方法文章

采用轻质板材荧光显微镜到图像斑马鱼眼睛发育

DOI：

10.3791/53966

⸱

2016年4月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2HHMI Janelia Research Campus, 3Berlin Institute of Medical Systems Biology of the Max Delbrück Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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光片荧光显微镜是胚胎发育成像的出色工具。它允许在接近生理条件下录制活胚胎的长延时电影。我们演示了它在宽时空尺度上对斑马鱼眼睛发育进行成像的应用，并提出了一个用于多视图数据集融合和反卷积的管道。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光片荧光显微镜 （LSFM） 作为一种对胚胎发育进行成像的方法越来越受欢迎。与共聚焦系统相比，LSFM 的主要优点是其低光毒性、温和的安装策略、快速采集和高信噪比以及从不同角度（视图）对样品进行长时间成像的可能性。从多个视图进行成像可以释放 LSFM 的全部潜力，但同时它可以创建 TB 级的数据集。处理此类数据集是使用 LSFM 的最大挑战。在本协议中，我们概述了此问题的一些解决方案。直到最近，LSFM 主要在具有构建和作自己的光片显微镜专业知识的实验室中进行。然而，在过去三年中，LSFM 的几种商业实施出现了，这些实施是多用途的，并且易于任何发育生物学家使用。本文主要针对那些不是 LSFM 技术开发人员，但希望使用 LSFM 作为回答特定发育生物学问题的工具的研究人员。

在这里，我们以斑马鱼眼睛发育的成像为例，向读者介绍 LSFM 技术，并演示 LSFM 在多个空间和时间尺度上的应用。本文描述了一个完整的实验方案，从用于 LSFM 的斑马鱼胚胎的安装开始。然后，我们概述了使用市售光片显微镜进行成像的选项。重要的是，我们还解释了使用作为 Fiji 插件实现的开源解决方案对多视图数据集进行后续注册和融合的管道。虽然该协议侧重于对发育中的斑马鱼眼睛进行成像和处理来自特定成像设置的数据，但此处介绍的大多数见解和故障排除建议都是通用的，并且该协议可以适应各种光片显微镜实验。

引言

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形态是塑造胚胎和生长和分化驱动器一起从一个受精卵的个体发育成为成熟的多细胞生物体的过程。动物发育过程中形态方法可最好通过完整活标本1-3的成像进行分析。这是因为这种全胚胎成像保留所有驱动和调节发展包括信号分子的梯度，细胞外基质，脉管，神经支配以及周围组织的机械性能的部件。为了弥合的秤，在该形态出现时，快速亚细胞事件对整个组织在数小时或数天的发展的背景下一分钟的时间尺度被捕获。满足所有这些要求，正交平面照明显微镜5的现代执行4被开发。最初，它被命名为选择性平面照明显微镜（SPIM），4;现在是一个无所不包的长期轻质板材荧光显微镜（LSFM）通常使用。 LSFM使成像的高时间分辨率，同时诱发比激光扫描或旋转盘共焦显微镜6,7光毒性较少。如今，已经有基本光片照射原理许多实现，它已被用来对图像进行了大量的各种标本和过程以前无法进入的研究人员8-11。

我们首先要强调LSFM比传统激光共聚焦显微镜方法的几个关键优势:

获得从实时成像显微实验有意义的结果，重要的是观察仅最低限度地影响了标本。然而，许多生物，包括斑马鱼是激光照射非常敏感，使得它具有挑战性的图像它们与高时间分辨率共聚焦显微镜的光毒性无EFfects像停滞或延迟发育6,7。 LSFM目前与在样品7中的至少破坏性影响的荧光成像技术。由于薄激光光片照射是在特定的时间点拍摄的试样的仅一部分，光片显微镜是非常有效地利用光子。因此，低曝光允许健康样品的较长时间推移观察， 如 12-17。此外，由于LSFM的微创，获取的图像的数量不再受样品可以多少光耐受支配，而是由多少数据可以被处理和存储。

沿保持试样在接近生理条件的同一线，LSFM带有适合用于活胚胎替代样品放置策略。在LSFM技术中，将胚通常嵌入式低百分比琼脂糖的薄柱内。该mountin克到琼脂糖气缸允许旋转的完全自由，因此，可以从完美的角度被观察的样本（在LSFM称为视图）和从几个视图同时。多视点成像和随后的多视角的融合是大的，散射的标本特别有益，并允许高，各向同性分辨率捕捉它们。其他可能的LSFM安装策略汇总可以在官方显微镜的操作手册中找到，由E.雷诺的书面实验室样品制备节。它是一个推荐的读取，特别是如果我们的目标是图像不同的样品与此处所述。

在LSFM图像采集是宽视场，摄像为主，而不是激光扫描共聚焦显微镜。这导致更高的信号对用于采集的图像的信噪比（SNR），并且可以非常快速（几十到几百帧每秒）。 LSFM的高灵敏度进一步使弱荧光SAMP成像莱斯，像在内源水平18，或在不久的将来表达的转录因子，使用CRISPR / Cas9内源性蛋白标记。高信噪比也是成功的下游图像分析非常重要。高速不仅需要捕捉快速内进程，同时也从图像速度不够快多视图整个胚胎。的多个视图的无缝融合才能实现，如果所观察到的现象不会获得从单独的视图来这些数Z图库的过程中改变。

LSFM的优点通常不会来在图像质量为代价。 LSFM的横向分辨率比共聚焦显微镜的分辨率略差。这是因为在LSFM使用的检测目标具有较低的数值孔径相比，在标准共焦设置水或硅浸入目标1.2-1.3（通常为1.0或更小）。另外，由于在LSFM宽场检测（艾比森针孔的CE），有相比共焦显微镜更失焦光。失焦光的量由光片厚度来确定。尽管如此，这些缺点是由在LSFM的更高的SNR补偿。在实践中，这导致相比例如纺丝圆盘共焦采集15类似质量的图像。因此，这使得能够像细胞膜或细胞核， 例如功能可靠提取，用于细胞谱系追踪15,19。

LSFM的轴向分辨率被确定，除了上述被检测，由光片的厚度。可以LSFM在某些情况下，轴向分辨率优于共焦显微镜的分辨率。首先，在分辨率的改善来当光片是比检测目标，这通常发生于具有低放大倍数的物镜成像大试样的轴向分辨率更薄。第二种方式，该LSFM如何ACHieve更好的轴向分辨率，是多视角的融合，其中，从不同的角度高XY分辨率的信息组合成一个图像堆栈。由此产生的合并协议栈具有各向同性分辨率接近分辨率的值在横向方向20,21。用于注册到对方这篇文章中所描述的多个视图的策略是基于使用荧光聚苯乙烯珠镶嵌在样品20,21周围的琼脂糖受托标记。

作为LSFM商品化的结果，该技术现在可以科学家22的一个广泛的社区。因此，写这个协议的动机是为了使这项技术访问缺乏LSFM实践经验发育生物学家，并得到这些科学家使用这种技术，他们的样品开始。我们的协议使用商用光片显微镜，这就构成了概念上简单的显微镜Ť帽子是操作方便。我们将另外要提到最近的其他协议与家庭建造LSFM设置，这可能是合适的回答具体问题23-25 ​​成像斑马鱼。另一个进入选项LSFM是开放平台26,27，它们使用开放式访问原则，使轻质板材镜到更广泛的社区。在硬件和软件方面两者的文档可在http://openspim.org和https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/找到。

在这个协议中，我们使用了硬骨鱼斑马鱼作为模型系统来研究与LSFM发育过程。斑马鱼眼的形态是，强调许多LSFM的好处的例子。 LSFM已经过去用于研究眼球发育在青鳉28和在斑马鱼29,30。在眼睛发育的早期阶段它是复杂的定位正确胚胎传统显微镜，作为膨松蛋黄不允许胚胎趴在侧以其眼睛朝向目标。然而，随着LSFM安装到琼脂糖柱中，样品可以被再现地定位。此外，从视泡到视杯阶段的过渡过程中，眼睛经历伴随着增长，这需要捕捉大Z堆栈和视大领域的主要形态发生重排。也对这些挑战LSFM优于常规共焦成像。视杯的形成过程是三维的，因此它是很难理解，并从一个视图通过单独成像可视化。这使得具有各向同性分辨率成像多视点有利。视杯形成之后，视网膜变得激光曝光越来越敏感。因此，与LSFM相关联的低光毒性为长期成像的主要优点。

在这里，我们提出了一个优化的协议为一到三天的成像老斑马鱼胚胎一个第二幼虫集中在眼睛的发育。我们的方法可以覆盖多达12-14小时的高时空分辨率时间推移电影录音。重要的是，我们还显示了数据处理，这是在LSFM的必要步骤的流水线，因为这种技术必然产生大的数据集，常在TB的范围。

方案

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注:所有动物的工作是按照欧盟（EU）指令2011/63 / EU及德国的动物福利法执行。该协议的目的是要遵循不中断，从安装到成像样品。根据实践经验，这将需要2-3个小时，开始时间推移实验。不包括在这个时间计算数据的处理。所有实验所需的材料可以起一个作为补充文件提供所需前的材料清单上找到。在步骤1，2，3和4。第2，3，4和的协议还参考官方显微镜操作手册5戴上无粉手套。

1.准备工作成像实验之前

  1. 荧光珠原液
    1. 对于这个协议，使用500或1000纳米直径聚苯乙烯珠（标有红色发光荧光染料）。珠的工作稀释度为1:4，000。首先，涡旋珠原液持续1分钟。稀释10微升的珠在990微升的DDH 2 O的储存在4℃下在黑暗中的溶液，并使用此1:100稀释在1:40的原液进一步稀释。
  2. 在样品室准备解决方案
    1. 在100毫升烧杯中混合38.2毫升E3介质的未经亚甲蓝，0.8含10毫Ñ-phenylthiourea和1ml 0.4％的MS-222。有利的是使用过滤E3介质，以避免浮在样品室后的灰尘小颗粒或不溶解晶体。
  3. 荧光鱼胚胎选择
    1. 在实验前的日子里，准备表达荧光蛋白的胚胎。在实验前对，用于荧光信号的希望的强度的荧光体视下的胚胎进行排序。需要5-10个健康的胚胎，并用镊子dechorionate他们。
      注:该协议是16-72小时岁的优化胚胎。

2.设置样品室

  1. 组装三腔的Windows
    1. 有4个窗口在样品室中，一个用于目标和三个与盖玻片密封（直径18毫米，选定厚度0.17毫米）。储存在70％乙醇这些盖玻片。擦拭用乙醚使用前请清洁:乙醇（1:4）。
    2. 用细镊子将盖玻片到窗口，并确保它适合最小的凹槽。与17毫米直径的橡胶O形环盖，并在使用室内窗口工具照明转接环螺丝。重复该过程对其它两个窗口。
  2. 装上剩余室部分
    1. 螺丝的适当目标适配器插入腔室的第四剩余侧。插入15毫米直径的O形环到适配器的中心。
    2. 拧在白色鲁尔锁适配器插入在茶右下角开幕MBER并在左上开口灰色漏极连接器。屏蔽所有与黑瞎子插头剩下的三个开口。
    3. 附着珀尔帖块并使用六角扳手腔室的金属燕尾滑动底部。附上与50毫升注射器的路厄锁适配器软管。将温度探头插入室。
  3. 插入目标和商会到显微镜
    1. 检查立体镜，所有的目标都干净之下。使用10X / 0.2照明目标和计划复消色差透镜20X / 1.0 UV检测目标，并确保其折射率校正套环被设置为1.33的水。螺丝检测目标到显微镜，同时保持涵盖照明目标。
    2. 取下保护塑料盖覆盖照明目标。小心地将腔滑入显微镜用的固定螺丝拧紧。
    3. 连接温度亲是并用显微镜珀耳帖块。
      注:为循环珀耳帖块冷却液两管与两个连接器兼容。它们形成了一个功能电路连接无关的方向。
    4. 通过与在步骤1.2制得到该腔室的窗口的上边缘溶液注射器填充腔室。检查室没有泄漏。
    5. 启动显微镜，孵化，控制和存储计算机。启动显微镜，操作软件，并设置孵化温度为28.5℃。
      注:这将需要1小时至完全平衡。制备在此期间将样品。

3.样品制备

  1. 准备琼脂糖混合
    1. 制备琼脂糖混合物前15分钟，熔化的加热块设置为70℃下1 1毫升等分试样的1％低熔点琼脂糖（溶于E3培养基）。一旦琼脂糖完全摩尔十，转移600微升到一个新的1.5 ml管，加入250微升E3中，50微升0.4％MS-222和25微升涡旋珠原液。
      注意:这使得925微升混合物，而另外的75微升被计算为与胚胎后一起加入该液体。
    2. 保持管中的第二加热块在38-40℃或确保琼脂糖非常接近其凝胶点把样品胚胎成之前。
  2. 安装的胚胎
    1. 取20微升量五个玻璃毛细管（用黑色标记，约1内径），然后将匹配铁氟龙尖端柱塞放进去。通过毛细管推动柱塞，使特氟隆尖端在毛细管的底部。
    2. 转印5胚胎（即可以安装在一次的数）用玻璃或塑料吸管成涡旋37℃温暖琼脂糖混合物的管中。
      注意:尽量结转液体一起机智的最小体积小时胚胎。
    3. 将毛细管混进去，并通过拉动柱塞向上吸里面一个胚胎。确保胚胎的头尾部之前进入毛细管。避免柱塞和样品之间的任何气泡。应该有琼脂糖的±2厘米胚胎它上面和下面±1厘米。重复对其余的胚胎。
    4. 等到琼脂糖完全凝固，在几分钟之内这恰好然后存储在E3的介质的样品中，由他们坚持用橡皮或磁带的烧杯的壁。毛细管的底部开口应悬挂在溶液允许气体交换的样品自由。
      注:类似协议的部分3.1和3.2可以在OpenSPIM维基页面http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation来也有发现。

4.样品定位

  1. 样品架装配
    1. 2插入大小合适的塑料套管（黑色）针对对方到样品架杆。他们缝两侧必须朝外。通过将其2-3个回合松散连接的紧固螺钉。通过夹紧螺钉插入毛细管，并通过保持器，直到黑色带变为在另一侧可见推。避免接触柱塞。
    2. 拧紧夹紧螺钉。推多余的1厘米以下的胚胎琼脂糖出来的毛细管和削减它。插入杆插入样本保持光盘。
    3. 确认在该显微镜阶段是在装载位置的软件。使用导轨垂直向下与样品下滑，整个支架插入显微镜。打开，从而使磁性的保持架盘锁定就位。
  2. 定位毛细管
    1. 从现在开始，控制由软件样本定位。在查找选项卡中选择的定位毛细管选项，并在X，Y毛细血管和z成为关注的焦点正上方的检测对象香港专业教育学院的镜头。用图形表示在试样导航器的指导。
    2. 轻轻推胚胎出毛细管，直到它在被检测的瞳孔的前面。
      注:"定位毛细管'是在剩余的协议，在此期间，在显微镜的上盖应打开且样品压出的唯一步骤。
  3. 定位样本
    1. 切换到"找到样品"选项，并在0.5变焦带来的斑马鱼眼进入视场的中心。旋转胚胎，使得光片将不通过样品的任何高折射或吸收的部分到达眼睛之前。同样地，所发射的荧光需出试样的畅通路径。点击"设置初始位置"。
    2. 打开显微镜的前门，并把塑料盖用3毫米开口的腔室，以避免蒸发的顶部。
      注意:如果液位低于成像水平，实验将受到损害。
    3. 检查胚胎的心跳作为整体健康的代理。如果过慢，则使用另一个样品（比较非安装控制装置;特定值取决于发育阶段）。切换到最终的缩放设置和调整胚胎的位置。

5.建立一个多维收购

  1. 采集参数
    1. 切换到"采集"选项卡。定义的光路包括激光线，检测目标，激光阻塞滤波器，分束器和摄像机。
    2. 激活枢轴扫描复选框。定义像位深度，图像格式，轻质板材厚度其它采集设置，选择单面照明。
    3. 按"连续"并且根据所获得的图像的强度改变激光功率和相机的曝光时间。
      注:调整所有的成像设置，使用LES秒激光功率（100毫瓦的激光，30毫秒的曝光时间的0.5％），比实际的实验，以避免试样不必要光损伤。
  2. 光表调整
    1. 切换到"双面照明"和 激活'在线双面Fusio'n复选框。启动"Lightsheet自动调节向导"。按照说明一步一步来。
      注:向导移动光片到检测目标的焦平面，并确保它不倾斜并且它的腰部是在视场的中心。在完成自动调整后，左，右光片的位置在软件中自动更新。在图像质量的改进，现在应该很明显。激活'Z堆栈"复选框。
    2. 通过检查由在xz和YZ邻视图荧光珠给出的点扩散函数（PSF）的对称性检查光片的调整。如果它是不ŧ对称，手动上下，直到达到一个对称形的沙漏PSF（ 图1A）调光片参数位置。
  3. 多维采集设置
    1. 定义Z堆栈的"第一片"和"尾片"选项，并设置Z步骤1微米。
      注:光片在此显微镜是静态的，并且Z切片则以通过样本来实现的。始终使用更快的收购Z-堆栈的"连续拍摄"选项。
    2. 激活"时间序列"复选框。限定的时间点的总数和在它们之间的间隔。
    3. 激活"多视图"复选框。添加当前视图入多视点列表中，其中x，y，z和角度信息被存储。使用级控制器以旋转毛细管和定义其他期望的意见。设置的Z堆叠在每一个视图，并把它们添加到多视图列表。
      注意:软件进行排序以串行方式的意见，从而使毛细管单向转动，而图像被获取。
  4. 漂移校正和启动试验
    1. 一旦收购设置完成后，开始实际实验之前等待15-30分钟。
      注:样品最初漂移几微米的x，y和z，但应在30分钟内停止。如果样品保留漂流时间更长，使用另一个样品或重新装入。
    2. 切换到"维护"选项卡，在"流式"选项定义的数据应该如何保存， 例如 ，每个时间点或单独的文件一个文件为每个视图和渠道。返回到"采集"选项卡，按"开始实验"，并定义文件的名称，位置，应该保存的文件格式（使用.czi）。
    3. 观察采集第一时间点，以确认一切都完美运行。立即着手注册并在第一时间点的融合在步骤6和7描述的，以确认其将有可能处理该整个数据集。

6.多视点注册

  1. 多视点重建中的应用
    1. 在成像会话的目的，在显微镜从数据存储计算机的数据传送到一个​​数据处理计算机中。使用"多视图 ReconstructionApplication'20,21,31斐济32进行数据处理（ 图1B）来实现。
  2. 定义数据集
    1. 更新斐济:斐济>帮助>更新ImageJ的和斐济>帮助>更新斐济。使用主ImageJ的和斐济更新站点。
    2. 传输整个数据集到一个文件夹中。结果和处理的中间文件将被保存到这个文件夹。启动多视图重建中的应用:斐济>插件>多视点重建> MultiviEW重建中的应用。
    3. 选择"定义一个新的数据集"。截至类型的数据集选择MEU选项"蔡司Lightsheet Z.1数据集（LOCI Bioformats）"，并为.xml文件创建一个名称。然后选择数据集（ 即没有索引文件）的第一个.czi文件。它包含的图像数据，以及记录的元数据。
      注意:一旦程序打开第一.czi文件，所述元数据被加载到该程序。
    4. 确认该角钢，槽钢，照明的数量和从元数据观察体素尺寸。在按下OK，遵守三个独立的窗口中打开（ 图1C）:日志窗口，显示处理，其结果，在"资源管理器ViewSetup"和控制台的进展，呈现出斐济的错误消息。
      注:在"资源管理器ViewSetup"是一种用户友好的界面，显示每个视图，渠道和照明，并允许选择感兴趣的文件。此外，"ViewSetup资源管理器"允许的所有加工步骤转向。
    5. 选择需要处理，然后按鼠标右键，进入资源管理器中的文件。观察具有不同的处理步骤（ 如图1C）打开一个窗口
    6. 在定义数据集，观察与数据的文件夹中的.xml文件被创建。
      注:此文件包含了之前被证实的元数据。
    7. 在右上角观察到两个按钮"信息"和"保存"。按"信息"显示.xml文件的内容摘要。按"保存"将保存处理结果。
      注意:当在"多视图重建中的应用"的不同的处理步骤需要处理在关闭之前斐济被保存到该.xml。

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图1:多视点重建工作流程和兴趣点检测 （A）基于荧光珠成像光片对齐。该系统被对准（中心）中，当胎圈图像具有在XZ和YZ突起对称沙漏形状。不对准光片在任一方向的例子示于左边和右边。一个500纳米珠在XZ的最大强度投影，YZ和XY轴被示出。注意，该艾里斑（在XY）的中央峰的强度与旁瓣的比率较大，当lightsheet相比，未对齐情况正确对齐。图像是在0.7变焦拍摄的20X /为1.0W目标。比例尺条为5微米。 （B）的数据集被定义，然后重新保存到HDF5格式。珠被分段，然后登记。一时间系列中的每个时间点被登记到一个参考时间点。数据被最后融合成单一的各向同性的体积。 （C，顶部）的ViewSetup资源管理器示出了不同的时间点，角钢，槽钢和数据集的照明侧。 （C，左下角）的BigDataViewer窗口显示在ViewSetup Explorer中选择的看法。 （C，中间右） 右侧点击进入ViewSetup资源管理器打开处理选项。 （C，右下角）的进展和处理的结果显示在日志文件中。 （D和E）的检测的目的是要与这里示出为从交互式珠分割截图样品尽可能在短短检测段尽可能多的兴趣点（珠）。 （D和E，左上角）分割由两个参数，对西格玛1和阈值 之差的高斯值所定义。（D）一种成功检测与正确地检测胎圈的放大图的一个例子。 （E）分段有太多的误报和单珠的多次检测。 （C）中比例尺条为50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 数据集重新保存在HDF5格式
    1. 要重新保存整个数据集，选择所有使用Ctrl / +苹果一个 ， 然后右击该文件。然后选择重新保存数据 和HDF5。
    2. 将出现一个窗口显示当前数据集的所有意见将重新保存警告。按YES。
      注:该计划将继续通过打开每个文件并重新保存HDF5格式不同分辨率级别重新保存.czi文件HDF5。这将确认"完成"结束后。重新保存usually将会按时间点几分钟（ 见表1）。
      注:由于在HDF5格式文件可以非常快速的加载，现在可以查看由"右键点击"进入资源管理器，切换未注册的数据集"显示在BigDataViewer（开/关）"。一个BigDataViewer窗口将出现与所选视图（ 图1C）。所述BigDataViewer 33的核心功能如表2和http://fiji.sc/BigDataViewer说明。
  2. 检测兴趣点
    1. 选择使用Ctrl /苹果+一个所有时间点右键选择检测兴趣点 。
    2. 选择差异-的高斯 34 类兴趣点检测的 。由于基于珠的注册用在这里，键入"珠"到对标签兴趣点的字段。激活"之前分割下采样图像"。
    3. 在下一个窗口中，观察DET挠度设置。对于"亚像素本地化"使用"三维二次拟合"34并确定珠子分割使用的"互动"的i'nterest点规范"的区别高斯的值和半径。
    4. 对于"XY缩减像素采样"使用"匹配Z分辨率（少下采样）"和"缩减像素采样Z'使用1倍 。的Z步大小比在xy像素尺寸更大，从而简单地向下抽样的xy以匹配的Z分辨率就足够了。选择"在CPU（JAVA）的计算"。按"OK"。
    5. 在弹出窗口中，选择从下拉菜单中进行测试的参数一个视图。当视图负荷，调节亮度和斐济窗口的对比度>图像>调整>亮度/对比度，或按Ctrl + Shift + C勾选框'的最大值（绿色）看"为珠检测。
    6. 观察分割在"viewSetup"绿色戒指也不要蜘蛛ð寻找最大值和红色为最低的时候检测。分割由两个参数， 差分高斯的最值对西格玛1和阈值 （ 图1D）中所定义。调整到样品周围段许多珠和样品尽可能（ 图1D）内，很少出现假阳性检测。多次（ 图1E）检测每个珠子一次，而不是。确定最优参数后，按"完成"。
      注:检测开始通过加载时间点的每个单独的视图和分割珠。在日志文件，程序输出的是按次检测珠子的数量。检测应在几秒钟内完成（ 见表1）。
    7. 按（600至几千每视图） 保存时检测的量是合适的。
      注:文件夹在数据目录中创建，其中将包含资讯Ñ​​关于所检测的珠粒的坐标。
  3. 注册使用兴趣点
    1. 使用Ctrl /苹果选择所有时间点+ A，点击右键，选择"使用兴趣点注册"。
    2. 使用"快速的3D几何散列（旋转不变）"的珠检测为"注册算法"。
      注:此算法假定有关的不同的视图相对于彼此的取向和定位的先验知识。
    3. 对于意见到对方注册，选择"分别注册时间点"为"注册类型"。对于所选通道"兴趣点"，为兴趣点以前指定的标签，现在应该是可见的（ 即 "珠"）。
    4. 在下一个窗口中，使用预先设定值进行注册。通过选择固定第一视图'砖修复:修复第一块和使用不要映射回'如果直到（使用上课不是在'地图返回砖"部分固定的）。
    5. 使用"仿射变换模型"与"正规化"。
      注:RANSAC允许的误差将是5像素和"对一个描述符匹配的意义'将是10分对于"正规化"使用"刚体模型"为0.10拉姆达，这意味着该转化是10％，刚性和90 ％仿射35。按OK开始登记。
      注:为显示在日志窗口中，首先每个视图与所有其他观点一致。然后随机样本共识（RANSAC）36测试对应并排除误报。用于鲁棒配准，所述RANSAC值应高于90％。当发现两个视图之间对应的真实的候选人的足够数量，变换模型的每个匹配中的像素的平均位移之间计算。然后迭代全局优化被执行并且所有视图注册到固定的看法。随着成功注册，转换模型进行计算，并与它的缩放和像素位移显示。平均误差应最佳地低于1像素和该登记以秒（ 见表1）执行的接近1的改造的缩放。
    6. 确认有对微细结构所观察到的样品中的不同视图之间没有移位， 例如细胞膜。然后保存转换为每个视图到.xml文件。
      注:现在注册的视图相互重叠在BigDataViewer（ 图2A）和所述胎圈的图像应该被覆盖以及（ 图2B）。
    7. 通过选择时间点右键单击它们删除变换，然后选择删除转换>最新/最新变革。

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图2:多视点重建的结果 （A），它覆盖注册的视图，每一个不同的颜色，以表明它们之间的重叠。 （B）的放大视图，示出从不同的观点成像珠的PSF的重叠。 （C）关闭了融合后的一颗珠 ​​子，涤纶短纤是不同意见的平均值。 （D）之后的多视点去卷积表示PSF中折叠成一个单一的点相同的珠的PSF作为（C）中。 （E）的xy部分和视泡，其中膜被向z标以信号的GFP表示降解在组织更深的单一视图（F）的YZ截面。 （G）的xy部和（H）YZ加权平均融 ​​合的4次相距大约20度，有略多degra后的相同视图的部分DED XY分辨率，但整体的z分辨率提高。 （Ⅰ）的xy部和（J）的YZ多视点去卷积之后相同数据的部分，表示在分辨率和两个在XY和Z中的信号的对比度的显著增加。在（EJ）图像是单个光片。比例尺代表50微米（A，B，EJ）和10微米（C，D）。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 时间推移注册
    1. 选择整个时间的推移，右击并选择"使用登记兴趣点"，以稳定时间推移随着时间的推移。
    2. 在"基本注册参数窗口中选择针对一个参考时间点相匹配（全局优化）注册类型"。柯EP T他其他的设置一样，在各个时间点的登记。
    3. 下一个窗口中，选择时间点上被用作参考，典型地在时间推移的中间的时间点。勾选框"考虑每个时间点为刚性单元"，因为每一个时间点内的个人看法已经注册到对方。
    4. 勾选了"显示时间序列数据"复选框。其他登记参数仍然为包括正规化之前。按OK。
      注:在日志窗口，同样的输出将被显示为单个时间点报名。如果对于各个时间点的注册是成功的，健壮的RANSAC现在99-100％，平均，最小和最大误差通常低于1像素。继续之前保存这个注册。

7.多视点融合

注意:从登记步骤将所得的变换来计算的稠各向同性叠出的多个视​​图。这堆公顷š相比增加原始数据Z切片数量，因为的Z间距现在等于在XY原始像素大小。融合可以通过一个基于内容的多视点融合21,31或基于贝叶斯多视点去卷积31，这是在多视点重建应用既实现来执行。

  1. 边界框
    注:融合是计算昂贵的过程（ 见表1），因此，通过定义边界框显著增加处理的速度减少数据量。
    1. 选择所有时间点右键选择定义"边界框"。使用"与BigDataViewer定义"，然后选择边界框的名称。
    2. 移动滑块为"分钟"，并在每个'最大'轴来确定感兴趣的区域，然后按"OK"。边界框的参数将被显示。
      注:边框将包含在一切绿盒子覆盖有一个透明的品红层。
  2. 基于内容的多视点融合
    注: -基于内容的多视点融合21接管堆栈中的图像质量的差异（ 即在z中的信号的降解）考虑并应用较高的权重为更好的图像质量，而不是使用简单的平均。
    1. 选择应在"资源管理器ViewSetup"融合的时间点上，点击右键，选择"图像融合/解卷积"。
    2. 在图像融合窗口中，选择从下拉菜单中选择"加权平均融合"，并选择"使用预先定义的边界框包围盒"。对于融合图像选择的输出"附加到当前XML项目"，其中写道:新HDF5文件已经存在的文件HDF5，并允许使用注册的非融合意见和图像融合在一起。按"OK"。
    3. 然后在"预定义边界框＃39;弹出窗口中选择以前定义的边界框的名称，然后按"OK"。
    4. 观察在下一窗口边框的参数。为了快速融合，在融合的数据集应用下采样。
      注意:如果融合堆栈是有一定规模以上，程序会建议使用更多的内存效率的"ImageLib2 containe'r。从切换"ArrayImg"到"PlanarImg（大图像，便于显示）或CellImg（大图像）"的容器，它允许更大的数据的处理。否则，使用预定义的设置并应用'融合和基于内容的融合"。按"OK"继续。
    5. 在接下来的窗口中观察HDF5设置。使用预定义的参数，并启动熔化过程。确保斐济分配足够的内存 编辑>选项>内存和线程。
  3. 多视点反卷积
    注:多视角去卷积31 ANOT她的类型多视角的融合。这里附加地融合，成像系统的PSF是考虑到以反卷积的信号的图像和产量增加的分辨率和对比度（ 图2C-J， 图5和电影3相比）。
    1. 选择时间点（S）以反褶积，右键单击并选择"图像融合/解卷积"。
    2. 选择"多视点反卷积"和使用"预先定义的边界框，并追加到当前XML项目"。选择边框并继续。
      注:反卷积预先定义的参数是一个很好的起点。对于第一个试验使用'20迭代调试模式''，并通过使用评估去卷积的影响"。最后设定为512×512×512块计算。
    3. 在下一个窗口中，使用预先定义的设置。将"调试模式"来显示结果每一个"5伊特口粮"。
      注意:反卷积的输出是32位数据，然而BigDataViewer目前仅支持16位数据。为了去卷积的输出追加到现有HDF5数据集，它必须被转换为16位。
    4. 用于转换，运行'使用第一图像的最小/最大（可能饱和强度随时间）'。
      注:然后去卷积将通过加载图像和他们准备去卷积开始。
  4. BigDataServer
    1. 为了共享非常大的XML / HDF5数据集使用HTTP服务器BigDataServer 33。如何设置和连接到服务器等的介绍可以在http://fiji.sc/BigDataServer找到。
    2. 要连接到现有BigDataServer开放的斐济>插件> BigDataViewer> BrowseBigDataServer。
    3. 输入URL包括端口到窗口。
      注:本出版物中介绍的电影都是通过这个广告访问礼服:http://opticcup.mpi-cbg.de:808​​5
    4. 观察允许选择可用电影的窗口。双击打开BigDataViewer窗口并查看如前所述的数据。

补充:有必要在开始之前材料清单

  • 斑马鱼胚胎/幼虫表达荧光蛋白（保持在斑马鱼的E3介质胚胎无亚甲蓝对于阶段超过24小时的较旧的添加PTU至0.2mm的最终浓度抵消色素沉着。）
  • 荧光体视镜
  • 毛细管（20微升量，用黑点），以及适当的柱塞（不要重复使用毛细管。柱塞，在另一方面，可以对几个实验重复使用。）
  • 1.5毫升塑料管
  • 尖锐的镊子
  • 玻璃（火抛光）或塑料移液器（塑料可以使用24小时以上的胚胎）
  • 玻璃或塑料盘60mm直径（塑料可以是使用24小时以上的胚胎）
  • 两个100ml烧杯
  • 50毫升鲁尔锁注射器150厘米的延长管输液（软管和注射器应保持在实验中的微生物，避免污染之间完全干燥。）
  • 橡皮泥
  • 低熔点（LMP）琼脂糖
  • E3介质（5毫摩尔NaCl，0.17毫摩尔的KCl，0.33毫氯化钙 ，0.33毫硫酸镁 ）
  • MS-222（三卡因）
  • 苯基硫氧嘧啶（PTU）
  • 荧光微球（这里称为珠）
  • 双蒸H 2 O（DDH 2 O的）

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM是跨尺度的成像发育过程的理想方法。几个应用程序此处编译示出细胞内的结构，以及细胞和整个组织的短期和长期的成像。这些实施例还表明，LSFM在从视杯形成眼发育的各阶段中的视网膜的有用的工具来神经发生。 电影1作为一般LSFM方法的图示，首先示出了一个完整的胚胎的缩小视图嵌入在明琼脂糖气缸和后表示在荧光通道中的视网膜的详图。

figure-results-1
电影1:斑马鱼视网膜LSFM要说明LSFM方法，这部电影第一次显示了在胚胎成像完好一个内部的明切换到荧光之前garose缸。以后它表明视大字段使整个视网膜的观察。接着，将动画显示视网膜的放大小区域以突出的良好亚细胞的分辨率。用于成像间隙-GFP 37转基因斑马鱼胚胎:一个Ath5。此转基因在视网膜（主要神经节细胞和光感受器的前体）的标签不同的神经元。影片的荧光部分被捕获为单一视图使用40X /为1.0W目标用5分钟的间隔用双面光照记录。一个30微米厚卷的最大强度投影显示， 请点击这里下载此文件。

电影2演示了如何非常快的细胞内事件能够以高分辨率捕获;在这种情况下，微管在生长其加在视网膜神经元祖细胞的结束。中所包含的电影信息允许微管加末端生长的跟踪和定量。

figure-results-2
电影2:在单个细胞中微管动力学这部电影撷日益增长的加尖标记蛋白EB3-GFP标记38微管外加小费。该蛋白质是在一个单一的视网膜祖细胞中表达。的微管主要在方向从根尖生长到基底（从上到下）。的EB3彗星的平均速度测量为0.28±0.05微米/秒。在细胞具有高微核活性的顶侧的亮点是中心体。野生型胚胎注射HSP70:EB3-GFP质粒DNA。电影是在约28 hrpost fertiliz获得热休克（37℃15分钟）后4小时通货膨胀（HPF）作为一个单一的视图与单面记录照明使用63X /为1.0W客观，1秒的时间间隔。单细胞被从视图覆盖大多数视网膜的场裁剪。显示两片投影的最大强度。 请点击此处下载此文件。

如图3所示，如何胞内结构可以跟随在许多小时。这里，内转运的视网膜神经节细胞（RGC）的中心体被捕获。

figure-results-3
图3:视网膜神经节细胞易位期间中心体定位的时间推移实验的这蒙太奇显示了中心体的整个视网膜神经节细胞（RGC）的成熟的位置。在神经祖细胞中心体在心尖过程（1时00分）的最顶端本地化。在细胞分裂过程中，两个中心体作为灯杆为有丝分裂纺锤体（2时25分）。这种划分的结果在于，分化成一个RGC与成为感光细胞的前体的第二子小区中的一个子细胞。分割后，对RGC的细胞体转位到视网膜的基部侧，而顶进程仍然在顶侧附连。曾经的RGC达到基底面，它的顶端突起分离和中心体与它（6点15）移动。中心体可以在逐渐心尖过程（6点50，7:20 8:10）一起缩回执行。在最后一帧（8点55）的神经节细胞生长从其基部侧的轴突，而中心体仍在顶部本地化。马赛克表达，质粒DNA注射一个细胞阶段实现到野生型胚胎。的细胞被Ath5可视:GFP-CAAX（绿色）常量构作，其标签和视网膜神经节细胞神经元等。所述中心体（箭头）由中心蛋白-tdTomato 29表达（品红色）标记的。视网膜的顶面是在图像的顶部和基底侧在底部。一个30微米厚卷的最大强度投影被示出。这些照片是从电影覆盖整个视网膜裁剪。影片开始于大约34小时受精后（HPF）。为Z堆栈被收购每隔5分钟用40X /为1.0W目标。时间显示在HH:MM。比例尺代表10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

在图4中显示，细胞如何单个行为可以从数据中捕获整个组织中提取，如电影1。一个RGC的易位可以很容易地追踪和根尖和基底处理ES紧随其后。

figure-results-4
图4:单视网膜神经节细胞的易位从心尖的RGC易位到视网膜的基底侧如图3中所描述的终端有丝分裂后出现的RGC由Ath5表达标记:间隙-GFP 37转基因。一个30微米厚卷的最大强度投影被示出。这些照片是从电影覆盖整个视网膜裁剪。影片开始于大约34高倍视野。为Z堆栈被收购每隔5分钟用40X /为1.0W目标。时间显示在HH:MM。比例尺代表5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5显示多视点LSFM的捕获组织SC的能力强麦形态发生过程与视杯形态的例子细胞的分辨率，在此期间，视泡转变成一个视杯。图像质量可以通过多视点摄像，当最终图像被从信息组合出的5个不同的视图（在这种情况下）与各向同性分辨率一个Z堆栈大幅提高。该图中示出了多视点去卷积后加权平均融合和图像对比度进一步增益和分辨率后的图像质量的改善。图中示出了在通过数据集不同方位的两个光学片。此外，从反褶积数据集的蒙太奇显示随着时间的推移视杯形态。所有的时间点，然后在电影3所示。

figure-results-5
图5:单一视图和multiv的两种方法之间的图像质量比较IEW融合。（A）从侧面观和（B）背视图中显示单一视图数据的一个光片。条纹伪像和信号样本内更深的退化是显而易见的。也图像中的稠合数据（CF）可见的一部分在该特定视图中不捕获。 （C）相同的光学切片，现在从侧面观和（D）背视图中显示多视角融合的数据。需要注意的是条纹伪像被抑制和结构深样品中更好的解决。 （E）相同的光切片今为多视角从去卷积侧位片和（F）背视图中显示的数据。注意提高对比度和分辨率，以便各个细胞膜和细胞核可很好区分。该决议不会降低样本内显着更深。该数据集与双面照明相距约20度收购了5次。 AB的z栈出100微米与1.5微米的步长分别在每一个视图中10分钟的间隔获得10小时用20X /为1.0W目标。对多视点融合和反卷积输入图像进行向下采样2×加快图像处理。多视点反褶积的15次迭代中运行。 （G）的蒙太奇显示了从反褶积数据的背视眼初期发展从视泡到视杯阶段期间要突出形态发生事件的裁剪区域。视神经囊泡的两层，其最初是类似柱状上皮，分化成不同的细胞群。接近表皮远侧层成为视网膜神经上皮（RN）和近端层靠近神经管成为视网膜色素上皮细胞（RP）。在RN长和内陷的细胞形成视杯（1:40至5:00）;在同一时间RP的细胞变平。表面外胚层被诱导以形成透镜（1:40），WHICH内陷后（5:00）。影片开始于17 HPF。时间显示在HH:MM。所有的细胞膜由β肌动蛋白标记:RAS-GFP转基因和所有的核通过该HSP70标记:H2B-RFP转基因。比例尺代表30微米。 FB前脑，LE镜头，OP嗅placode，RN视网膜神经上皮，RP视网膜色素上皮细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-6
电影3:视杯形态显示为单一视图和多视图融合两种方法的定时短片说明从视泡到视杯阶段视杯形态的完整过程。它示出了从侧视图（上）和从背面观单个光片（底）的单一光学片。发展中视泡的细胞发生复杂的重排，最终形成与内层视网膜神经上皮和外视网膜色素上皮细胞的半球形视杯。透镜从表面外胚层形成。它与神经上皮内陷沿着并视杯坐。所有细胞膜由β肌动蛋白的表达标记:RAS-GFP（绿色）转基因和细胞核都标有HSP70:H2B-RFP（品红色）。影片开始于约17高倍视野。数据集与来自5次相距大约20度的双面照明和AZ的约100μm栈被收购，每10分钟用20X /为1.0W目标获得的。时间显示在HH:MM。比例尺代表50微米。 请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.数据采集的关键步骤和故障排除

对于GFP和RFP表达样品的典型的成像设置可以在表3中所描述的显微镜设置的光片是静态的，由圆柱形透镜构成被发现。两个照明目标是空气透镜和检测目标是水浸渍镜片。缩小1.0 20X / 1.0或40X / 1.0目标给出了230 nm和115 nm的像素大小和分别来看441点¯x441微米或221点¯x221微米领域。建议使用默认的轻质板材厚度与中心边境比例为1:2。为20X / 1.0这个厚度相当于4.5微米，对于40X / 1.0至3.2微米的中心。如果成像速度不是主要的优先级，使用单独的轨道在一个多色样品的情况下，以避免信道之间的荧光发射的串扰。采集的最高速度由限制在50毫秒每ž步骤的z驱动器的移动速度。如果目标是达到最大成像速度的情况下， 例如 ，用双面照明两个轨道中，曝光时间必须被设置为使得每Ž步骤拍摄的所有图像的总和是低于50毫秒。另一方面，如果只有一个图像被每Ž步骤获得的，它不利于以设置曝光时间大于50毫秒短。

1920×1920的图像尺寸
16位
透视扫描上
双面光照在线融合
10X / 0.2照明目标
20X /为1.0W计划复消色差透镜探测目标
轨道1:激发488nm的通常为100毫瓦的激光的2％，550nm处的SP发射滤波器
轨道2:激发波长561％，一般为3毫瓦75激光585纳米LP发射滤光片
曝光时间长达100毫秒
ž堆栈厚度为50〜100μm
1-1.5微米ž步长在连续Z驱动器模式
孵化在28.5℃，

表3:成像设置。

实验后检查样品

以确保该样品仍处于实验结束健康是重要的。作为第一读出，检查体视下试样的心跳。具有一对锋利的镊子的样品可以取出琼脂糖并移至孵化器，以便检查它是否被受成像得到进一步发展。可替代地，它可以是固定的抗体染色。

安装和漂移

它保持室S的容积渗透摩尔浓度是必不可少olution接近嵌入琼脂糖的渗透压，否则肿胀/琼脂糖和将发生的样本随后不稳定的萎缩。因此，使用相同的解决方案（不亚甲蓝E3中），以填补室，并准备1％低熔点琼脂糖等分。另外，不要留在70℃加热块琼脂糖超过2小时，因为它可能会失去其胶凝性能。

不要嵌入鱼放入太热琼脂糖，因为这会导致胚胎的热休克反应或死亡。如果不确定温暖琼脂糖对胚胎的影响，检查尾不弯曲，而且心脏速度不会减慢。如果发生这种情况，使用不同的胚胎的实验。

保持琼脂糖柱的总长度与（厘米左右2）样品短和装入其头部朝向柱塞头定向的斑马鱼。同样地，琼脂糖气缸从capill挤出进制应保持尽可能短。这些措施将确保样品的稳定性在整个电影。与此同时，使玻璃毛细管本身不伸入光路中，因为这将引起重大的折射和反射的琼脂糖柱必须足够长。

样品的初始漂移是由琼脂糖汽缸本身的体积变化引起的。活塞滑动不是它的原因。因此，它不能帮助解决与橡皮泥或指甲油柱塞。胚胎可能会改变在影片中的位置因其自然增长了。因此，最好是中心的感兴趣的区域中的视场的中部，并保持一定的空间的边缘，以适应这些运动。

在光路灌封介质的减少量的

正确地定向样品有助于实现最佳的图像质量15。基因反弹，激发和发射光应该通过尽可能少的组织和安装介质尽可能出行。最优解是自由琼脂糖安装。这是在一个安装例如实现为拟南芥侧根摄像14中，其中主要的根被安装到植物凝胶和侧根随后让完全生长出的凝胶柱。免费琼脂糖安装也为赤甲虫的完整胚胎的成像开发的两天12。图像质量的改善是不是在这种情况下，一个主要动机。赤胚胎根本不琼脂糖里面存活足够长的时间。绝对嵌入自由媒体的安装还没有实现在斑马鱼长期成像。尽管如此，我们可以采取的事实，即当琼脂糖固化，大多数胚胎对角线与位于深处的琼脂糖一只眼睛和第二眼睛贴近嵌入柱的表面定位在毛细管中。 ŧ他眼靠近表面提供卓越的图像质量，因此，应该优先成像。

琼脂糖浓度与长期成像

琼脂糖的用于安装浓度是样品的稳定性，并容纳胚胎的生长和扩散的氧气给它的可能性之间的折衷。有样品的稳定性没有附加增益用琼脂糖浓度高于1％时。作为起点用于优化实验中，我们推荐0.6％琼脂糖，这也适用于过于娇嫩被安装到1％琼脂糖胚胎年龄小于24高倍视野。到麻醉年长胚胎和幼虫中，MS-222的浓度可以提高到为200μg/ ml的无副作用13。

万一显影胚成像长于±12小时，不推荐琼脂糖安装，因为它限制了胚胎和CAUS的生长ES尾部变形。此问题是由安装成胚胎FEP聚合物管具有类似折射率水13,39解决的斑马鱼。小鼠胚胎，另一方面，可以在中空琼脂糖缸40或附连到注射器41的丙烯酸杆的孔固定。 FEP管子安装不推荐为缺省方法，但因为该管的壁折射光比琼脂糖稍多。

光片对齐

为了获得良好的画质是每个实验前进行自动光片定位的关键。特别是如果将变焦设置被改变时，目标被取出，或者在室中使用不同的液体。

照明

光片的透视扫描应该总是被激活。对于大的散射标本，有必要与在线˚F应用双面照明延髓实现跨越视场均匀的照明。双面照明也削弱了眼成像，这是入射光片通过胚胎的透镜的折射的特定问题。更小，更散射试样可以使用单面照明，其通过半缩短成像时间，并可能导致略微更好的图像质量相比，双面照明被有效地成像。这是因为在两个照明臂的光路总是不同的，更有效的人可以被选择。另外，从每一侧来的两个光片是从未完全在一个平面上，这将导致轻微的融合后模糊。对于非常快速的细胞内事件，如生长微管（ 电影2）时，双面照明是不恰当的，因为来自左和右与照明图像顺序，这可能导致的运动模糊被获取。

光漂白和光毒性

少荧光漂白被经常提到的LSFM的一大优势。我们会认为，目标应该是没有漂白的。如果在实时成像实验显漂白，试样可能已经出耐受激光曝光的其生理范围。当成像在旋转盘显微镜斑马鱼胚胎，根据我们的经验，高光毒性甚至可以在荧光信号明显漂白剂摊子前胚胎发育。因此，使得几乎没有或没有漂白观察在LSFM成像设置应进行调整。即使LSFM是平缓的样品，为谨慎起见，以使用根据需要来实现信噪比足够用于随后的数据分析仅作为多激光功率和曝光时间。

Z堆叠，时间间隔和数据大小

通过LSFM生成的文件通常都很大;有时在TB级范围内。它常常必须使图像质量和数据大小之间的折衷。特别是对于在时间推移采集栈和间隔中的Z间距的情况。定义的Z区间，在Z堆叠工具标签最优按钮应理想地使用，特别是如果数据集将在后面去卷积。它计算的间距，实现周边光切片之间重叠50％。尽管如此，稍大ž间隔通常是可以接受的。它们减少获得的Z堆叠以及最终文件大小所需的时间。的最佳时间取样取决于感兴趣的过程。对于整个眼睛发育5-10分钟的间隔通常是可以接受的。如果某些结构将被自动地跟踪，随后的时间点必须足够类似。

荧光珠

荧光珠主要作为基准标记用于注册不同的看法的多视点数据集到彼此。在使用前仔细始终涡珠的解决方案。不要加热珠粒，因为这可能会导致该荧光染料的损失。对多视点登记最优珠粒浓度必须通过实验确定。所描述的插件效果最好遍布每个视图约1000检测珠。大（500纳米或1000纳米）珠粒小于（小于500纳米）珠检测更加稳健。这是因为较大的珠是亮和更容易段而不与样品中的结构的假阳性检测。较大珠的缺点是，它们是在最后的熔融和反褶积图像非常突出。对于每个新的荧光标记物，合适的珠子尺寸和荧光发射必须进行优化。得到从图5和电影3样品的一个例子，100纳米的绿色发射的珠子，得到在膜-GFP通道太多假阳性检测，但1000Ñ与样品内很少阳性检测的H2B-RFP通道被鲁棒地探测米红色发射珠。如果胎圈检测与所述荧光标记物的信道出现故障时，只有包含珠的分离的通道能够获得，但是这不是很实用。子分辨率大小的珠子，得到显微镜的点扩散函数（PSF），它可以用于去卷积（ 图2C-D）的直接读出。如果登记和融合工作与大珠（ 例如 1000纳米）好，PSF的一个单独的图像可以用次分辨率， 例如 ，100纳米珠被收购。使用多色珠粒多信道采集的登记期间和验证该通道覆盖完全是有帮助的。

从未经随后的多视点配准和融合的单一视图成像时的荧光珠加成是没有必要的。然而，即使在这种情况下小珠可以是初始期间有帮助l光线​​表的调整来检查光片的质量和一般揭示光学像差。这样的光学像差可以从像损坏或弄脏目标，琼脂糖室或不均匀的窗户脏了各种的来源。珠也可以由多视点登记斐济插件20用于漂移校正。

多视点

对多视点重建目的，最好是获得一奇数的次3,5等，这是不彼此相对。由于专业服务公司是从不同方向拍摄这提高了反卷积。同样重要的是在时间推移采集的开始存在的视图之间足够的重叠进行确认。这最好凭经验完成， 也就是说 ，立即确认在第一时间点的观点，可以成功注册。当多视点采集的目标是要提高分辨率一个大的散射试样的图像的，它是不可取的图像中的每个视图整个标本，但阻止围绕样品，其中信号恶化的中心。从试样下半年的低质量的收购行动不会有用的信息给多视图重建的补充。

2.数据处理的关键步骤及故障排除

目前，存在从该是有据可查的，比较容易采用轻质板材镜多视点处理数据的几种可能性。我们使用多视点重建应用程序，这是斐济32（斯蒂芬Preibisch出版，实现了一个开源软件的链接1A和Link1b材料的列表）。这个插件是以前SPIM注册插件20的重大的重新设计，审查通过Schmied 等 42，集成了BigDataViewer和XML和HDF5格式33与SPIM登记工作流程（ 图1B， 链接2 ， 链接3 ）。本申请还可以适于高性能计算集群，其中显著加快处理43。这多视点注册申请正在积极进一步发展，精益求精。在出现问题或功能要求所描述软件的情况下，请您到相应的页面GitHub的（问题链接4的多视点重建和链接5为BigDataViewer）。

第二个选择是与显微镜一起使用可用的商业软件。该解决方案运作良好，并采用使用荧光珠注册不同意见的原理一样。但是，它缺乏可视化整个数据集快似与BigDataViewer的选项。另外，软件不能适于群集并进一步处理块为其他用户，除非该软件附加许可购买显微镜。

第三种选择，这也是一个开源软件，最近被凯勒实验室44公布，并提供了处理和光表数据的下游分析的全面框架。该软件利用信息从样本内执行多视点图像融合，因此它不要求在样品周围荧光珠的存在。但同时它假定的成像视图（目标）正交的方向，因此它不能被用于从任意角度44获得的数据。

硬件要求

ntent">用于处理的硬件可以在表4中找到。必须有足够的存储容量和可用的一个明确的管道进行数据处理，超前实际的实验。图像采集比随后的分析速度，很容易得到充斥着未处理的数据，这是往往是不现实的存储所有的原始图像，而是一个播种的版本或处理的图像，例如融合的观点，最大强度的预测或球形突出45。

处理器两个Intel Xeon处理器E5-2630（六核，2.30 GHz的涡轮增压，15 MB，7.2 GT /秒）
记忆 128 GB（16×8 GB）1600 MHz的DDR3 ECC RDIMM
硬盘 4×4 TB 3.5英寸串行ATA（7.200 RPM）硬盘驱动器
硬盘控制器 PERC H310 SATA / SAS精读对于控制器戴尔Precision
硬盘配置 C1 SATA 3.5英寸，1-4硬盘驱动器
图像双2 GB的NVIDIA Quadro 4000（2张卡W / 2个DP和1个DVI-I每个）（2 DP-DVI和2个DVI-VGA适配器）（MRGA17H）
网络英特尔X520-T2双端口10 GbE网络接口卡

表4:硬件要求。

数据处理速度

所需的数据处理的时间依赖于数据的尺寸和所使用的硬件。在表1中，我们提供的用于在处理与4次和2通道由1时间点的一个例子8.6 GB的多视点数据集的关键步骤所需要的时间的概述。

处理小号TEP 时间 协议的步骤
作为重新保存HDF5 6分30秒 6.3
检测兴趣点 20秒 6.4
注册使用兴趣点 3秒 6.5
基于内容的多视角融合 4小时 7.2
多视点去卷积（CPU）的 8小时 7.3
多视点去卷积（GPU） 2小时 7.3

表1:数据处理时间。

输入数据格式为多视点重建

斐济插件多视点重建可以支持.czi，.TIF和ome.tiff格式。由于.czi格式的数据结构的，不连续的数据集是不支持未经预处理。不连续意味着记录必须被重新启动（ 例如 ，调整由于漂移样品的位置）。在这种情况下，.czi文件需要被重新保存作为.TIF。对于文件的.tif每个视图和照射方向需要被保存为独立的文件。

像素大小的校准

显微镜的操作系统软件计算用于基于所选择的目标在xy像素大小校准。然而，在z中的像素大小是由步长独立地限定。如果在软件中指定了错误的目标，在X​​Y到Z的比例是不正确的注册将失败。

首次注册登记

定义数据集后注册数将是1和兴趣点的数量将在ViewSetup资源管理器为0。初始登记表示数据集的校准。无论是数量Ø˚F登记和兴趣点会在加工过程中增加。

向下采样检测的兴趣点

使用下采样建议，由于文件的装载和分割将会更快。值得注意的是，检测参数将根据下行采样发生变化，从而不同向下样本设置之间传送检测设置是不可能的是不过重要的。

兴趣点检测

这是明智的段在每个视图许多真正的珠可能，甚至在一些获取误报检测的价格，因为他们不妨碍登记增色不少。虚假检测，如果在几号，在注册过程中（见兴趣点注册）排除在外。然而，大量的假阳性检测姿势的算法的一个问题。它不仅降低性能，用于检测和登记，因为它需要更长的时间来分割图像以及在视图之间进行比较这些珠，但它也降低了登记的准确性。这可以通过使用更严格的检测参数来解决。此外，在珠粒（ 即在一个胎圈图1E多次检测）分割是不利的注册，应该避免。

兴趣点报名

要注册到的意见彼此，在每个视图每个珠子的位置是由它的位置相对于它的三个最邻近珠介绍。这些星座都形成了局部几何描述，并允许比较视图之间每个珠子。然后用两种观点之间的匹配描述珠被视为候选人对应。注意，这仅适用于随机分布珠的量，局部描述符是通常对每个珠是唯一的。人们可以使用其他结构，如样品登记在细胞核。然而，为了检测核，其分布的非随机样品中，其它方法应用20,21。

候选的对应，然后针对RANSAC 36以排除假阳性测试。每个对应的提示进行叠加的看法上互相转换模型。真正的信件将在一个转型模式有可能达成一致，而离群将每个点一个不同的。那么真正的对应被用于计算两个被比较的视图之间的仿射变换模型。用一种迭代优化算法的全局优化 ，然后进行，在此期间，所有的视图被注册到具有最小位移的观点20,21之间的目标的第一个图。

时间推移注册

由于移动显微镜载物台的琼脂糖和不精确电机运动的彪，每个堆栈的位置随时间适度变化。而各个时间点的登记删除这个时间点的视图之间的差，所述时间推移也需要被登记为一个整体。为此目的，每个单独的时间点被登记到参考时间点。

参考时间点

如果有许多时间点的时间序列进行处理，有代表性的时间点从时间系列的中间选择作为参考，通常自胎圈强度可以随时间降解，由于漂白。在此参考，兴趣点检测，登记，边框和融合的参数才能确定。然后这些参数被应用到整个时间推移计算​​每个单独时间点的特定变换模型。在时间推移注册的所有其他时间点也REGIST空间ERED到这个参考时间点。因此，对于整个记录的边界框的参数取决于这特定时间点。

多通道注册

当成像多个通道，理想相同的荧光珠应在所有成像的频道可见。的检测和注册然后可以单独地每个通道，其中考虑到在转化的不同的光的波长的影响上进行。通常这是不可能的，因为珠子并非在所有的频道可见或珠粒主导图像中的一个信道太多，并且在其他信道（多个）太暗淡。典型的解决方案是仅在用于检测和登记所获取的变换模型中的一个信道以使用可见珠（ 即检测后，登记和时间推移注册）然后通过斐济>插件>多视点Reconstr施加到其它通道，减税>批处理>工具>重复转换，在下拉菜单中选择申请一个 通道 转换 成其他渠道 。在下面的窗口中选择XML，然后单击确定 。然后选择包含珠源通道和目标通道选择无珠通道（S）的通道。 重复该转换使用更换所有的转换 ，然后按确定 。然后变换被复制到其他所有通道，并保存在XML 要看到ViewSetup资源管理器中新的变革，重新启动的MultiView重建中的应用。

边框

的多个视图融合在计算上是非常密集。然而，大图像通常是收购，以适应不只是样品，而且周围的珠子。一旦注册参数s的从珠粒中提取，它们是作为图像的一部分不再有用。因此，为了提高融合效率，只包含样本的图像栈的部分应熔合在一起。感兴趣（边界框）的区域应该被定义为包含样品和尽可能少的周边琼脂糖越好。对于图2中的实施例与2229×2136×2106像素的整个体积上的加权平均的融合将需要38196 MB的RAM，而用一个边界框的体积减小1634×1746×1632像素和存储器要求降低至17,729 MB。

基于内容的多视角融合

在融合多视点数据所面临的挑战是，通常的看法突然终止，并且不包含在同一像素相同的图像质量。因此，意见简单平均会导致混合文物和不必要的图像退化。基于内容的多视角福锡永取这两个问题考虑在内。首先，它融合了不同的视图，其中，一个图象结束，另一个开始，第二，它评估本地图像质量和在融合21到更高的图像质量施加较高的权重。相比于单一视图有决议Z中的改善与XY（ 图2E-H，图5A-D）的信号略有下降。

多视点反褶积

多视点去卷积是另一种方式来实现的观点融合。用这种方法的不同视图还的PSF都考虑到为了恢复已卷积通过显微镜的光学系统的图像。此方法大大通过去除图像模糊和增加信号31（ 图2C-D，图2I-J， 图5E-G， 电影3）的分辨率和对比度提高了图像质量。

ve_content">解卷积的计算非常密集（ 见表1），因此，使用用于处理GPU增加了这种过程的速度，也可能有必要对向下取样数据执行反卷积。为了向下样品，使用斐济>多视点重建>批处理>工具>应用转换 ，这将适用于将被保存在.xml文件的意见，一个新的转型模式。

对于BigDataViewer和BigDataServer HDF5文件格式

该BigDataViewer 33允许TB级数据的方便的可视化。如何控制BigDataViewer总结于表2中 。该程序的基本操作的截屏，也可作为原文出版物33补充。该BigDataViewer集中在一个.xml文件，其中包含元数据，和一个HDF5文件，其中包含的图像数据。该图像数据是PRES耳鼻喉科在三维块多分辨率级别的HDF5。多重分辨率级别允许与较低的分辨率可视化数据的速度更快，以前全分辨率被加载。在需要时个别块只加载到内存中。因此，HDF5图像格式允许数据直接和快速的可视化通过BigDataViewer 33。由于文件的加载被更有效地进行，也加快了处理。因此，我们建议重新保存数据集到该格式，虽然它并不严格要求的处理。的数据格式的进一步的解释，请参阅链路3 。此外，该数据集可以与合作者或使用BigDataServer 33（公共共享链路6 ）。

键 效果
F1 显示了与BigDataViewer的简要描述及其基本操作的说明
<>或鼠标滚轮在Z轴运动
向上和向下箭头放大和缩小
右键单击并拖动在浏览器移动样本
左键单击并拖动旋转样品光标周围
滑块观众或Tab键和左或右箭头的底部在时间轴上移动
此外按下Shift 沿任意轴快移动或旋转
x和再向左和向右箭头绕x轴旋转
Y然后左，右箭头绕y轴旋转
z和再左，右箭头绕z轴线旋转
转变和X 沿定向X轴的视图
转变和y 沿定向y轴的视图
转变和z 沿定向z轴视图
一世不同的插值模式之间切换（ 即近邻和三线性）
s或设置>亮度和对比度修改频道，亮度和对比度的彩色
F6或设置>公开性和分组更改显示的群体，使分组通过数字键覆盖不同群体和呼叫组
F10或工具>录制电影获取时间序列当前显示的切片的

表2:大数据查看器。

3.所述实施LSFM的局限性

低吞吐量

在一个典型的LSFM实验只有每个实验一个样本成像。不过，根据我们的经验，很多有用的信息可以从单个样本中提取。多个胚胎的高通量成像已建成的家设置LSFM在46-48样品定位和旋转的自由为代价最近取得，虽然一般。

渗透不足深入到组织

即使斑马鱼的胚胎是半透明，由于散射和吸收成像在组织更深时所获得的图象质量迅速恶化。部分，这是由样品所发射的荧光的散射和吸收的效果，并且不能在当前的设置进行校正。图像质量不均匀的另一个来源是不规则照明。 ŧ他光片是从左侧或右侧入射，并在它的路径折射它，这导致条纹伪影和模糊的任何对象。的双面照明和多视角的融合可以减少最终图像中的假象。最后，图像质量趋于朝向视场的边缘略差由于光片，其是变向边缘厚的自然几何形状。

有限公司化学处理

使用药物或抑制剂是在斑马鱼的研究普遍。在这种显微镜使用药物被限制，由于样品室和所述仪器中的其他用户，谁共享相同的腔室的考虑因素的大体积。使用专用药物实验额外室可以解决这个问题。用玻璃珠部分地填充腔室减少所需的液体的体积。

没有photomanipulation

柯伦TLY没有像光转化，或在这种显微镜激光烧蚀本地化光学操控的可能性。尽管如此，家建设置可以用于这样的特定应用。

4.意义和未来的应用

LSFM可用迄今活胚胎大体积的快速成像的最佳方法。最上的共焦显微镜可以设想的实验也可以在与上述的优点的光片显微镜进行。在眼球发育中成像的情况下，LSFM的速度不是关键的参数。相反，低光毒性和灵活性样品定位是决定性的优点。

所述LSFM数据具有高的信噪比，这有助于实现良好的卷积结果和也是用于自动化图像分析和对象跟踪是有利的。总之，LSFM是在胚胎发育和overa产生可量化的数据一个伟大的工具LL细胞和用于随后模拟和有问题的过程的物理描述组织特性。

披露

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此视频文章出版是由蔡司支持。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢 Tobias Pietzsch 提供了他强大的开源软件 BigDataViewer。我们感谢马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所 （MPI-CBG） 的光学显微镜设施，即 Jan Peychl、Sebastian Bundschuh 和 Davide Accardi 提供技术援助，对研究中使用的显微镜进行完美维护，并对手稿和对手稿的评论以及 H. Moon（MPI-CBG 科学计算设施）为 BigDataServer 提供。我们感谢 Julia Eichhorn 组装了 Movie 1。Norden 实验室成员和 Svea Grieb 对手稿提供了许多有用的评论。Jaroslav Icha、Christopher Schmied 和 Jaydeep Sidhaye 是国际马克斯普朗克细胞、发育和系统生物学研究学院的成员，也是德累斯顿工业大学的博士生。Pavel Tomancak 得到了 ERC 启动资助：发展演变沙漏模型的定量分析和人类前沿科学计划青年研究员资助 RGY0093/2012 的支持。Caren Norden 得到了人类前沿科学计划 （CDA-00007/2011） 和德国研究基金会 （DFG） [SFB 655， A25] 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
光片 Z.1 显微镜卡尔蔡司显微镜
低熔点琼脂糖Roth6351.1
低熔点琼脂糖SigmaA4018 或 A9414
3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 （MESAB/MS-222/三卡因）SigmaE10521
N-苯硫脲 （PTU）SigmaP7629
500 nm 红色荧光珠 F-Y 050Millipore （Estapor）80380495
20 &μ;L （1 毫米内径，标记为黑色）帽部701904作为20个的Transferpettor
特氟龙尖柱塞的备件出售;μl 毛细管品牌701932作为 transferpettor 的备件出售
圆形玻璃盖玻片直径 18 mm，所选厚度 0.17 mmThermo Scientific （Menzel-Glaser）
用于腔室窗口的 O 形圈 17×1.5 毫米Carl Zeiss 显微镜
镊子，55 型Dumont0209-55-PO
50 毫升 Luer-Lock 注射器Becton Dickinson300865
150 cm 输液延长电缆 与 Luer-Lock 注射器兼容Becton Dickinson397400
链接
链接 1 多视图重建应用程序https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
链接 2 大数据查看器https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewerhttp://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 多视图重建应用程序问题https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
链接 5 BigDataViewer 问题https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
链接 6 BigDataServerhttp://fiji.sc/BigDataServer
品牌

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