本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。
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本文内容
摘要
摘要
聚糖是由一类称为糖基转移酶的酶通过非模板驱动过程合成的，在多种重要的细胞内和细胞外事件中发挥关键作用。许多病理状态（尤其是癌症）会影响基因表达，进而导致糖苷水解酶和糖基转移酶的相对丰度及活性水平失调。由失调的糖基转移酶（或其组合）产生的独特异常完整聚糖，常以痕量形式存在于复杂的生物流体中，使其检测变得困难且有时具有随机性。然而，通过适当的样品制备，质谱技术中最古老的形式之一——气相色谱-质谱联用（GC-MS）——能够常规检测复杂生物流体中存在的分支点和连接特异性的单糖单元（“聚糖节点”）。与传统的自上而下式糖组学技术相辅相成，本文讨论的方法涉及将样品中每个组成单元的聚糖节点收集并浓缩为单一独立的分析信号，从而提供关于整体糖组变化的详细结构和定量信息，并揭示可能失调的糖基转移酶。本文所提供的甲基化修饰及后续液/液萃取步骤的改进，通过尽量减少全甲基化聚糖暴露于碱性水相条件的时间，提高了实验的重复性和总体产率。对乙酰化步骤的优化进一步提升了反应程度和总体产率。尽管该方法具有良好的重复性，但结果显示，N-乙酰己糖胺（HexNAc）部分甲基化醇乙酸酯（PMAA）的总体产率本质上仍低于其相对于己糖PMAA的理论预期值。通过计算每个单独的己糖PMAA（或HexNAc PMAA）在提取离子色谱图（XIC）中的峰面积与其对应所有己糖（或HexNAc）XIC峰面积总和的比值，可建立一种新的归一化方法，从而实现对样品中各个聚糖节点的相对定量。尽管该方法在当前的绝对检测限方面仍存在一定限制，但它显著加快了临床生物流体的分析速度，并作为传统自上而下式糖组学的补充手段展现出广阔的应用前景。
引言
糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖和氨基聚糖构成了四类主要的复杂且具有异质性的碳水化合物，统称为聚糖。作为细胞质膜、糖萼以及细胞外基质和体液中普遍存在且不可或缺的组分，聚糖参与多种多样的生物化学过程，包括内吞作用、细胞内转运、细胞运动、信号转导、分子识别、受体激活、细胞黏附、宿主-病原体相互作用、细胞间通讯、免疫监视以及免疫应答的启动1。在几乎所有生命领域中均存在一类被称为糖基转移酶的酶，它们通过与糖苷水解酶（也称为糖苷酶，负责降解聚糖）协同作用，构建、重塑并最终生成成熟的聚糖聚合物2。尽管每种糖基转移酶可能作用于不同的糖缀合物，但通常情况下，糖基转移酶通过将特定活化核苷酸糖供体（例如，GDP-岩藻糖）中的单糖部分转移至某一类亲核受体（例如，脂质、多肽、核酸或正在延伸的寡糖链）上，形成具有特定连接方式和异头构型的糖苷键。据估计，超过50%的蛋白质（尤其是膜蛋白和分泌蛋白）在翻译后会经历糖基化修饰3。初步的组合计算有助于理解糖基化赋予糖蛋白的高度变异性、多功能性和特异性；例如，若一个多肽底物仅有10个糖基化位点，且每个位点均可与3种不同单糖还原端中的任意一种形成糖苷键，则理论上最终的糖蛋白可呈现310 = 59,049种不同的结构形式。在糖蛋白中，糖苷键通常与Asn-X-Ser/Thr序列中天冬酰胺残基侧链上的氮原子相连，形成N-聚糖2，或与丝氨酸和苏氨酸残基侧链上的羟基相连，形成<....
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方案
注意：避免皮肤或眼睛接触本实验所用的任何试剂。一旦接触，应立即用大量清水冲洗受影响部位，并尽快寻求医疗建议。
1. 全甲基化和糖链提取
- 柱层析准备
- 根据待分析样品的数量，准备相应数量的微量离心柱单元。折断并取下塑料储液管的管盖。在每个储液管中放入一个微量离心微型滤器。将组装好的微量离心柱（含微型滤器）放入微量离心管架中。
- 获取氢氧化钠（NaOH）颗粒（20-40目）的储备品。取部分NaOH转移至小称量舟中；若因湿度导致结块，可将其转移至预热的瓷研钵中作为工作用NaOH储备。避免使用结块的NaOH或破碎/粉末状的NaOH颗粒。
注意： NaOH 是一种强效毒素和腐蚀性碱。若皮肤或眼睛接触，应立即用清水冲洗 15 分钟。实验结束后，须彻底清洁实验台面。 - 使用小药勺或刮勺，将工作储备的 NaOH 颗粒转移至微量离心微型滤器中，使 NaOH 填充至第一道外侧斜面处（距 rim 约 5 mm）。将装填好的微量离心滤器轻敲实验台面，以压实/密实 NaOH 颗粒。
注意： 在整个实验过程中，为尽量减少吸湿性 NaOH 颗粒对水分的过度吸附，应保持所添加液体的液面高度例如， 乙腈、二甲基亚砜、分析物溶液）置于 NaOH 柱填料表面之上，并尽量减少与空气的直接接触。
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结果
总离子流色谱图（TIC）显示了人血浆样本在正确完成全甲基化、水解、还原和乙酰化反应后的结果，同时展示了两个关键的全甲基化步骤操作不当时的情况，如图3所示。
相对于己糖的N-乙酰己糖胺绝对得率：
N-乙酰基己糖胺（HexNAc）的部分甲基化醇乙酸酯（PMAAs）产率通常低于己糖。43 为估算HexNAc相对于己糖的绝对产率，分析了六份每份10 µg的N-乙酰乳糖胺（一种Gal1-4GlcNAc二糖）溶于10 µl水中的样品。对末端半乳糖（t-Gal）和4-GlcNAc的总离子流（TIC）峰面积进行积分。4-GlcNAc占t-Gal与4-GlcNAc总量的百分比为11.3 ± 0.7%（标准误）。尽管HexNAc的产率具有可重复.......
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讨论
通常，由己糖成功制备部分甲基化醛糖醇乙酸酯（PMAAs）所面临的困难较少，且方法更为稳健，相较于成功制备 N-N-乙酰基己糖胺（HexNAc）PMAAs。该现象在本实验流程的每一步骤中所涉及的确切机制尚不明确，但必然与独特的化学性质相关 N乙酰基（而非羟基），这是与己糖相比，己糖胺（HexNAcs）所特有的基团。该现象在酸水解中的作用机制已在其他文献中加以阐述。43 总之，其能力在于 N甲基乙酰胺基在酸水解过程中带正电荷，使得糖苷键对酸水解具有抗性。这解释了上述分析中N-乙酰己糖胺（HexNAc）相对于己糖的产量较低（占总HexNAc与己糖信号的11.3%，而非50%）的原因。 N-N-乙酰乳糖胺。值得注意的是，尽管HexNAc的产率相对较低，但在复杂的生物流体和组织中仍不难检测，也不会妨碍对来源于大型复杂聚糖的聚糖节点进行便捷检测。例如2,4-甘露糖、2,6-甘露糖、3,4,6-甘露糖和3,4-氨基葡萄糖 图2).33 鉴于聚糖节点的XIC峰面积归一化方式（步骤6.3）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了亚利桑那州立大学文理学院为CRB提供的实验室启动资金支持。同时，本研究还获得了弗林基金会（Flinn Foundation）资助（资助号：1977）以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所的资助（资助号：R33CA191110）。JA得到了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所的本科后研究教育项目（PREP）的资助（资助号：R25GM071798）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氢氧化钠珠粒 | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40目，试剂级，纯度97% |
| 0.9 ml 离心柱 | 69705 | 赛默飞世尔科技皮尔斯分公司 | 包括 塞子和聚乙烯筛板 |
| GC-MS 自动进样瓶（硅烷化）* | C4000-9 | 赛默飞世尔科技 | Target DP 高回收率小瓶，1.5 毫升，12 毫米 × 32 毫米，包含带聚四氟乙烯衬里的可穿刺瓶盖 |
| 1.5 ml 聚丙烯离心管 | 05-402-25 | 赛默飞世尔科技 | 带卡扣盖的盖子 |
| 2 ml 聚丙烯试管 | 05-408-138 | 赛默飞世尔科技 | 旋盖式瓶盖 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | D8418 | Sigma-Aldrich | 分子生物学用生化试剂，试剂级 >99.0% |
| 碘甲烷 | I8507 | Sigma-Aldrich | 含铜作为稳定剂，ReagentPlus 99% |
| 乙腈 | A955-4 | 赛默飞世尔科技 | Optima LC/MS |
| 微型离心机 | 75002436：Sorvall Legend Micro 17 离心机 | 赛默飞世尔科技 | 24 x 1.5/2.0 角转子，配备 ClickSeal 生物安全盖。转子目录号：75003424 |
| 13 x 100 玻璃试管（硅烷化）* | 53283-800 | VWR | 13 mm × 100 mm 螺口螺帽硼硅酸盐玻璃试管 |
| 玻璃试管帽 | 14-930-15D | 赛默飞世尔科技 | Kimble™ 黑色酚醛螺旋盖；13 mm-415 GPI 螺纹；聚四氟乙烯覆面橡胶衬里 |
| 氯化钠 | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% 纯度 |
| 氯仿 | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| 三氟乙酸 | 299537 | Sigma-Aldrich | 经重蒸馏纯化至99%，适用于蛋白质测序 |
| 硼氢化钠 | 71321 | Fluka 分析 | 99% |
| 氨水溶液 | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 28.0-30.0% |
| 甲醇 | AH230-4 | 霍尼韦尔 伯迪克 &和杰克逊 | HPLC 级 |
| 乙酸 | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| 塑料真空干燥器 | 任何足够尺寸的模型 | FoodSaver | |
| 乙酸酐 | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| 二氯甲烷 | D143SK-4 | 赛默飞世尔科技 | 稳定化HPLC级 |
| 丙酮 | 9006-03 | J.T.Baker | 贝克分析 |
| 加热蒸发歧管（主装置） | pi18823 | 赛默飞世尔科技 | 赛默飞世尔科技* Reacti-Therm* 加热搅拌模块；三孔加热搅拌型 |
| 加热蒸发装置（旋转蒸发仪） | pi18826 | 赛默飞世尔科技 | ThermoScientific* Reacti-Vap 浓缩仪，27 孔；配合三区 Reacti-Therm 加热模块使用 |
| 用于蒸发歧管的铝制样品支架块 | pi18816 | 赛默飞世尔科技 | 铝块，Reacti-Block S-1，可容纳13个 毫米直径试管，13 孔（14 毫米直径 × 45 毫米深） |
| 气相色谱仪 | Model A7890 | 安捷伦 | 配备 CTC PAL 自动进样器 |
| 质谱仪 | GCT Premier（飞行时间） | 沃特斯 | |
| 分流模式衬管（去活化/硅烷化） | 5183-4647 | 安捷伦 | 含一小团硅烷化玻璃棉 |
| DB-5ms 气相色谱柱 | 122-5532 | 安捷伦 | 30 m × 0.25 mm 内径 × 0.25 微米膜厚 |
| 氯三甲基硅烷 | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| 玻璃真空干燥器（用于玻璃器皿硅烷化） | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" 宽；230 毫米板尺寸 |
| 玻璃器皿的硅烷化在大型玻璃真空干燥器中使用三甲基氯硅烷蒸气在内部完成，过夜进行。 |
参考文献
- Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
- Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).
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