一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

摘要

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。

摘要

纤维化常参与多种慢性进行性疾病（如间质性肺病）的发病过程。其病理特征是成纤维细胞灶的形成，且与疾病的严重程度相关。构成成纤维细胞灶的间充质细胞可能来源于多种细胞前体，包括肺内原本存在的固有成纤维细胞以及来自骨髓的循环纤维细胞。近年来研究还提出，经历上皮-间充质转化（EMT）的间充质细胞也可能参与纤维化的发病机制。此外，转化生长因子β可诱导EMT，而肿瘤坏死因子α等促炎性细胞因子可增强EMT过程。凝胶收缩实验是一种理想的体外模型，可用于评估成纤维细胞特有的功能之一——收缩能力，该功能参与伤口修复及纤维化过程。本文展示了利用凝胶收缩实验来评估经历EMT的间充质细胞收缩能力的方法。

引言

纤维化参与多种慢性进行性疾病的发病机制，如间质性肺病、心脏纤维化、肝硬化、终末期肾衰竭、系统性硬化症以及自身免疫性疾病¹。在间质性肺病中，特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性疾病，预后较差。IPF的病理特征是出现成纤维细胞灶，其由活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞构成，并与疾病预后相关。此类肺成纤维细胞的来源被认为可能来自多种间充质细胞，包括原本存在于肺组织中的固有成纤维细胞以及来自骨髓的循环纤维细胞。近年来，上皮-间充质转化（EMT）被认为与间充质细胞的形成有关，并可能参与纤维化疾病的发生发展过程²。

人们认为，上皮-间充质转化（EMT）在胎儿发育、伤口愈合以及癌症进展（包括肿瘤侵袭和转移）过程中发挥着重要作用³。经历EMT过程后，上皮细胞通过丢失上皮标志物（如E-钙黏蛋白）并表达间充质标志物（如波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）），获得间充质细胞的特性^4,5。先前的研究表明，EMT过程与肾脏⁶和肺部⁷组织纤维化的发生有关。此外，慢性炎症可促进纤维化疾病的发生⁸；并且，诸如肿瘤坏死因子超家族成员14（TNFSF14；LIGHT）、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素-1β等炎症性细胞因子已被证实能够增强EMT^9-12。

胶原凝胶收缩实验，一....

方案

1. 肺上皮细胞的准备与培养

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 IU/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养A549人肺上皮细胞（贴壁细胞系）。
2. 从培养皿中移除并弃去细胞培养液，用5–10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。洗涤后立即吸除PBS。
3. 加入2 ml 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（0.05%），在37 °C、5% CO₂条件下孵育3分钟。
4. 将脱落的细胞收集至含有细胞培养基的离心管中，在室温下以150 × g离心4分钟。
5. 用2 ml细胞培养基重悬细胞沉淀，并取样进行细胞计数。使用台盼蓝染色和血细胞计数板测定细胞数量并检测细胞活力。
6. 在10 cm聚苯乙烯培养皿中，以每皿0.5–1.0 × 10⁶个细胞的密度接种A549细胞，每皿加入10 ml培养基用于凝胶收缩实验；在6孔聚苯乙烯培养板中，以每孔0.5–1.0 × 10⁵个细胞的密度接种A549细胞，每孔加入2 ml培养基用于EMT验证。在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。

2. EMT 实验步骤

1. 向第1.6步接种用于凝胶收缩实验的培养板中加入10 µl TGF-β1（5 µg/ml）和10 µ....

结果

在 EMT 过程中，上皮细胞失去上皮标志物（如 E-钙黏蛋白），并获得表达间充质标志物，例如波形蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白^4,5。用 TGF-β1 和 TNF-α 孵育 A549 人肺上皮细胞可诱导 EMT。正常的 A549 细胞呈鹅卵石样或三角形，这是上皮细胞的典型特征（图 3A）；但在经 TGF-β1 和 TNF-α 刺激后，细胞形态转变为细长的梭形，类似于间充质细胞（图 3B）。

通过检测上皮和间充质标志物的表达，以确认细胞是否发生上皮-间充质转化（EMT）。相对mRNA表达量采用ΔΔCt法计算，各数据均以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化。经TGF-β1和TNF-α处理48小时后，A549细胞中CDH1的表达显著降低，而VIM和ACTA2的表达显著升高（图4A

讨论

本研究建立的实验方案包括两个步骤。第一步用于诱导上皮-间质转化（EMT），第二步为凝胶收缩实验。由于确认细胞是否发生EMT至关重要，因此第二步可很好地补充形态学和基因表达的变化。既往研究表明，A549细胞的EMT仅由TGF-β1诱导²⁴；然而，正如我们先前所报道的¹⁰，TNF-α处理可增强EMT并促进间充质细胞标志物的获得。目前认为，TGF-β介导的EMT机制依赖于Smad通路²⁵。TNF-α可增强TGF-β1诱导的EMT，从而促进凝胶收缩。已有研究报道，TNF-α增强TGF-β1诱导EMT的机制不仅涉及Smad2连接区的磷酸化，还包括对MAPK信号通路的调控²⁶。因此，本研究建立的实验方案包含了TGF-β1和TNF-α的联合刺激。

将经历上皮-间质转化（EMT）的细胞包埋于I型胶原凝胶中，并使其在培养基中悬浮，是本实验的关键步骤（步骤4）。由于凝胶质地柔软且易受损，且各面尺寸不一，因此在将凝胶转移至培养基中以及测量其尺寸时需格外小心。若此步骤操作困难，可采用另一种替代方法，即在不将凝胶转移至6.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	sigma aldrich	11965-092	用于 A549 培养基
FBS	GIBCO	10437
转化生长因子-β1，人源，重组	Wako 实验室化学品	209-16544
重组人 TNF-α	R&D systems	210-TA/CF
E-钙黏蛋白 (24E10) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 稀释
波形蛋白 (D21H3) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 稀释
抗-α-微管蛋白抗体	sigma aldrich	T9026	1:10,000 稀释
单克隆抗肌动蛋白，α-平滑肌抗体	sigma aldrich	A5228	1:10,000 稀释
抗 N-钙黏蛋白抗体	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 稀释
抗小鼠 IgG，HRP 标记全抗体（山羊）（二抗）	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 稀释
抗兔 IgG，HRP 标记全抗体（驴）（二抗）	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 稀释
封闭试剂	GE Healthcare	RPN418	在 TBS-T 中配制成 2%
6 孔透明平底 TC 处理多孔细胞培养板，带盖	corning	#353046
100 mm 细胞培养皿	TPP	#93100
DMEM，粉末	life technologies	12100-046	用于配制 4× DMEM
Ⅰ型胶原凝胶	Nitta gelatin	Cellmatrix type I-A
24 孔细胞培养板	AGC TECHNO GLASS	1820-024
凝胶成像系统	ATTO	AE-6911FXN	凝胶成像仪
凝胶分析软件	ATTO	Densitograph，ver. 3.00	与 AE-6911FXN 配套的分析软件
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	life technologies	25300054
24 孔板，未处理	IWAKI	1820-024
台盼蓝溶液，0.4%	life technologies	15250-061
RNA 提取试剂盒	Qiagen	74106
逆转录酶	life technologies	18080044
实时 PCR 系统	Stratagene	Mx-3000P
SYBR green PCR 试剂盒	Qiagen	204145
蛋白酶抑制剂混合物（100×）	life technologies	78429
PVDF 膜	ATTO	2392390
蛋白定量试剂盒	bio-rad	5000006JA
聚丙烯酰胺凝胶	ATTO	2331810
Western 印迹检测试剂	GE Healthcare	RPN2232
冷 CCD 相机	ATTO	Ez-Capture MG/ST
胰蛋白酶抑制剂	sigma aldrich	T9003-100MG
聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯	Wako 实验室化学品	163-11512
聚氧乙烯（9）辛基苯基醚	Wako 实验室化学品	141-08321