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方法文章

一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

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DOI：

10.3791/53974

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2016年6月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

本文内容

摘要

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。

摘要

纤维化常参与多种慢性进行性疾病（如间质性肺病）的发病过程。其病理特征是成纤维细胞灶的形成，且与疾病的严重程度相关。构成成纤维细胞灶的间充质细胞可能来源于多种细胞前体，包括肺内原本存在的固有成纤维细胞以及来自骨髓的循环纤维细胞。近年来研究还提出，经历上皮-间充质转化（EMT）的间充质细胞也可能参与纤维化的发病机制。此外，转化生长因子β可诱导EMT，而肿瘤坏死因子α等促炎性细胞因子可增强EMT过程。凝胶收缩实验是一种理想的体外模型，可用于评估成纤维细胞特有的功能之一——收缩能力，该功能参与伤口修复及纤维化过程。本文展示了利用凝胶收缩实验来评估经历EMT的间充质细胞收缩能力的方法。

引言

纤维化参与多种慢性进行性疾病的发病机制，如间质性肺病、心脏纤维化、肝硬化、终末期肾衰竭、系统性硬化症以及自身免疫性疾病1。在间质性肺病中，特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性疾病，预后较差。IPF的病理特征是出现成纤维细胞灶，其由活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞构成，并与疾病预后相关。此类肺成纤维细胞的来源被认为可能来自多种间充质细胞，包括原本存在于肺组织中的固有成纤维细胞以及来自骨髓的循环纤维细胞。近年来，上皮-间充质转化（EMT）被认为与间充质细胞的形成有关，并可能参与纤维化疾病的发生发展过程2。

人们认为，上皮-间充质转化（EMT）在胎儿发育、伤口愈合以及癌症进展（包括肿瘤侵袭和转移）过程中发挥着重要作用3。经历EMT过程后，上皮细胞通过丢失上皮标志物（如E-钙黏蛋白）并表达间充质标志物（如波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）），获得间充质细胞的特性4,5。先前的研究表明，EMT过程与肾脏6和肺部7组织纤维化的发生有关。此外，慢性炎症可促进纤维化疾病的发生8；并且，诸如肿瘤坏死因子超家族成员14（TNFSF14；LIGHT）、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素-1β等炎症性细胞因子已被证实能够增强EMT9-12。

胶原凝胶收缩实验，一种基于胶原的细胞收缩实验，其中成纤维细胞三维包埋于I型胶原凝胶中，是一种理想的 体外 用于评估收缩力的模型。收缩力是成纤维细胞的特征性功能之一，参与正常的伤口修复及纤维化过程13在此实验中，通常认为成纤维细胞通过依赖整合素的机制附着于I型胶原，在某些条件下可产生机械张力，进而导致组织收缩。

本文报道了凝胶收缩实验的建立，该方法经过改良可用于评估经历上皮-间质转化（EMT）的细胞获得收缩功能的情况。本研究表明，这种改良后的实验方法适用于评估经历EMT的间充质细胞的收缩能力。

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方案

1. 肺上皮细胞的准备与培养

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 IU/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养A549人肺上皮细胞（贴壁细胞系）。
  2. 从培养皿中移除并弃去细胞培养液，用5–10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。洗涤后立即吸除PBS。
  3. 加入2 ml 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（0.05%），在37 °C、5% CO2条件下孵育3分钟。
  4. 将脱落的细胞收集至含有细胞培养基的离心管中，在室温下以150 × g离心4分钟。
  5. 用2 ml细胞培养基重悬细胞沉淀，并取样进行细胞计数。使用台盼蓝染色和血细胞计数板测定细胞数量并检测细胞活力。
  6. 在10 cm聚苯乙烯培养皿中，以每皿0.5–1.0 × 106个细胞的密度接种A549细胞，每皿加入10 ml培养基用于凝胶收缩实验；在6孔聚苯乙烯培养板中，以每孔0.5–1.0 × 105个细胞的密度接种A549细胞，每孔加入2 ml培养基用于EMT验证。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。

2. EMT 实验步骤

  1. 向第1.6步接种用于凝胶收缩实验的培养板中加入10 µl TGF-β1（5 µg/ml）和10 µl TNF-α（10 µg/ml）。向第1.6步接种用于EMT验证的培养板中加入2 µl TGF-β1（5 µg/ml）和2 µl TNF-α（10 µg/ml）。在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。

3. 通过 PCR 和蛋白质印迹法验证 EMT 过程

  1. 使用相差显微镜确认经处理细胞形态的变化（从铺路石样变为纺锤形）。
    注意：正常的 A549 细胞呈铺路石样和三角形，这是上皮细胞的特征；但在经 TGF-β1 和 TNF-α 刺激后，细胞呈现细长的纺锤形，类似于间充质细胞14,15。
  2. 通过 PCR 或蛋白质印迹法检测上皮标志物（如 E-钙黏蛋白）以及间充质标志物（如 N-钙黏蛋白、波形蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白）的表达。
    1. 使用 RNA 提取试剂盒16从细胞中提取总 RNA，并根据制造商说明书使用逆转录酶17合成 cDNA。
    2. 根据制造商说明，使用实时 PCR 系统18和单体氰染料 PCR 试剂盒检测 mRNA 表达水平。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、ACTA2（α-肌动蛋白-2）、CDH1（钙黏蛋白-1；E-钙黏蛋白）和 VIM（波形蛋白）的特异性引物见表 1。
    3. 使用含有 1% 蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（表 2）裂解细胞。使用蛋白定量试剂盒19,20测定所有样品的蛋白浓度，并将等量蛋白上样至聚丙烯酰胺凝胶。
      1. 进行 SDS 凝胶电泳，并将蛋白半干转至 PVDF 膜21。将膜在封闭缓冲液中与一抗孵育 1–2 小时。孵育后，用洗涤缓冲液洗涤膜两次，再与二抗孵育 1 小时。
        注意：有关本研究中使用的一抗及其稀释比例，请参见材料/设备表。封闭缓冲液的成分见表 2。
      2. 用洗涤缓冲液洗涤膜两次。使用冷 CCD 相机11,23和蛋白质印迹检测试剂盒22拍摄膜图像。

4. 用于评估 EMT 的凝胶收缩实验

  1. 从细胞培养容器中吸除条件培养基，并用 5 - 10 ml PBS 充分洗涤以去除死细胞。洗涤后立即吸除 PBS。
  2. 加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 分钟。
  3. 将脱落的细胞收集至含有添加胰蛋白酶抑制剂（1 mg/ml）的 DMEM 的离心管中，在室温下以 150 ×g 离心 4 分钟。
  4. 将 I 型胶原凝胶与蒸馏水及 4× 浓缩 DMEM 混合，调节体积以获得终浓度为 1.75 mg/ml 的胶原和 1× DMEM 浓度。此步骤中务必将凝胶介质置于冰上。
    注意：配制 6 ml 凝胶介质时，将 3.5 ml I 型胶原凝胶（3 mg/ml）、1.5 ml 4× 浓缩 DMEM 和 1 ml 蒸馏水充分混合。
  5. 用 500 µl PBS 重悬细胞沉淀，并取样进行细胞计数。使用血细胞计数板结合台盼蓝染色检测细胞活力。
  6. 加入凝胶介质调节体积，使细胞密度达到每孔 3.0 × 105 个细胞（6.0 × 105 个细胞/ml），并通过移液轻轻而迅速地混匀，避免发生凝胶化。
  7. 迅速且小心地将 0.5 ml 混合液加入 24 孔未处理培养板的每个孔中，形成整齐的圆柱形结构。注意避免气泡污染凝胶（图 1A）。
    注意：含细胞的凝胶介质黏稠，易发生凝胶化并在孔中形成新月形。
  8. 将培养板置于细胞培养箱中，在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育 15 分钟，使其完全凝胶化。
  9. 用无菌刮铲沿单一方向划圈，将凝胶从培养板上轻轻剥离而不破坏其结构。使用刮铲小心地将凝胶转移至含有 5 ml DMEM/1% FBS（可含或不含 TGF-β1（5 ng/ml）和 TNF-α（10 ng/ml））的 60 mm 组织培养皿中。
  10. 轻轻摇动培养皿，确保凝胶漂浮于培养基表面。置于细胞培养箱中，在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下继续孵育。

5. 凝胶尺寸的测量

  1. 使用图像分析系统在 0、24、48 和 72 小时后测量胶原凝胶的尺寸。
    1. 打开凝胶成像系统（图 2A），将培养皿放入遮光柜中，然后在柜内取下培养皿的盖子。
    2. 启动相应的凝胶分析软件。点击菜单栏中的 "图像采集按钮"，以显示柜内凝胶的图像。然后点击菜单栏中的 "采集"按钮，拍摄凝胶图像（图 2B）。
    3. 点击菜单栏中的 "检测按钮"（图 2C），通过拖动鼠标调整测量区域（图 2C 中的黄色圆圈）。然后点击菜单栏中的 "自动检测按钮"（见 图 2D 中的按钮），软件将自动识别凝胶并显示热图（图 2D）。
    4. 点击 "确定"，通过图像处理提取凝胶轮廓，并计算轮廓所包围的面积（图 2E）。面积计算完成后，结果将在单独的弹出窗口中显示。
      注意：如果成像过程中凝胶相互重叠，请使用无菌移液器吸头轻轻移动凝胶。

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结果

在 EMT 过程中，上皮细胞失去上皮标志物（如 E-钙黏蛋白），并获得表达间充质标志物，例如波形蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白4,5。用 TGF-β1 和 TNF-α 孵育 A549 人肺上皮细胞可诱导 EMT。正常的 A549 细胞呈鹅卵石样或三角形，这是上皮细胞的典型特征（图 3A）；但在经 TGF-β1 和 TNF-α 刺激后，细胞形态转变为细长的梭形，类似于间充质细胞（图 3B）。

通过检测上皮和间充质标志物的表达，以确认细胞是否发生上皮-间充质转化（EMT）。相对mRNA表达量采用ΔΔCt法计算，各数据均以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化。经TGF-β1和TNF-α处理48小时后，A549细胞中CDH1的表达显著降低，而VIM和ACTA2的表达显著升高（图4A

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讨论

本研究建立的实验方案包括两个步骤。第一步用于诱导上皮-间质转化（EMT），第二步为凝胶收缩实验。由于确认细胞是否发生EMT至关重要，因此第二步可很好地补充形态学和基因表达的变化。既往研究表明，A549细胞的EMT仅由TGF-β1诱导24；然而，正如我们先前所报道的10，TNF-α处理可增强EMT并促进间充质细胞标志物的获得。目前认为，TGF-β介导的EMT机制依赖于Smad通路25。TNF-α可增强TGF-β1诱导的EMT，从而促进凝胶收缩。已有研究报道，TNF-α增强TGF-β1诱导EMT的机制不仅涉及Smad2连接区的磷酸化，还包括对MAPK信号通路的调控26。因此，本研究建立的实验方案包含了TGF-β1和TNF-α的联合刺激。

将经历上皮-间质转化（EMT）的细胞包埋于I型胶原凝胶中，并使其在培养基中悬浮，是本实验的关键步骤（步骤4）。由于凝胶质地柔软且易受损，且各面尺寸不一，因此在将凝胶转移至培养基中以及测量其尺寸时需格外小心。若此步骤操作困难，可采用另一种替代方法，即在不将凝胶转移至6...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢小山忠博士提供的技术支持。本工作部分由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号23249045、15K09211、15K19172）资助；日本厚生劳动省呼吸衰竭研究组资助项目；以及日本过敏性疾病与免疫学研究基金资助项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMsigma aldrich11965-092用于 A549 培养基
FBSGIBCO10437
转化生长因子-β1，人源，重组Wako 实验室化学品209-16544
重组人 TNF-αR&D systems210-TA/CF
E-钙黏蛋白 (24E10) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology#31951:3,000 稀释
波形蛋白 (D21H3) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology#57411:3,000 稀释
抗-α-微管蛋白抗体sigma aldrichT90261:10,000 稀释
单克隆抗肌动蛋白，α-平滑肌抗体 sigma aldrichA52281:10,000 稀释
抗 N-钙黏蛋白抗体BD Transduction Laboratories#6109201:1,000 稀释
抗小鼠 IgG，HRP 标记全抗体（山羊）（二抗）GE HealthcareNA931-100UL1:20,000 稀释
抗兔 IgG，HRP 标记全抗体（驴）（二抗）GE HealthcareNA934-100UL1:20,000 稀释
封闭试剂GE HealthcareRPN418在 TBS-T 中配制成 2%
6 孔透明平底 TC 处理多孔细胞培养板，带盖corning#353046
100 mm 细胞培养皿TPP#93100
DMEM，粉末life technologies12100-046用于配制 4× DMEM
Ⅰ型胶原凝胶Nitta gelatinCellmatrix type I-A
24 孔细胞培养板AGC TECHNO GLASS1820-024
凝胶成像系统 ATTOAE-6911FXN凝胶成像仪
凝胶分析软件ATTODensitograph，ver. 3.00与 AE-6911FXN 配套的分析软件
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红life technologies25300054
24 孔板，未处理IWAKI1820-024
台盼蓝溶液，0.4%life technologies15250-061
RNA 提取试剂盒Qiagen74106
逆转录酶life technologies18080044
实时 PCR 系统StratageneMx-3000P
SYBR green PCR 试剂盒Qiagen204145
蛋白酶抑制剂混合物（100×）life technologies78429
PVDF 膜ATTO2392390
蛋白定量试剂盒bio-rad5000006JA 
聚丙烯酰胺凝胶ATTO2331810
Western 印迹检测试剂GE HealthcareRPN2232
冷 CCD 相机ATTOEz-Capture MG/ST
胰蛋白酶抑制剂sigma aldrichT9003-100MG
聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯Wako 实验室化学品163-11512
聚氧乙烯（9）辛基苯基醚Wako 实验室化学品141-08321

参考文献

  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

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