的发展体外检测以确定间充质细胞将经历上皮 - 间质转化的收缩功能

Summary

在这里，我们描述了凝胶收缩测定的开发和应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。

Abstract

纤维化常参与间质性肺疾病等各种慢性进行性疾病的发病机制。病理标志是成纤维细胞病灶的形成，这与疾病的严重程度有关。由成纤维细胞病灶组成的间充质细胞被认为来源于多种细胞来源，包括最初驻留的肺内成纤维细胞和来自骨髓的循环纤维细胞。最近，经历上皮-间充质转化 （EMT） 的间充质细胞也被认为有助于纤维化的发病机制。此外，可以通过转化生长因子 β 来诱导 EMT，并且可以通过促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子 α）来增强 EMT。凝胶收缩测定是评估收缩性的理想体外模型，收缩性是成纤维细胞的特征功能之一，有助于伤口修复和纤维化。在这里，证明了凝胶收缩测定法的开发，用于评估接受 EMT 的间充质细胞的收缩能力。

Introduction

纤维化参与多种慢性进行性疾病，如间质性肺疾病，心脏纤维化，肝硬化，终端肾功能衰竭，系统性硬化，和自身免疫性疾病¹的发病机制。间间质性肺疾病，特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性疾病，并显示预后差。 IPF的病理特点是成纤维细胞灶组成了与预后有关激活成纤维细胞和肌的发展。提出这样的肺成纤维细胞的起源是从几个间充质细胞，包括原驻地肺成纤维细胞和骨髓循环纤维细胞衍生的。最近，上皮-间质转化（EMT）已经提出了用间充质细胞²的形成相关联，并且有助于纤维化疾病的发病机制。

它被认为是电磁ŧ在胚胎发育过程中的重要作用，伤口愈合和癌症的进展，包括肿瘤侵袭和转移^3。以下EMT的过程中，上皮细胞的上皮标记物，如E-钙粘蛋白的损失获得间充质细胞的能力，以及由间充质标志物，如波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白^（SMA）4,5的表达。以往的研究表明，EMT过程已与组织纤维化的发展在肾脏⁶和肺⁷被相关联的证据。此外，慢性炎症促进纤维化疾病^8;此外，如炎性细胞因子如肿瘤坏死因子超家族成员14（TNFSF14; LIGHT），肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素1β，已显示出提高的EMT ^9-12。

胶原凝胶收缩试验，其中成纤维细胞嵌入型我一个基于胶原的细胞收缩测定胶原凝胶三维，....

Protocol

1.准备肺上皮细胞的培养和

1. 培养A549人肺上皮细胞（贴壁细胞系）中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS），100IU / ml青霉素，和100μg/ ml链霉素。
2. 卸下并丢弃从培养皿的细胞培养基，并用5洗一次 - 10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。清洗后，立即吸出PBS。
3. 加2ml胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（0.05％），在37℃下孵育，5％CO ₂的3分钟。
4. 收集脱离的细胞在含有细胞培养基，离心在RT管在150×g下4分钟离心管中。
5. 悬浮细胞在2毫升细胞培养基的沉淀并除去对细胞计数的样品。算使用台盼蓝染色血球以检查细胞存活力细胞的数目。
6. 种子A549细胞上10厘米聚苯乙烯板在0.5的密度- 1.0×10 ⁶细胞/皿含10毫升凝胶收缩测定培养基的。种子上6孔聚苯乙烯板的细胞以0.5的密度- 1.0×10 ⁵个细胞/孔用2ml为EMT确认培养基。孵育细胞在37℃和5％CO ₂的24小时。

2. EMT过程

1. 添加TGF-β1（5微克/毫升）的10微升和10微升的TNF-α（10微克/毫升），以在步骤1.6接种的板凝胶收缩试验。添加TGF-β1（5微克/毫升）的2微升和2μl的TNF-α（10微克/....

Results

EMT期间，上皮细胞失去上皮标记，如E-钙粘蛋白，并获得间充质标志物，如波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白^4,5的表达。与TGF-β1和肿瘤坏死因子αA549人肺上皮细胞的温育诱导EMT。正常A549细胞的外观是鹅卵石状的形状，三角形形状是上皮细胞（ 图3A）的特性，但是刺激的TGF-β1和TNF-α后，外观改变为长纺锤形是类似于间充质细胞（ 图3B）。

的上皮细胞和间质标记物的表达进行评价，确认细胞发生EMT。相对mRNA的表达与ΔΔCT法计算。个人数据被归一针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），它是一个内务克烯。与TGF-β1和肿瘤坏死因子α48小时处理的A549细胞已显著减少CDH1的表达和显著增加VIM和ACTA2（ 图4A）的表达。用于Q-PCR的引物序列示于表1。如在.......

Discussion

在这项研究中开发的协议包括两个步骤。进行第一步骤以诱导EMT的，而第二个步骤是在凝胶收缩试验。因为它确认细胞发生EMT是很重要的，第2步提供了一个极好的补充，形态学和基因表达的变化。以往的研究表明，A549细胞的EMT诱导仅^{24，TGF-β1;}然而，正如我们以前¹⁰日报道，TNF-α处理增强EMT和收购的间充质细胞标志物。它被认为是TGF-β介导EMT的机制是SMAD依赖性^25。 TNFα增强了TGF-β1诱导的EMT，导致增强凝胶收缩。已经报道了TNFα的用于增强TGF-β1诱导的EMT的机制不仅Smad2的接头区的磷酸化，但也MAPK信号调节^26。因此，在该研究开发的协议包括stimul由两个TGF-β1和TNF-α的通货膨胀。

该行的EMT到I型胶原凝胶的类型，和浮动在介质上的细胞的嵌入，是该测定（步骤4）的中央的方面。由于凝胶是软的，容易损坏，并且在每侧有不同的尺寸，施加凝胶时向培养基中并测量它们的尺寸格外小心是必需的。如果难以进行这种步骤中，是测量井的凝胶尺寸而不凝胶移入60mm培养皿.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	用于 A549 培养基
FBS	GIBCO	10437
转化生长因子 -&β;1，人	Wako 实验室试剂	209-16544
重组人 TNF-&α;	研发&D systems	210-TA/CF
E-Cadherin （24E10） 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	#3195	1：3,000 稀释度
波形蛋白 （D21H3） 兔单克隆	抗体信号传输技术	#5741	1：3,000 稀释度
抗α;-微管蛋白抗体	sigma aldrich	T9026	1：10,000 稀释度
单克隆抗肌动蛋白，&α;-平滑肌抗体	Sigma Aldrich	A5228	1：10,000 稀释
抗 N-钙粘蛋白抗体	BD Transduction Laboratories	#610920	1：1,000 稀释
抗小鼠 IgG、HRP 连接全抗体绵羊（二抗）	GE Healthcare	NA931-100UL	1：20,000 稀释
抗兔 IgG、HRP 连接全抗体驴（二抗）	GE Healthcare	NA934-100UL	1：20,000稀释
封闭试剂	GE Healthcare	RPN418	2% 在 TBS-T
6 孔透明平底 TC 处理的多孔细胞培养板中，带盖	corning	#353046
100 mm 细胞培养皿	TPP	#93100
DMEM，粉末	寿命技术	12100-046	4&次;DMEM
1 型胶原蛋白凝胶	Nitta 明胶	细胞基质 I-A
24 孔细胞培养板	AGC TECHNO GLASS	1820-024
凝胶记录系统	ATTO	AE-6911FXN	凝胶成像仪
凝胶分析软件	ATTO	Densitograph，版本 3.00	分析软件，与 AE-6911FXN
胰蛋白酶-EDTA （0.05%）、酚红	life 技术	捆绑25300054
24 孔板、未经处理的	IWAKI	1820-024
台盼蓝溶液、0.4%	life 技术	15250-061
RNA 提取试剂盒	Qiagen	74106
逆转录酶	life 技术	18080044
实时荧光定量 PCR 系统	Stratagene	Mx-3000P
SYBR 绿色 PCR 试剂盒	Qiagen	204145
蛋白酶抑制剂混合物 （100x）	life 技术	78429
PVDF 膜	ATTO	2392390
蛋白检测试剂盒	bio-rad	5000006JA
聚丙烯酰胺凝胶	ATTO	2331810
Western 印迹检测试剂	GE Healthcare	RPN2232
Cold CCD 相机	ATTO	Ez-Capture MG/ST
胰蛋白酶抑制剂	sigma aldrich	T9003-100MG
聚氧乙烯 （20）山梨糖醇单月桂酸	Wako 实验室化学品	163-11512
聚氧乙烯 （9） 辛基苯醚	和光实验室化学品	141-08321