产率本质上仍低于其相对于己糖PMAA的理论预期值。通过计算每个单独的己糖PMAA（或HexNAc PMAA）在提取离子色谱图（XIC）中的峰面积与其对应所有己糖（或HexNAc）XIC峰面积总和的比值，可建立一种新的归一化方法，从而实现对样品中各个聚糖节点的相对定量。尽管该方法在当前的绝对检测限方面仍存在一定限制，但它显著加快了临床生物流体的分析速度，并作为传统自上而下式糖组学的补充手段展现出广阔的应用前景。

引言

糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖和氨基聚糖构成了四类主要的复杂且具有异质性的碳水化合物，统称为聚糖。作为细胞质膜、糖萼以及细胞外基质和体液中普遍存在且不可或缺的组分，聚糖参与多种多样的生物化学过程，包括内吞作用、细胞内转运、细胞运动、信号转导、分子识别、受体激活、细胞黏附、宿主-病原体相互作用、细胞间通讯、免疫监视以及免疫应答的启动¹。在几乎所有生命领域中均存在一类被称为糖基转移酶的酶，它们通过与糖苷水解酶（也称为糖苷酶，负责降解聚糖）协同作用，构建、重塑并最终生成成熟的聚糖聚合物²。尽管每种糖基转移酶可能作用于不同的糖缀合物，但通常情况下，糖基转移酶通过将特定活化核苷酸糖供体（例如，GDP-岩藻糖）中的单糖部分转移至某一类亲核受体（例如，脂质、多肽、核酸或正在延伸的寡糖链）上，形成具有特定连接方式和异头构型的糖苷键。据估计，超过50%的蛋白质（尤其是膜蛋白和分泌蛋白）在翻译后会经历糖基化修饰³。初步的组合计算有助于理解糖基化赋予糖蛋白的高度变异性、多功能性和特异性；例如，若一个多肽底物仅有10个糖基化位点，且每个位点均可与3种不同单糖还原端中的任意一种形成糖苷键，则理论上最终的糖蛋白可呈现3¹⁰ = 59,049种不同的结构形式。在糖蛋白中，糖苷键通常与Asn-X-Ser/Thr序列中天冬酰胺残基侧链上的氮原子相连，形成N-聚糖²，或与丝氨酸和苏氨酸残基侧链上的羟基相连，形成O-聚糖⁴。一个细胞的糖组（即其全部糖基化产物的集合）具有独特性并受到限制，因为除少数例外情况外，糖基转移酶对供体、受体及连接方式均表现出严格的特异性⁵。许多病理状态，尤其是癌症和炎症性疾病，会导致糖基转移酶的表达和活性异常，进而引起重要且丰富的血浆糖蛋白发生异常糖基化^6–24

主要由于表观遗传因素，糖组（glycome）的多样性、动态性和复杂性显著高于蛋白质组和转录组。^25,26 尽管哺乳动物基因组中仅有约1%的基因参与糖链的形成、修饰和组装过程，²⁷ 糖基化过程并不依赖模板进行，这与多肽和核酸的生物合成有明显区别。糖基化酶的相对数量与活性，以及营养物质和前体物质的可获得性等环境因素之间的相互作用，最终决定了糖基化的性质、速率和程度。^5,28 胚胎发生（例如，细胞命运决定与分化）、细胞活化以及细胞周期的进程均会影响基因表达（即转录与翻译），从而改变可用糖基转移酶的种类和数量，而这些酶的活性是决定细胞糖链谱型的直接上游因素。由于癌细胞的某些增殖、黏附和侵袭特性与普通胚胎细胞相似，糖链生物合成通路中的特定改变（例如，前体物质积累、表达失调、异常修饰、结构截短或新结构生成）可作为通用的癌症生物标志物，用于指示肿瘤发生、发展、迁移和侵袭的不同阶段。²⁹ 尽管糖基化过程极为复杂，但显然仅有少数几项糖基化改变即可促进癌变和转移；某些"异常"糖基化产物确实有助于癌细胞逃避免疫识别，并在不利的血管内及转移环境中适应迁移需求而存活下来。^28,30,31 不足为奇的是，实验已表明，干扰或阻止异常的基因表达模式和异常糖链的形成，能够抑制肿瘤发生。²⁹ 然而，在生物流体样本（例如，尿液、唾液、血浆或血清）中检测到的异常糖链可能并非癌症（或其他疾病）的直接指标，而更可能是免疫系统发生细微但显著变化的下游结果，或是某一不可预测器官中恶性病变所导致的可量化后果。³²

尽管基于分子相互作用的糖组学技术（例如凝集素/抗体芯片以及代谢/共价标记）能够提供有关糖组的普遍信息，但这些方法依赖于对完整糖链结构的检测，无法提供关于单个糖链的详细结构信息。相比之下，质谱法（MS）能够帮助鉴定和定量单个糖链结构，并揭示其与多肽核心的连接位点等结构信息。单一糖基转移酶的表达或活性失调即可在多个糖基化通路中引发一系列有害的分子事件。由于每种糖基转移酶可能作用于多种糖缀合物底物，并参与不同生长中糖链聚合物的合成，因此失调的生物合成级联反应会导致某一种糖链产物异常大量增加，同时在细胞内或细胞外液体中产生多种异质性的异常糖链³³。然而，由于与大量正常调控的糖链相比，这些独特的异常糖链仅占极小比例，即使使用高灵敏度的质谱技术也常常难以检测，因此它们有时被认为不适合作为癌症或其他糖链相关疾病的生物标志物。例如，在细胞内和细胞外体液中，蛋白质浓度范围极广（跨越八个数量级），高丰度蛋白可能掩盖低丰度糖蛋白，从而阻碍其检测³²。此外，测定糖基转移酶活性仍面临重大的实践与理论挑战，因为许多糖基转移酶在临床体液中缺失，或在体外（ex vivo）失去活性。尽管持续检测和定量极微量的独特完整糖链存在困难，质谱技术的研究人员已在将完整糖链用作临床标志物方面取得了巨大进展。我们近期开发了一种分析完整糖链的互补方法，该方法利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），可检测赋予每种糖链独特性的所有组成分支点及连接特异性单糖（"糖链节点"），这些单糖在许多情况下可直接作为分子替代物，用于量化致病糖基转移酶的相对活性。

自1958年首次报道将气相色谱法（GC）直接应用于聚糖分析以来，该技术已被证明是分析全甲基化单糖和二糖的有力手段³⁴，可用于确定其异头构型和绝对构型，并实现分离以进行后续质谱分析³⁵。1984年至2007年间，Ciucanu及其同事开发并优化了一种基于固相的聚糖全甲基化技术，该方法采用氢氧化钠和碘甲烷，随后通过水和氯仿进行液-液萃取以分离全甲基化的聚糖^35,36。2005年至2008年间，Kang及其合作者在全甲基化步骤中引入了一种节省时间的离心柱方法^37,38。2008年，Goetz研究组设计了一种基于基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱的定量固相全甲基化聚糖谱型分析方法，用于比较并可能区分侵袭性和非侵袭性乳腺癌细胞³⁹；随后在2009年，Goetz团队结合酶法与化学释放技术，在强碱性固相全甲基化体系中从完整糖蛋白上裂解O-聚糖⁴⁰。尽管Goetz方法实现了O-聚糖的同时全甲基化与化学释放，但其仅适用于预先分离的糖蛋白。我们在2013年对该技术进行了改进，并通过引入三氟乙酸（TFA）水解、还原和乙酰化步骤，将其适配于未经分级的完整生物流体及匀浆组织样本³³。这些额外步骤还可从糖脂以及糖蛋白的N-连接聚糖中释放聚糖，并将其转化为部分甲基化的醛糖醇乙酸酯（PMAAs，图1），其特有的甲基化与乙酰化模式有助于通过GC-MS进行分析，并可独特表征原始完整聚糖聚合物中的各个聚糖结构单元⁴¹（图2）³³。最终，该方法能够基于对独特聚糖特征（如"核心岩藻糖基化"、"6-唾液酸化"、"双分叉GlcNAc"和"β1-6分支"）的直接相对定量，生成复杂生物流体中所有聚糖的综合图谱——每个特征均源自单一GC-MS色谱峰。本文进一步优化了全甲基化、乙酰化、分离和纯化步骤，并改进了相对定量方式。

方案

注意：避免皮肤或眼睛接触本实验所用的任何试剂。一旦接触，应立即用大量清水冲洗受影响部位，并尽快寻求医疗建议。

1. 全甲基化和糖链提取

1. 柱层析准备
   1. 根据待分析样品的数量，准备相应数量的微量离心柱单元。折断并取下塑料储液管的管盖。在每个储液管中放入一个微量离心微型滤器。将组装好的微量离心柱（含微型滤器）放入微量离心管架中。
   2. 获取氢氧化钠（NaOH）颗粒（20-40目）的储备品。取部分NaOH转移至小称量舟中；若因湿度导致结块，可将其转移至预热的瓷研钵中作为工作用NaOH储备。避免使用结块的NaOH或破碎/粉末状的NaOH颗粒。
      注意： NaOH 是一种强效毒素和腐蚀性碱。若皮肤或眼睛接触，应立即用清水冲洗 15 分钟。实验结束后，须彻底清洁实验台面。
   3. 使用小药勺或刮勺，将工作储备的 NaOH 颗粒转移至微量离心微型滤器中，使 NaOH 填充至第一道外侧斜面处（距 rim 约 5 mm）。将装填好的微量离心滤器轻敲实验台面，以压实/密实 NaOH 颗粒。
      注意： 在整个实验过程中，为尽量减少吸湿性 NaOH 颗粒对水分的过度吸附，应保持所添加液体的液面高度例如， 乙腈、二甲基亚砜、分析物溶液）置于 NaOH 柱填料表面之上，并尽量减少与空气的直接接触。
   4. 获取乙腈（ACN）储备液。将约 350 µl ACN 转移至每个装有 NaOH 的微型离心过滤器中。保持 NaOH 始终浸没在 ACN 下，并用尖端压扁的加样枪头搅拌以去除大气泡。
      注意： 乙腈是一种易燃刺激物。
   5. 柱式离心
      1. 将微量离心柱对称地放置在离心机内；必要时使用平衡管。避免将氢氧化钠颗粒洒入离心机内部。关闭离心机盖。
      2. 离心柱子（含 NaOH 和 ACN）约 15 秒，2,400 × g.
      3. 离心结束后，从离心机中取出微量离心柱，将乙腈弃入有害废物容器中。保持氢氧化钠柱填料完整。
   6. 向每个装有 NaOH 的微型离心过滤器中加入约 350 µl 二甲基亚砜（DMSO）。保持 NaOH 始终浸没在 DMSO 中，并用移液器吸头去除任何较大的气泡。如前所述，以 2,400 × g 离心约 15 秒，弃去 DMSO，同时保持 NaOH 填料完整。
      注意： DMSO 是一种诱变剂和刺激物，可通过皮肤轻易吸收。
   7. 用离心过滤套件中附带的塞子将所有微量离心小滤器堵住。向每个装有NaOH的微量离心小滤器中转移约350 µl DMSO，并使用200 µl移液枪头去除NaOH填料中的气泡，确保DMSO渗透到NaOH填料的所有区域。避免压碎或过度刮擦NaOH微珠；应避免产生NaOH粉末。此步骤应尽快完成。
2. 血浆质量控制（QC）样本的制备
   注意： 为确保不同实验批次间结果的一致性，建议在每个批次中使用至少一份来自大量、均质的待测生物材料总体样本的等分试样。例如，若分析血浆，则在每个批次中使用血浆总体样本的等分试样作为质量控制（QC）样本。QC样本的处理方式应与未知样本完全相同。
   1. 将质控血浆的储备样本在约10,000 × g条件下离心4分钟。离心过程中，部分高密度沉淀物可能沉降至管底，部分低密度沉淀物可能浮至血浆上层。分装血浆时应避免接触上述沉淀物。
   2. 继续进行 "1.3）样品制备" 如下所述。待血浆离心完成后，再返回此步骤。
   3. 吸取9 µl离心后的QC血浆，转移至适当标记的1.5 ml聚丙烯带盖离心管（以下简称 "1.5 ml 塑料离心管"。向每份等分试样中加入1 µl去离子水；如有需要，可将其用作内标物的载体。
   4. 向该血浆对照中加入 270 µl DMSO。涡旋振荡以确保完全溶解。
3. 样品制备
   1. 根据生物（分析物）样本的数量，准备相应数量的1.5 ml塑料离心管。
   2. 将每份生物学（分析物）样品各取 9 µl 转移至对应的 1.5 ml 塑料离心管中。向每个样品管中加入 1 µl 去离子水和 270 µl DMSO。
   3. 剧烈混合（例如， 涡旋振荡和/或反复吹打混匀样品，以确保其在DMSO中完全溶解。
      注意： 在通风橱内执行以下步骤。后续步骤中使用的碘甲烷（CH₃I），二氯甲烷（CH₂Cl₂，又称二氯甲烷），以及氯仿（CHCl_3, 三氯甲烷）是易挥发液体，能够溶解某些类型的塑料（例如， 腈类手套）。务必使用耐溶剂手套。由于这些试剂黏度低且蒸气压高，在转移过程中可能从移液器吸头处滴落。为减少试剂损失和潜在暴露风险，应将储备溶液容器紧靠接收容器进行操作。
   4. 将足量的碘甲烷转移至一个洁净的小管中。每个分析样品需要105 µl碘甲烷。将约500 µl二氯甲烷转移至另一个洁净的试管中。为防止注射器堵塞，在转移碘甲烷后应立即用二氯甲烷冲洗注射器。
      注意： 碘甲烷具有光敏性、易挥发，且为强效毒素，若吸入或摄入可损害中枢神经系统或导致死亡。二氯甲烷为潜在致癌物、生殖致突变物，且为强刺激物，可损害多个器官或导致死亡。
   5. 使用分析用注射器向每个分析物样品中加入105 µl碘甲烷。立即盖紧分析物管，以尽量减少碘甲烷挥发。充分涡旋混匀所有样品，必要时短暂离心，确保管盖内无液体残留。任何颜色变化（例如， 变为棕色、紫色或黄色）表明碘甲烷已降解，可能影响后续的完全甲基化反应。
   6. 用二氯甲烷冲洗用于转移碘甲烷的分析用注射器至少3次，以防止堵塞。将此冲洗液连同多余的碘甲烷和二氯甲烷一并弃置于有机有害废物容器中。将使用过的试管放入有害废物容器中。
   7. 获取一套新的 2 ml 塑料储液管。如需要，可移除卡扣盖。
   8. 拔下微型离心过滤器的堵头。将拔下堵头的滤柱在2,400 × g下离心15秒，然后弃去储液管及其中的DMSO流出液。
   9. 重新将离心后的离心柱插入，并放入新的储液管中。用相同的样品编号对每个离心柱及其对应的储液管进行编号。确保微型滤芯插头拧紧；可能的泄漏会影响下一步操作。尽量缩短从离心柱中移除DMSO与将分析物样品转移至离心柱之间的时间间隔。
   10. 完全甲基化
       1. 将每份样品溶液定量转移至相应装有 NaOH 微珠的微量离心柱中。此步骤使用 1,000-μl 吸头。转移完成后，将一个约 200 μl 吸头的尖端剪去约 2 mm，并将其留在柱内溶液中作为搅拌子。对所有样品重复此操作。
          注意： 碘甲烷的低黏度可能导致样品损失，因为分析物溶液在转移过程中可能从移液枪头滴落。用一只手将样品管和离心柱并排固定，另一只手迅速转移样品溶液。
       2. 让甲基化反应进行11分钟。在此期间，每份样品至少搅拌4–5次。为促进在NaOH小球表面高效发生完全甲基化反应，可使用尖端压扁的凝胶加样枪头作为搅拌棒，轻柔混匀柱内物质。剧烈混合可能导致离心过滤管破损，使NaOH小球破碎并悬浮（这会降低后续液-液萃取的效率），和/或造成样品损失（因吸附样品的NaOH颗粒可能从柱中溢出）。
       3. 为后续的液/液萃取步骤做准备，配制足量的0.5 M氯化钠（NaCl）溶液于0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中，室温保存。每个样品在全部三次液/液萃取循环中总共需要约12 ml NaCl溶液。
       4. 完成11分钟的全甲基化反应后，立即但小心地拔下柱子，并在2,400 × g下离心15秒。弃去塞子。
   11. 立即从离心机中取出离心柱，并将其放入一组新的空离心收集管中，留下含有新甲基化糖链的穿流液。请勿丢弃任何组分。
   12. 尽快向干燥且已加入 NaOH 的旋转滤器中加入 300 µl 乙腈（ACN）。在 9,600 × g 条件下离心旋转滤器 30 秒。
   13. 紧接着，将主要的完全甲基化溶液转移即将上一步中与NaOH小球孵育11分钟后，经离心过滤器离心至离心管中的溶液，转移至硅化处理的13 × 100 mm玻璃试管中⁴² 加入3.5 ml含0.5 M NaCl的0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0），立即混匀（涡旋）。此步骤中避免转移任何白色固体残留物。每个样品均需如此处理，然后进行下一步。
   14. 立即转移（合并）每个储液管中的乙腈穿流液至相应硅化玻璃管中剩余的液体样本中，并立即混合（涡旋）。此步骤中应避免转移任何白色固体残留物。盖紧玻璃管，振荡并涡旋混匀。对每个样本重复上述操作。将NaOH柱和巴斯德移液管弃置于适当的废弃物容器中。
4. 液/液萃取与糖链纯化
   1. 在通风橱内，向每个样品中加入1.2 ml氯仿。随后立即盖紧硅化玻璃管，并剧烈振荡混合内容物。
   2. 将金属块预热至约 75 °C，使用可容纳 13 mm × 100 mm 玻璃管的带孔加热块，置于蒸发歧管中。
   3. 获取一套新的硅化巴斯德吸管、非硅化巴斯德吸管以及带盖硅化玻璃试管。
      注意： 氯仿（CHCl₃）₃) 是一种刺激物、致突变物和潜在致癌物，可穿透某些类型的手套。
   4. 将装有样品的玻璃管短暂离心（约3,000 × g），以分离水相和有机相。
   5. 使用非硅化巴斯德吸管吸取上层水相，直至剩余约3 mm的水相覆盖在下层有机相之上。
   6. 向每根玻璃管中加入3.5 ml 0.5 M NaCl溶液（溶于0.2 M磷酸钠缓冲液，pH 7），剧烈混匀后短暂离心（约3,000 × g）。与前一步骤（1.4.3）相同，使用未硅烷化的巴斯德移液管吸取水相层。
   7. 重复之前的步骤（1.4.4），但保留约 1 ml 的水相。
   8. 使用洁净的硅化巴斯德移液管将有机层转移至洁净且标记妥当的硅化13×100 mm玻璃试管中。为避免水相污染，请按以下方式提取：
      1. 一只手同时握住当前的和新的硅烷化玻璃试管，另一只手按压移液器球以产生气泡，同时将移液器插入水层下方。
      2. 进入有机相后，停止产生气泡，保持移液管球部稳定，使有机相和水相重新稳定并分层。随后缓慢释放球部，尽可能吸取有机相，避免混入水相污染。
      3. 迅速将移液器吸头穿过水相层，并在将移液器从管中取出时，克制住轻微松开球状吸头（这会导致吸入部分水相污染物）的自然反射动作。
      4. 迅速将低粘度有机层转移至相邻的新离心管中。若有水相污染，在新玻璃管中提取的有机层表面将可见微小液滴。若观察到水相或NaCl污染，可用移液器去除；必要时可离心，使水相液滴聚集成单个液滴后再移除。
   9. 妥善处理废弃的玻璃试管、移液管以及水相和有机废液。清洗并回收玻璃试管帽。
   10. 在通风橱内，将所有样品置于预热至 75 °C 的蒸发装置中，用温和且持续的氮气流吹干，约 5 分钟。为确保在全程干燥过程中实现蒸发冷却，氮气流应温和且持续，足以扰动液体表面，但不得引起液体飞溅或喷溅。待最后一个样品完全干燥后，立即从蒸发装置中取出样品。若干燥后的玻璃管底部出现白色斑点，表明存在缓冲液/NaCl 污染。
   11. 如果当天剩余时间不足以完成TFA水解步骤，请在此暂停实验流程。暂时地（即，过夜）将干燥样品于 -20 °C 保存。如需在储存后继续实验，从 -20 °C 冰箱中取出样品，待其完全升温后再打开盖子。
   12. 样品加热的同时，为下一步三氟乙酸（TFA）水解做准备，调节加热套温度，使试管内液体内容物温度升至121 °C。使用TFA储备液配制TFA溶液（见下文步骤2.1）。

2. 三氟乙酸（TFA）水解

注意：三氟乙酸（TFA）是一种具有腐蚀性的有机酸，且为有毒刺激物。

1. 在去离子水中配制足量的 2.0 M TFA 溶液。每个分析样品需要 325 µl 的 2.0 M TFA 溶液。浓 TFA 的浓度为 13.0 M。
2. 向每个分析样品中加入 325 µl 的 2.0 M TFA 溶液。为防止后续干燥步骤（见下文 2.3）中 TFA 挥发和样品损失，加入 TFA 后应立即 tightly cap 每个样品管。在所有玻璃管上标记溶液液面位置。下一步操作前，充分涡旋混匀每个样品。
3. 将 tightly capped 的样品管置于预热的加热块或烘箱中，在 121 °C 下孵育 2 小时，使样品内容物达到该温度。若使用加热块而非烘箱，需用铝箔覆盖样品管，以防止 TFA 在管顶冷凝以及样品残渣在管底部分干燥。20–30 分钟后检查样品溶液液面，确保 TFA 挥发最少。如有必要，进一步拧紧管盖或更换更严密的管盖。
4. 在等待 2 小时孵育期间，为下一步（见下文 2.4）设置另一台蒸发仪，温度调至 75 °C。
5. 2 小时加热结束后，在 75 °C 下用温和的氮气流干燥样品约 15 分钟。干燥过程中，样品看护时间不得超过 15 分钟。应频繁检查样品，一旦所有样品完全干燥，立即停止加热和干燥。
6. 若当天剩余时间不足以完成还原步骤，可在此暂停实验流程。将样品临时（i.e.，过夜）储存于 -80 °C。若需在储存后继续实验，从 -80 °C 冰箱中取出样品，待其完全升温后再打开管盖。

3. 还原

1. 在通风橱内，配制足量的10 g/L硼氢化钠（NaBH₄）的1 M氢氧化铵（NH₄OH）溶液。每个样品需要475 µl该溶液。每批样品均需配制新鲜溶液。浓氢氧化铵（27–30% w/w NH₃）浓度约为14.5 M。
   注意：硼氢化钠（NaBH₄）为吸湿性、遇水反应的有毒物质，具有强刺激性，接触水后会释放高度易燃蒸气，吸入、摄入或接触眼睛/皮肤可导致严重灼伤。
   注意：氢氧化铵（NH₄OH）为腐蚀性刺激物和有毒物质，吸入、摄入或接触眼睛/皮肤可引起严重灼伤及不可逆的器官损伤。一旦接触，应立即用清水冲洗受影响区域30分钟，并防止受害者揉搓或抓挠受损部位。
2. 向每个样品中加入475 µl 10 g/L NaBH₄（溶于1 M NH₄OH）溶液。充分混匀样品以溶解任何残留物。盖紧试管盖，使还原反应持续进行1小时。
3. 在等待1小时期间，将加热蒸发装置设定为75 °C。使用带有合适孔位的加热块以适配玻璃试管（见下文3.4节）。
4. 当1小时反应结束后，向每个样品中加入63 µl甲醇（MeOH）。此步骤及后续步骤可将残余硼以三甲基硼酸酯形式去除——该物质为相对易挥发的液体，沸点为68 °C。
5. 在预热的蒸发装置中，于75 °C下通入温和的氮气流将样品干燥约15分钟。需频繁检查样品，切勿无人看管。若玻璃试管底部仍存在微小液滴，则表明样品尚未完全干燥。
   注意：为区分气泡与液滴，可倾斜试管观察。仅液滴会在倾斜后移动；但反之不总是成立：若气泡未移动，仍可能为（极小的）液滴。
6. 样品完全干燥后，配制甲醇（MeOH）与乙酸（AcOH）按9:1（v/v）比例混合的溶液。向每个样品中加入125 µl该MeOH:AcOH混合溶液。
7. 将样品置于预热的蒸发装置中，在75 °C下通入温和氮气流继续干燥。
8. 当样品完全干燥后，在室温下进行20分钟真空干燥：将样品放入塑料真空容器（如FoodSaver品牌产品），盖上真空盖，将真空旋钮调至"vacuum"，连接真空管并启动真空泵。拆卸时按相反顺序操作。在尝试打开真空盖前，需等待系统完全泄压。
9. 若当天时间不足无法完成还原步骤，可在此处暂停实验流程。将样品临时（即过夜）保存于-80 °C条件下。储存后若需继续实验，需从-80 °C冰箱中取出样品，并在打开管盖前使其完全回温至室温。
10. 在等待样品进行真空干燥（或储存后回温）期间，准备下一步所需的试剂。为每个样品准备并编号一个硅烷化锥底自动进样瓶（AS瓶）（带瓶盖）。同时，预热浅孔AS瓶加热块和深孔玻璃试管加热块，使玻璃试管内容物温度达到50 °C。

4. 乙酰化（在通风橱中进行）

1. 向每个样品中加入 18 µl 去离子水。盖紧盖子，充分涡旋所有离心管，以完全溶解任何沉淀物。
2. 向每支玻璃管中加入 250 µl 乙酸酐。盖紧盖子，充分涡旋，并在水浴中超声处理 2 分钟，以确保所有残留物和沉淀物完全溶解。
3. 用铝箔包裹玻璃管，于内部温度 50 °C 条件下孵育 10 分钟。
4. 向每个样品中加入 230 µl 浓三氟乙酸（TFA）。立即盖紧盖子并混匀样品。然后将样品（用铝箔覆盖）在内部温度 50 °C 条件下孵育 10 分钟。
5. 孵育结束后，向每个样品中加入 1.8 ml 二氯甲烷（CH₂Cl₂）。盖紧盖子，充分混匀。
6. 向每个样品中加入 2.0 ml 去离子水。盖紧盖子，充分混匀样品。以 0 至 3,000 × g 离心，使液层分离。使用未硅烷化的巴斯德移液管，按照步骤 1.4.6 所述进行液-液萃取，避免引入水分污染。
7. 重复萃取一次，共进行两次萃取。使用 硅烷化 的巴斯德移液管将有机层转移至已标记的 硅烷化 AS 小瓶（牢固地置于 AS 架中），将 AS 小瓶填充至略低于瓶口处。
8. 使用预热的浅孔加热块，在 40 °C 条件下通入氮气吹干样品（在 AS 小瓶中）15 分钟。切勿过度干燥。最终产物称为部分甲基化醛糖醇乙酸酯（PMAAs）。

5. 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

1. 将每个样品用100 µl丙酮重悬，并充分混匀。使用自动进样器将每份样品1 µl以分流模式注入气相色谱分流衬管（保持在280 °C，内含一小段硅烷化玻璃棉）。分流比设为40。载气采用氦气，以恒定流速0.8 ml/min，经30 m DB-5ms气相色谱柱（内径0.25 mm，膜厚0.25 µm）进行分离。
2. 将初始GC进样口温度保持在165 °C，持续0.5 min。初始保持时间结束后，设置程序升温：每次运行时，以10 °C/min的速率将温度从165 °C升至265 °C（耗时10 min），随后立即以30 °C/min的速率将温度从265 °C升至325 °C（耗时2 min），并在325 °C维持3 min。每个样品的总运行时间为15.5 min。
3. 使用经过适当调谐和校准的质谱仪，对从气相色谱柱洗脱的样品组分进行电子轰击电离（EI，70 eV，250 °C）。对于飞行时间（TOF）质谱分析器，分析产生的碎片离子 m/z 40 至 m/z 800，脉冲积分时间为0.1秒。设定电子轰击（EI）灯丝溶剂延迟时间为2.5分钟。

6. 数据分析

1. 若使用飞行时间（TOF）质谱分析器，通过应用0.15 Da的质量窗口，对每种PMAA最丰富和/或具有诊断意义的碎片离子求和，以获得提取离子色谱图。每种PMAA的目标离子已在其他文献中发表³³，但以下内容已作修改：t-Glc离子现为145.1 + 205.1；2-Man离子为161.1 + 189.1；3-Gal离子为161.1 + 233.1；6-Gal离子为161.1 + 189.1 + 233.1；2,6-Man离子为189.1；3,6-Man离子为189.1 + 233.1。
2. 使用QuanLynx或其他软件自动积分每个求和后提取离子色谱图的峰面积。
3. 通过查看每个已积分的提取离子色谱图，手动验证积分结果。然后将峰积分数据导出至电子表格，进行进一步分析和数据归一化处理，即将每种单个己糖XIC的面积除以所有己糖XIC面积的总和；同理，将每种单个HexNAc XIC的面积除以所有HexNAc XIC面积的总和。该步骤可得到每种单个己糖和HexNAc的归一化丰度。

结果

总离子流色谱图（TIC）显示了人血浆样本在正确完成全甲基化、水解、还原和乙酰化反应后的结果，同时展示了两个关键的全甲基化步骤操作不当时的情况，如图3所示。

氨基己糖相对于己糖的绝对得率：

N-乙酰基己糖胺（HexNAc）的部分甲基化醇乙酸酯（PMAAs）产率通常低于己糖。⁴³ 为估算HexNAc相对于己糖的绝对产率，分析了六份每份10 µg的N-乙酰乳糖胺（一种Gal1-4GlcNAc二糖）溶于10 µl水中的样品。对末端半乳糖（t-Gal）和4-GlcNAc的总离子流（TIC）峰面积进行积分。4-GlcNAc占t-Gal与4-GlcNAc总量的百分比为11.3 ± 0.7%（标准误，SEM）。尽管HexNAc的产率具有可重...

讨论

通常，由己糖成功制备部分甲基化醛糖醇乙酸酯（PMAAs）所面临的困难较少，且方法更为稳健，相较于成功制备 N-N-乙酰基己糖胺（HexNAc）PMAAs。该现象在本实验流程的每一步骤中所涉及的确切机制尚不明确，但必然与独特的化学性质相关 N乙酰基（而非羟基），这是与己糖相比，己糖胺（HexNAcs）所特有的基团。该现象在酸水解中的作用机制已在其他文献中加以阐述。⁴³ 总之，其能力在于 N甲基乙酰胺基在酸水解过程中带正电荷，使得糖苷键对酸水解具有抗性。这解释了上述分析中N-乙酰己糖胺（HexNAc）相对于己糖的产量较低（占总HexNAc与己糖信号的11.3%，而非50%）的原因。 N-N-乙酰乳糖胺。值得注意的是，尽管HexNAc的产率相对较低，但在复杂的生物流体和组织中仍不难检测，也不会妨碍对来源于大型复杂聚糖的聚糖节点进行便捷检测。例如2,4-甘露糖、2,6-甘露糖、3,4,6-甘露糖和3,4-氨基葡萄糖 图2).³³ 鉴于聚糖节点的XIC峰面积归一化方式（步骤6.3）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氢氧化钠珠粒	367176	Sigma-Aldrich	20-40目，试剂级，纯度97%
0.9 ml 离心柱	69705	赛默飞世尔科技皮尔斯分公司	包括  塞子和聚乙烯筛板
GC-MS 自动进样瓶（硅烷化）*	C4000-9	赛默飞世尔科技	Target DP 高回收率小瓶，1.5 毫升，12 毫米 × 32 毫米，包含带聚四氟乙烯衬里的可穿刺瓶盖
1.5 ml 聚丙烯离心管	05-402-25	赛默飞世尔科技	带卡扣盖的盖子
2 ml 聚丙烯试管	05-408-138	赛默飞世尔科技	旋盖式瓶盖
二甲基亚砜（DMSO）	D8418	Sigma-Aldrich	分子生物学用生化试剂，试剂级 >99.0%
碘甲烷	I8507	Sigma-Aldrich	含铜作为稳定剂，ReagentPlus 99%
乙腈	A955-4	赛默飞世尔科技	Optima LC/MS
微型离心机	75002436：Sorvall Legend Micro 17 离心机	赛默飞世尔科技	24 x 1.5/2.0 角转子，配备 ClickSeal 生物安全盖。转子目录号：75003424
13 x 100 玻璃试管（硅烷化）*	53283-800	VWR	13 mm × 100 mm 螺口螺帽硼硅酸盐玻璃试管
玻璃试管帽	14-930-15D	赛默飞世尔科技	Kimble™ 黑色酚醛螺旋盖；13 mm-415 GPI 螺纹；聚四氟乙烯覆面橡胶衬里
氯化钠	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% 纯度
氯仿	4440-08	Macron Fine Chemicals
三氟乙酸	299537	Sigma-Aldrich	经重蒸馏纯化至99%，适用于蛋白质测序
硼氢化钠	71321	Fluka 分析	99%
氨水溶液	320145	Sigma-Aldrich	NH3 28.0-30.0%
甲醇	AH230-4	霍尼韦尔 伯迪克 &和杰克逊	HPLC 级
乙酸	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
塑料真空干燥器	任何足够尺寸的模型	FoodSaver
乙酸酐	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
二氯甲烷	D143SK-4	赛默飞世尔科技	稳定化HPLC级
丙酮	9006-03	J.T.Baker	贝克分析
加热蒸发歧管（主装置）	pi18823	赛默飞世尔科技	赛默飞世尔科技* Reacti-Therm* 加热搅拌模块；三孔加热搅拌型
加热蒸发装置（旋转蒸发仪）	pi18826	赛默飞世尔科技	ThermoScientific* Reacti-Vap 浓缩仪，27 孔；配合三区 Reacti-Therm 加热模块使用
用于蒸发歧管的铝制样品支架块	pi18816	赛默飞世尔科技	铝块，Reacti-Block S-1，可容纳13个 毫米直径试管，13 孔（14 毫米直径 × 45 毫米深）
气相色谱仪	Model A7890	安捷伦	配备 CTC PAL 自动进样器
质谱仪	GCT Premier（飞行时间）	沃特斯
分流模式衬管（去活化/硅烷化）	5183-4647	安捷伦	含一小团硅烷化玻璃棉
DB-5ms 气相色谱柱	122-5532	安捷伦	30 m × 0.25 mm 内径 × 0.25 微米膜厚
氯三甲基硅烷	95541	Sigma-Aldrich
玻璃真空干燥器（用于玻璃器皿硅烷化）	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" 宽；230 毫米板尺寸
玻璃器皿的硅烷化在大型玻璃真空干燥器中使用三甲基氯硅烷蒸气在内部完成，过夜进行。