视黄酸诱导胚胎干细胞分化过程中激活的基因调控元件的预测与验证

摘要

在本研究中，我们提供了一种实验流程，用于鉴定并实验验证活性增强子。

摘要

胚胎发育是一个涉及多个步骤的复杂过程，其中包括众多基因的激活与抑制。基因组中的增强子元件已被证实可在细胞分化过程中参与组织和细胞类型特异性的基因表达调控。因此，识别并进一步研究这些增强子元件对于理解细胞命运的决定机制具有重要意义。整合基因表达数据（例如，微阵列或RNA-seq）以及基于染色质免疫沉淀（ChIP）的全基因组研究（ChIP-seq）结果，可实现对这些调控区域的大规模鉴定。然而，对细胞类型特异性增强子的功能验证仍需进一步的体外和体内实验操作。本文将介绍如何对活性增强子进行实验性鉴定与验证。本实验方案提供了一个逐步操作的工作流程，包括：1）通过ChIP-seq数据分析鉴定调控区域；2）克隆所鉴定的基因组序列，并在报告基因检测中实验验证其潜在的调控功能；3）通过检测增强子RNA转录水平，在体内确定增强子活性。本方案描述详尽，可帮助研究人员在实验室中建立该工作流程。尤为重要的是，该方案可轻松适配并应用于任何细胞模型系统。

引言

多细胞生物的发育需要在发育中的组织中精确调控成千上万个基因的表达。基因表达的调控在很大程度上由增强子实现。增强子是一类短的非编码DNA元件，能够与转录因子（TFs）结合，并通过远距离作用激活靶基因的转录¹。增强子通常以cis方式发挥作用，最常位于转录起始位点（TSS）的上游区域，但最近的研究也发现了一些增强子位于基因更远的上游、基因的3'端，甚至位于内含子和外显子内部的例子²。

在脊椎动物基因组中存在数十万个潜在的增强子¹。近年来基于染色质免疫沉淀（ChIP）的技术提供了全基因组范围的高通量数据，可用于增强子分析^3-9。尽管ChIP-seq实验获得的数据显著提高了识别细胞和组织特异性增强子的可能性，但必须注意的是，所检测到的结合位点并不一定代表直接的DNA结合和/或具有功能的增强子。因此，对新鉴定出的增强子进行进一步的功能分析至关重要。本文中，我们介绍了一种假定活性增强子识别与验证的基本三步流程，包括：1）通过ChIP-seq数据的生物信息学分析筛选假定的转录因子结合位点；2）将这些调控序列克隆至报告基因载体中并进行验证；3）检测增强子RNA（eRNA）的表达水平。

将胚胎干细胞（ES 细胞）暴露于视黄酸（RA）是常用于促进多能细胞向神经分化的手段¹⁰。RA 通过与视黄酸受体（RARα、β、γ）....

方案

1. 基于Chip-seq分析的增强子筛选

1. 从 http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ 下载 RXR ChIP-seq 原始数据 fastq 文件（mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz）
2. 下载并解压用于比对的 BWA 索引文件（本例中为：Mus_musculus_UCSC_mm10）。（ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   注：有关生物信息学分析步骤的更多信息以及下载下文所用脚本，请访问 https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts。
3. 将示例 fastq 文件比对至 mm10 基因组（使用脚本：perform_alignment.sh）。该操作将生成一个包含 .bam 文件及比对统计信息的文件夹。比对后的 RXR ChIP-seq 数据（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam）及其对应的索引文件（.bai）可在此处获取：
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   注：BWA 是一种将相对较短序列（例如，ChIP-seq 结果）比对到参考基因组数据库（如小鼠参考基因组 <....

结果

我们使用了一种广谱性RXR抗体，以确定在全基因组范围内，哪些受视黄酸（RA）调控的基因在其邻近区域存在受体富集。对经视黄酸处理的胚胎干细胞（ES细胞）获得的RXR ChIP-seq数据进行生物信息学分析，结果显示，在RXR占据的位点下方富集了核受体半位点（AGGTCA）（图1）。我们利用一种生物信息学算法，将半位点的基序搜索结果回溯映射到RXR ChIP-seq数据中（图2）。该分析帮助我们准确识别出与经典核受体结合位点重叠的ChIP峰。在IGV中对这些位点进行可视化显示，表明这些转录因子在Hoxa1（一个先前已被表征的RAR/RXR靶基因）附近区域富集（图2和图3）。我们还鉴定出一个新型RA靶基因，即PRMT8²⁷。该区域包含两个半位点之间无间隔核苷酸的直接重复序列（AGGTCAAGGTCA）（图3）。为了在功能上验证所鉴定出的Hoxa1调控元件确实能够结合RAR/RXR并受RA调.......

讨论

近年来，测序技术的进步使得在多种细胞类型和组织中大规模预测增强子成为可能^7-9。上述描述的工作流程可用于基于ChIP-seq数据筛选出的候选增强子进行初步表征。详细的步骤和注意事项将有助于研究人员在实验室中建立常规的增强子验证流程。

荧光素酶报告基因实验中最关键的步骤是转染效率。建议在每次实验中包含一个GFP构建体，以评估转染效率。使用新鲜且高质量的质粒可能至关重要，并可显著提高转染效果。本方案可适用于任何细胞模型系统。强烈建议使用适当的细胞类型来表征组织特异性增强子。因此，荧光素酶报告基因实验要求所选细胞必须能够高效转染。或者，可使用易于转染的细胞，并在其中（过）表达目标转录因子。这在某些组织特异性增强子的研究中可能尤为重要。

相比之下，增强子RNA可在任何细胞中使用，不受此类限制，从而可在不同条件下体内研究增强子活性。in vivo 高效检测eRNA的关键参数如上所列。分离高质量、未降解的RNA至关重要。必须进行DNase处理，以避免检测到基因组DNA污染而非eRNA。由于RNA将用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KOD DNA聚合酶	Merck Millipore	71085-3	用于从基因组DNA中扩增增强子的PCR反应
DNeasy Blood & Tissue试剂盒	Qiagen	69504	用于基因组DNA提取
QIAquick PCR纯化试剂盒	Qiagen	28106	用于PCR产物纯化
凝胶回收试剂盒	Qiagen	28706	当PCR产物较多时用于凝胶回收
HindIII	NEB	R3104L	限制性内切酶
BamHI	NEB	R3136L	限制性内切酶
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	去除DNA的5'-和3'-磷酸基团
T4 DNA连接酶	NEB	M0202	用于连接反应
QIAprep Spin Miniprep试剂盒	Qiagen	27106	用于质粒提取
DMEM	Gibco	31966-021	胚胎干细胞培养基
FBS	Hyclone	SH30070.03	胚胎干细胞培养基
MEM非必需氨基酸	Sigma	M7145	胚胎干细胞培养基
青霉素-链霉素	Sigma	P4333	胚胎干细胞培养基
β-巯基乙醇	Sigma	M6250	胚胎干细胞培养基
FuGENE HD	Promega	E2311	转染试剂
Opti-MEM® I减血清培养基	Life Technologies	31985-062	用于转染
全反式维甲酸	Sigma	R2625	配体，用于激活RAR/RXR
96孔透明板	Greiner	655101	用于β-半乳糖苷酶检测
96孔白色板	Greiner	655075	用于荧光素酶检测
D-荧光素钾盐	Goldbio.com	115144-35-9	用于荧光素酶检测
ATP盐	Sigma	A7699-1G	用于荧光素酶检测
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	用于荧光素酶检测
HEPES	Sigma	H3375-25G	用于荧光素酶检测
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	用于β-半乳糖苷酶检测
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	用于β-半乳糖苷酶检测
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	用于β-半乳糖苷酶检测
KCl	Sigma	P9541-500G	用于β-半乳糖苷酶检测
ONPG (邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷)	Sigma	N1127-1G	用于β-半乳糖苷酶检测
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	用于RNA提取
High-Capacity cDNA反转录试剂盒	Life Technologies	4368814	用于eRNA的反转录
无RNase的DNase	Promega	M6101	DNase处理
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	实时定量PCR预混液
CFX384 Touch™ 实时荧光定量PCR系统	BioRad		qPCR仪
BioTek Synergy 4多功能微孔板检测仪	BioTek		发光检测仪