社会性变形虫Dictyostelium discoideum在饥饿条件下会经历发育转变，形成多细胞生物。进化上保守的蛋白coronin A在发育起始过程中发挥关键作用。我们以聚集实验为主要方法，旨在阐明coronin A在早期发育中的功能。
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摘要
摘要
Dictyostelium discoideum 变形虫存在于土壤中，以细菌为食。当食物来源变得匮乏时，它们会分泌因子以启动多细胞发育程序，在此过程中单个细胞通过趋化性向聚集中心迁移1-4。该过程依赖于环磷酸腺苷（cAMP）的释放5。cAMP 通过腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的协同作用呈波浪式产生，并与G蛋白偶联的cAMP受体结合6,7。一种广泛使用的分析低等真核生物 Dictyostelium discoideum 发育周期机制的实验方法，是基于在浸没条件下观察细胞聚集现象8,9。本实验方案描述了通过在平衡盐溶液（BSS）中对培养皿中的细胞进行饥饿处理，来分析冠蛋白A（coronin A）在发育周期中的作用10。冠蛋白A是高度保守的冠蛋白家族成员之一，该家族蛋白已被发现参与多种生物学活动11,12。Dictyostelium 中缺失冠蛋白A的细胞无法形成多细胞聚集体，而这一缺陷可通过外加cAMP脉冲信号得以挽救，提示冠蛋白A作用于cAMP级联反应的上游10。本研究所描述的技术为探究在cAMP级联反应上游、Dictyostelium discoideum 发育周期初始阶段中蛋白质的功能提供了可靠工具。因此，利用该聚集实验可进一步研究冠蛋白A的功能，并推动我们对冠蛋白生物学的理解。
引言
冠蛋白家族在真核生物中具有高度保守性。这类蛋白的特征是含有一个位于氨基末端、包含色氨酸-天冬氨酸（WD）重复序列的区域，其后是一个独特区域，再连接至一个羧基末端的卷曲螺旋结构域13,14（图1）。冠蛋白已被发现参与多种细胞功能，包括细胞骨架调控和信号转导12。在哺乳动物中，最多可共表达六种短型冠蛋白分子（冠蛋白1-6）以及一种“串联”型冠蛋白712,15。其中冠蛋白1是研究最为深入的家族成员，已被证实参与病原体清除、T细胞存活以及神经元信号传导。然而，冠蛋白1具体如何执行这些功能仍不明确。尽管已有研究表明冠蛋白1可调控Ca2+和cAMP依赖性信号通路以及F-肌动蛋白细胞骨架的调节16-18，但由于哺乳动物中最多可共表达七种冠蛋白家族成员，可能存在功能冗余，因而给在这些系统中研究冠蛋白的分子功能带来了挑战。与哺乳动物不同，低等真核生物Dictyostelium discoideum仅表达两种冠蛋白家族成员（冠蛋白A，即哺乳动物冠蛋白1的直系同源物；以及冠蛋白B，即哺乳动物冠蛋白7的直系同源物），且二者功能明显不冗余15,19,20。这一特点使Dictyostelium discoideum成为研究冠蛋白功能的有力模型。
为了研究冠蛋白A（coronin A）在Dictyostelium discoideum中的作用，我们通过在含有平衡盐溶液（BSS）缓冲液的组织培养板中进行饥饿处理，诱导野生型细胞或缺乏冠蛋白A的细胞启动发育周期10。我们发现，缺乏冠蛋白A的细胞在饥饿条件下无法形成多细胞聚集体。为了对该表型进行精确的定量评估，本实验方案中描述的自动活细胞成像技术是一项至关重要的工具。缺乏冠蛋白A的细胞在早期饥饿反应启动方面的缺陷可通过外源施加cAMP脉冲得以挽救，这表明冠蛋白A作用于cAMP级联反应的上游。过去多个实验室已采用外源性cAMP脉冲来模拟发育的启动过程8,9。然而，该方法已知对细胞密度和处理时机高度依赖。因此，本文所述方案旨在降低这些变量的影响，以确保高度的可重复性。综上所述，本研究中采用的技术为研究Dictyostelium discoideum发育周期早期阶段蛋白质功能提供了可靠的工具，并有望鉴定出冠蛋白A功能的上游及下游效应分子。
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方案
- 观察早期饥饿反应 Dictyostelium discoideum 通过延时显微镜观察。
- 培养 DH1.10 细胞或 corA-在含有HL-5培养基（每升：蛋白胨5 g，硫胺素蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母提取物5 g，Na 0.35 g）的锥形瓶中培养缺陷细胞2HPO4*7H2O，0.35 g KH2PO4，0.05 g 硫酸二氢链霉素，pH 6.6）中，于 22 °C、160 rpm 摇床培养箱中培养。保持细胞密度在 0.01 × 106 细胞/毫升 和 2 × 106 细胞/毫升
- 通过收集对数期生长的 DH1.10 细胞，观察细胞聚集现象21 或 corA缺陷细胞10 在 DH1.10 背景下培养，在 22 °C 条件下于 HL-5 培养基中振荡培养。操作时取适量细胞（通常为 10 至 50 ml），在 400 × g 条件下离心 3 分钟，并用 BSS（10 mM NaCl、10 mM KCl、2.5 mM CaCl₂）洗涤细胞两次2，pH 6.5）。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后以 (5, 10, 20 或 40) × 10⁵ 个细胞/孔的密度接种细胞。4 细胞/厘米²2 在24孔板中，于BSS中22 °C下孵育1小时以促进贴壁。
- 通过时间推移显微镜观察聚集现象，方法如前所述10，每隔135秒拍摄一次图像，使用配备5倍物镜和电子倍增电荷耦合器件相机的活细胞成像系统，并通过相应软件自动控制（参见 材料表).
- cAMP脉冲处理 盘基网柄菌 饥饿条件下的细胞
- 检测外源性cAMP脉冲对DH1.10细胞发育的影响21 或 DH1.10 corA缺陷细胞10，通过收集细胞。为此，取适量细胞（通常为10至50 ml），在400 × g下离心3分钟，并用BSS洗涤两次。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬至密度为 1 x 107 细胞/ml，置于BSS中。在施加脉冲前，于22 °C下以160 rpm振荡培养2小时。使用由定时器控制的蠕动泵添加cAMP脉冲。设置泵在5小时内每6.5分钟输送一次5秒的脉冲，每次脉冲为15 µl的50 nM cAMP（终浓度）。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，以 (5, 10, 20 或 40) × 104 细胞/厘米²2 在24孔板中，于BSS中孵育1小时以促进贴壁。
- 在22 °C条件下孵育16小时后，使用5倍物镜通过明场显微镜观察聚集现象。
- 诱导 盘基网柄菌 通过暴露于条件培养基实现发育
- 按照所述方法制备新鲜的条件培养基22收集对数期的 DH1.10 细胞21 或 DH1.10 corA缺陷细胞10，从在22 °C下用HL-5培养基振荡培养的样品中，用移液器取样，400 × g离心3分钟，并用PBM（0.02 M磷酸钾，10 µM CaCl₂）洗涤细胞三次2，以及 1 mM MgCl2，pH 6.1。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以每毫升1 × 10⁶个细胞的密度重悬于PBM中7 细胞/ml，于22 °C、110 rpm条件下振荡培养20小时。
- 离心后收集上清液，离心条件为400 × g × g 离心 3 分钟，然后在 8,000 g 下离心澄清 × 4°C 下 15 分钟，1000 × g 离心。
- 将培养基质通过0.45 µm滤膜过滤（参见 材料表）并在PBM中三倍稀释。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以 (5, 10, 20 或 40) × 10⁵ 个/mL 的密度接种4 细胞/厘米²2 在24孔板中，于22 °C孵育1小时使其贴壁。
- 将细胞的培养上清液更换为预先准备好的条件培养基。
- 使用5倍物镜通过明场显微镜在16小时后观察聚集情况。
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结果
缺乏冠蛋白A的细胞在早期发育过程中表现出缺陷（图2）。在缺失冠蛋白A的情况下，细胞无法形成多细胞聚集体，而多细胞聚集体的形成是盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）发育周期的初始步骤。因此，冠蛋白A似乎在早期饥饿应答和/或cAMP信号传导过程中发挥作用。事实上，在缺乏冠蛋白A时，多细胞聚集体无法形成，同时伴随着cAMP信号减弱10。然而，外源性cAMP脉冲处理可完全恢复野生型表型（图3）。这表明冠蛋白A并非直接参与cAMP信号传导，而是作用于cAMP级联反应的上游（图5）。当盘基网柄菌（Dictyostelium）细胞处于饥饿条件时，会诱导分泌早期饥饿因子22,23。其中，研究最为清楚的参与早期饥饿应答的因子之一是条件培养基因子（conditioned medium factor, CMF）22。基于我们的研究结果，我们推测冠蛋白A可能通过调控这些...
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讨论
冠蛋白存在于真核生物分支的大多数分类群中。Dictyostelium discoideum 的冠蛋白A是哺乳动物冠蛋白1的同源物，参与早期饥饿反应，因为缺乏冠蛋白A的细胞在早期发育周期中无法形成聚集中心10。为了能够定量且准确地评估不同菌株之间发育延迟的情况，配备自动载物台控制器的显微镜活细胞成像系统是一种必不可少的工具。
D. discoideum 在其生命周期的多个阶段利用cAMP作为关键的信号分子1-4cAMP发挥作用的检查点之一是细胞从单细胞状态向多细胞结构形成的转变过程。在饥饿约6小时后，cAMP波的出现被细胞感知，并提供趋化信号，引导细胞向聚集中心移动。5这些cAMP波可以通过对饥饿细胞进行脉冲处理在实验中模拟 D. discoideum 每6.5分钟用cAMP处理细胞一次，持续5小时8,9采用此实验方案时，应用cAMP脉冲刺激前需对细胞进行长达2小时的饥饿处理，以获得可靠结果。利用该实验设置，我们能够证明coronin A作用于...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 Dictyostelium 菌种保藏中心提供的菌株和试剂。本研究由瑞士国家科学基金会和巴塞尔州的资助项目提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HL-5培养基（配制1 L：蛋白胨5 g，硫胺素蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母提取物5 g，NaH₂PO₄·H₂O 3.5 g，用蒸馏水定容至1 L）2HPO4*2H2O，0.35 g KH2PO4，0.05 g 硫酸二氢链霉素，pH 6.6 | |||
| 蛋白胨 | BD生物科学 | 211693 | |
| 硫代酮E蛋白胨 | BD生物科学 | 211684 | |
| 酵母提取物 | BD生物科学 | 212750 | |
| 葡萄糖 | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| 硫酸二氢链霉素 | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM（0.02 M 磷酸钾，10 μM CaCl2，以及 1 mM MgCl2，pH 6.1 | 自制 | ||
| BSS（10 mM NaCl，10 mM KCl，2.5 mM CaCl₂）2，pH 6.5 | 自制 | ||
| 0.45-μm Filtropure S 滤膜 | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24孔细胞培养板 | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver 显微镜 | Zeiss | 定制构建 | |
| AxioVision 软件 | Zeiss | ||
| IPC 微处理器–可控分配泵 | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M 显微镜 | 蔡司 | 491237-0001-000 | |
| 孵育摇床 | Inforst HT Minitron |
参考文献
- Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
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