预测与基因调控元件的验证激活过程中维甲酸诱导胚胎干细胞分化

Summary

在这项工作中，我们提供了一个实验工作流程，说明如何识别和实验验证活性增强子。

Abstract

胚胎发育是涉及到许多基因的激活和镇压一个多步骤的过程。在基因组中的增强子元件是公知的细胞分化过程中以促进基因表达的组织和细胞类型特异性调节。因此，他们的鉴定和进一步调查，以了解细胞的命运是如何决定的重要。基因表达数据（ 例如，微阵列或RNA-SEQ）和染色质免疫沉淀（ChIP）为基础的全基因组研究（芯片起）结果的整合使得这些调控区域大规模鉴定。然而，细胞类型特异性增强剂的功能验证进一步要求在体外和体内实验程序。在这里，我们描述了活性增强剂如何可以识别和实验验证。通过芯片起数据分析，2）克隆和EXPER 1）鉴定调节区:此协议提供了一步一步的工作流程，其包括在报道实验所识别的基因组序列的推定的调节潜力imental验证，和3）测定增强子活性的体内通过测量增强RNA转录水平。所提出的协议是不够详细，帮助任何人设立这个工作流程中的实验室。重要的是，该协议可以很容易地适应，并在任何细胞模型系统中使用。

Introduction

多细胞生物体的发育需要精确调节发育组织中数千个基因的表达。基因表达的调节在很大程度上是通过增强子完成的。增强子是短的非编码 DNA 元件，可与转录因子 （TF） 结合，并远距离作用以激活靶基因的转录¹。增强子通常是顺式作用的，最常见于转录起始位点 （TSS） 的上游，但最近的研究还描述了在更远的上游、基因的 3' 甚至内含子和外显子内发现增强子的例子²。

脊椎动物基因组中有数十万个潜在的增强子¹.基于染色质免疫沉淀 （ChIP） 的最新方法提供了可用于增强子分析的全基因组高通量数据^3-9。尽管通过 ChIP-seq 实验获得的数据大大增加了识别细胞和组织特异性增强子的可能性，但重要的是要记住，检测到的结合位点不一定能识别直接的 DNA 结合和/或功能增强子。因此，对新发现的增强子进行进一步的功能分析是必不可少的。在这项工作中，我们提出了一个基本的三步法，用于推定的活性增强子鉴定和验证。这包括：1） 通过对 ChIP-seq 数据进行生物信息学分析来选择假定的转录因子结合位点，2） 在报告基因构建体中克隆和验证这些调节序列，以及 3） 增强子 RNA （eRNA） 的测量。

胚胎干细胞 （ES） 暴露于视黄酸 （RA） 经常用于促进多能细胞的神经分化 ¹⁰。RA 通过与 RA 受体 （RARα， β， γ） 和类 A A X 受体 （RXRα， β， γ） 结合来发挥作用。RAR 和 RXR 以异二聚体的形式与称为 RA 反应元件的 DNA 基序结合，该基序通常排列为 AGGTCA 序列的直接重复序列（称为半位点）并调节转录。配体处理实验允许在 ES 细胞中鉴定出几个视黄酸调节基因 ^11,12。然而，其中许多基因的增强子元件尚未被描述。为了演示如何将此处描述的工作流程用于增强子的鉴定和验证，我们逐步展示了胚胎干细胞中两种视黄酸依赖性增强子的选择和表征。

Protocol

1.基于芯片序列分析选择增强

1. 从http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/下载RXR芯片起原始数据FASTQ文件（mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz）
2. 下载并提取对准所需的BWA索引文件（在我们的例子: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   注:关于生物信息学分析的步骤参观https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts获取更多信息，并下载下面使用的脚本。
3. 对准例子FASTQ文件MM10基因组（使用脚本:perform_alignment.sh）。这将创建一个.bam文件和比对统计数据的文件夹中。不结盟RXR芯片起的数据（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam），以及相应的索引文件（.bai）都可以在这里:
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   注:BWA是一个软件包，对齐RELAtively短序列（ 例如，芯片起的结果），以一序列数据库，如鼠标参照基因组（ 例如^{，MM10）13。}
4. 润峰主叫和从头主题分析脚本（callpeaks.sh）。使用.bam文件作为输入。该脚本是基于荷马findPeaks ^14。
   注意:输出文件给我们关于峰的总数，富集的图案，背景的百分比，并与基序的靶序列等相关信息。 （ 图1）。通常几个主题中列出了它们的重要性顺序。
5. 重新映射排名第一的基序（NR半`AGGTCA`）（使用脚本:remap_motif.sh）
   注意:作为结果，脚本生成.bed文件，该文件的ChIP-峰覆盖包含感兴趣的转录因子的规范结合位点的基因组区域，将显示。
6. 下载并可视化对准RXR芯片起读取结果（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam（也下载.bai））和AGGTCA基序发生（mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed）通过结合基因组浏览器^{（IGV）15，}以确定推定RAR / RXR结合位点（ 图2和图3）。
   注:各种芯片起的数据整合，将有助于更精确地预测好的候选增强^16,17。最近的研究表明，活性增强剂通常富集P300和H3K4me1和H3K27ac相关，并位于开放染色质区域，从而显示DNase的我超敏反应还建议^18-21。
7. 使用在IGV ^15" 定义的感兴趣区域 "，以获得200 -所选择的基因组区域的400bp的序列和用于随后的引物设计的序列。

2.报告基因检测

注:萤光素/萤光素酶系统用于作为一个非常敏感的报告基因检测的转录调控。取决于增强子活性萤光素酶是产生将催化萤光素氧化成氧化萤光素导致bioluminescense，它可以被检测到。作为第一步骤，确定推定的增强子序列应当亚克隆到报告载体（ 例如，TK萤光素酶²²的pGL3或NanoLuc）。

1. 引物设计
   1. 设计PCR引物200扩增-通过引物3假定增强地区的400基点（可在这里^{:http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23}
   2. 复制 - 粘贴IGV基因组序列，其中包括假定的结合位点为:引物（见步骤1.7）。集产品尺寸范围250 - 在引物3 300基点。
   3. 验证使用UCSC基因组浏览器的PCR引物在硅片 PCR工具^{（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）24}
      注意:此协议在后面的步骤用HindIII和BamHI限制性内切酶进行克隆。检查是否由UCSC 的In-硅片的PCR工具预测将包含AAGCTT或GGATCC限制性位点的PCR扩增序列（ 例如，http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）。
   4. 获得从商业供应商所需的引物。
2. 从基因组DNA增强子序列的PCR扩增
   1. 从净化主要细胞（ 如初级胚胎成纤维细胞）的模板基因组DNA。使用基因组DNA的分离商业工具并按照制造商的说明。
      注:基因组DNA的高品质是成功的PCR扩增至关重要。如果PCR是不从基因组DNA容易适当BAC克隆都可以使用。
   2. 制备含有100ng的基因组DNA，5μl的10×缓冲液，3微升用MgSO _4（25毫摩尔），5微升的dNTP（2mM的各），1.5微升正向引物（10μM），1.5微升启引物50微升的PCR反应（10μM） ，1微升DNA聚合酶
      注意:使用高保真DNA聚合酶用PCR反应低错误率。
   3. 设置PCR循环（2分钟95℃（20秒95℃，10秒58 - 65℃，18秒70℃）X25重复，2分钟70°C，永远4℃）。设置退火温度为审议底漆的预计值的Tm值。
   4. 净化与商业PCR纯化试剂盒PCR产物，并按照制造商的说明。
   5. 通过用引物重复PCR如上使用，但对它们的5添加突出端引入用于克隆的限制性位点'末端（ 例如，正向:5'-ATAT AAGCTT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'（HindⅢ位），版本:5'-TATA GGATCC XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3'（BamHⅠ位））。
   6. 运行5微升在琼脂糖凝胶上对PCR产物的检查非特异性PCR产物。
      注:如果检测到更多的频段，从而使整个PCR产物和由商业凝胶提取试剂盒净化合适的频段。
   7. 限制
      注意:要插入克隆TK启动²²纯化的PCR产物和载体（ 例如，TK-吕克）的上游侧应用HindIII和BamHI消化。
      1. 制备含1微克纯化的PCR产物，1微升的HindIII（20U /微升），1微升的BamHI（20U /微升）和5微升10X缓冲液50微升反应混合物。
      2. 制备250μl的反应混合物含有5μg的向量（TK吕克，或替代报告载体），5微升的HindIII（20U /微升），5微升的BamHI（20U /微升），5微升的热敏碱性磷酸酶（1U /微升）和25微升10X缓冲。
         注:AP治疗载体的大大降低单消化的载体的自身连接，从而所述背景。
      3. 孵育4小时，反应混合物在37℃，然后纯化消化的PCR产物和用市售的PCR纯化试剂盒的载体。
   8. Ligatioñ
      1. 设置用于连接在PCR管包括2微升10×T4 DNA连接酶缓冲液，10毫微克TK-吕克矢量，50纳克刀片（消化的PCR产物），1微升T4 DNA连接酶（400单位/微升）和无核酸酶水，反应多达20微升。
         注:准备一个阴性对照，其中在反应中不包含插入片段。
      2. 轻轻吹打起来并混合反应下来，后短暂离心使用mini-离心机的PCR管，然后在室温孵育10分钟。
      3. 热灭活在65℃下10分钟，然后冰浴，并使用5微升用于转化的产物进50微升感受态细胞（ 例如，DH5α）。
      4. 使用标准的热休克过程转化细菌，拿起殖民地和隔离质粒DNA与商业套件。通过之前的下一步测序验证所有的结构。
   9. ES细胞的转染
      1. 使用48孔板。加入200微升0.1％明胶SOLUT离子/孔30分钟前，细胞电镀。
      2. 板胚胎干细胞（ES细胞）转染的前一天。使用无饲养ES细胞和板以每孔3×10 ^4个细胞在250μl的ES介质/孔的密度。
      3. 制备质粒混合物（每个组合计算了8个孔，4未处理和4视黄酸处理的） 混合1:1250纳克TK-吕克空（阴性对照），950纳克β半乳糖苷酶编码向量（的βGal）， 混合2 :1.250纳克TK-吕克的Hoxa1增强（阳性对照），950毫微克的βGal， 混合3:1.250纳克TK-吕克PRMT8增强剂（感兴趣区域），950毫微克的βGal。
         注:ES细胞表达所需的转录因子（RAR / RXR）。离开井未转染的过程中的荧光素酶和β半乳糖苷酶的测量后，确定基值。
      4. 转染的品质降低血清培养基添加到每个质粒混合高达106微升总体积（足够用于8孔）。
      5. 加入4.5微升ES质量染离子试剂通过移液15倍上下仔细混合。在室温下孵育10分钟的转染混合物。
      6. 加入13微升转染混合物，以每口井的细胞，吹打调匀。将细胞放回孵化器（37°C）O /配体治疗N前。
      7. 从细胞中吸小心取出媒体，并添加250微升新鲜培养基/孔含有0.01 - 1μM全反式维甲酸（RA）作为最终的浓度或DMSO作为溶媒。孵育细胞24 - 48小时。
         注:维甲酸对光敏感。
   10. 细胞裂解液的制备
       1. 稀释5倍裂解缓冲液（1.25毫升中含0.5摩尔Tris pH值= 7.8，加入1ml的1M二硫苏糖醇（DTT）（以H ₂ O），将10毫升的0.1M的EDTA的pH = 8.0，将50ml甘油，加入5ml的Triton X-100，无菌加水至100毫升）至1x使用无菌水，加入20微升的1M DTT / 10毫升并在使用前平衡至室温。制备出10毫升在测定当天的48孔板中。
       2. 从细胞中吸小心取出介质。用1X PBS冲洗细胞一次。 200μl的1×裂解缓冲液/孔直接添加到细胞中。
       3. 在RT（化学裂解）摇动2小时。冻结在平板上的细胞裂解物在-80℃（机械裂解）。裂解物可以储存在-80℃几天。
       4. 解冻的裂解。完成解冻后，使用电子多道移液器转移细胞裂解物至96孔板中。转移80微升细胞溶胞产物的96孔透明板β半乳糖苷酶测定法和40微升细胞裂解物，以白色板为萤光素酶测定。避免形成任何气泡。
   11. β半乳糖苷酶测定法
       注:β-半乳糖苷酶或替代性的第二记者应该被用作内部对照，以占非特异性的实验变异。
       1. 准备β半乳糖苷酶底物缓冲液80.0克Na ₂ HPO _{4•7H 2} O，3.8克_和 NaH ₂ PO _{4•H 2} 0，30.0克氯化钾，将1.0g硫酸镁_{4•7H 2} O，使多达1000毫升无菌水。调节pH至7.4。过滤消毒（0.2微米），并存储在4℃
       2. 混合1毫升β半乳糖苷酶底物缓冲液与4毫克ONPG（邻 - 硝基苯基β-D-半乳糖苷酶）。使用前添加3.5微升每1毫升缓冲液2-巯基乙醇（βME）的。 100μl的β半乳糖苷酶底物缓冲液添加到80μl的细胞裂解物。
       3. 在37℃孵育反应，直到昏黄色开发。阅读在OD 420处的吸光度的酶标仪和出口数据。
          注:时间取决于转染效率，通常是超过30分钟不再。
   12. 萤光素酶检测
       1. 准备50毫升萤光素底物试剂:15.1毫克D-荧光素盐，82.7毫克ATP盐，185毫克硫酸镁_{4•7H 2} O，加至50ml聚丙烯管，然后加入1.5毫升1M的HEPES缓冲液，48​​.5毫升ATP免费的水，旋涡，确保所有的化合物完全溶解。保持5 - - 10毫升分装，在-80℃。
       2. 温馨5毫升萤光素底物试剂，以RT在开始之前。吸移管将100μl底物试剂到含有40微升细胞溶胞产物的白色板的每个孔中，并立即用发光计数器机器测量信号。
       3. 从一式三份转染至少三个独立的实验获得的活动。
       4. 首先计算每个井的基部标准化荧光素酶活性和碱规范化β半乳糖苷酶值减去用于从测得的各值的非转染的细胞测得的平均值。然后计算萤光素酶/β半乳糖苷酶的活性的比值。

   3.增强RNA的表征

   注:增强活动的一个更直接的指标已经从最近的基因组-W涌现该确定的许多短的非编码RNA，从50至2000个核苷酸，这是从增强剂转录大小不等，和被称为增强剂的RNA（eRNAs）IDE研究^16,25,26（ 图4）。尔娜感应与相邻的外显子编码基因的诱导高度相关。因此，与信号相关 ​​的增强子活性可以在体内通过比较用RT-qPCR的各种条件之间尔娜生产定量。

   1. 指引引物设计用于检测尔娜用RT-qPCR的
      1. 选择尔娜测量基因组区域是至少1.5 - 2 kb的距离注释转录起始位点。
         注:重要的是，高含量的整个基因内增强剂的mRNA转录防止尔娜的准确定量的有义方向，在基因内增强剂反义eRNAs是可检测的，并且在基因外增强剂水平eRNAs相似。
      2. 作为一般规则，使用地区200 - 1,000 bp的往复m为转录因子结合的任一对有义或反义链（ 图4和图6），用于引物设计的兴趣点的中心。
         注意:如果GRO-以次，DNase的以次，H3K4me1，H3K4me3的或H3K27ac芯片起数据可从所需细胞类型和条件下，它可以用于更准确的引物设计。 eRNAs从特征在于高水平的H3K4me1和ME3的推定增强子区转录。 eRNAs的表达与活化蛋白增强标记H3K27ac的富集正相关。
      3. 设计PCR引物eRNAs的基于染料的荧光RT-qPCR的测量由引物^{3（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23}生成用于引物设计为每反义序列（反向有义链的互补）: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html。插入200 - 引物设计300bp的有义或反义序列的。
   2. 尔娜转录的测量
      1. 根据制造商的建议从处理的细胞与商业酸性苯酚/基于氯仿提取试剂分离总RNA。
      2. 使用DNA酶I，以逆转录反应使用它们之前，对待分离的RNA。根据逆转录现有的制造商的建议，灭活脱氧核糖核酸酶。
      3. 测量RNA浓度的DNase I处理后，用每RT反应1000纳克。使用高品质的逆转录酶。
         注:由于大量eRNAs可能无法聚腺苷酸化，反转录需要使用随机引物。
      4. 检测用标准程序逆转录尔娜用RT-qPCR的。测量用于归一非治疗依赖性的mRNA（如 36B4，PPIA，GAPDH，Actb的）。

Results

我们使用了泛特异性RXR抗体以鉴定的全基因组其类风湿性关节炎调节基因在它们的靠近受体富集。从用视黄酸处理的ES细胞获得RXR芯片起数据的生物信息学分析揭示了核受体半位点（AGGTCA）下的RXR占用位点（ 图1）的富集。使用生物信息学算法我们映射回的基序，检索结果为半位点的RXR芯片起数据（ 图2）。这种分析有助于我们准确地识别，用规范的核受体结合位点重叠的沉淀峰。这些网站在IGV的可视化表示中的Hoxa1，一个以前的特点RAR / RXR目标（ 图2和图3）的接近这些转录因子的富集。我们还确定了新的RA的靶基因，即PRMT8 ^27。此Latter区包含与两个半位点（AGGTCAAGGTCA）（ 图3）之间没有间隔物核苷酸的直接重复。在功能验证确定了的Hoxa1的确可以绑定RAR / RXR和规范由RA元素构建含有〜300bp的基因组区域，包括确定的元素TK-荧光素酶报告载体。我们还...

Discussion

近年来，测序技术的进步使得对许多细胞类型和组织中的增强子进行大规模预测成为可能 ^7-9。上述工作流程允许对基于ChIP-seq数据选择的候选增强子进行主要表征。详细的步骤和注释将帮助任何人在实验室中设置常规增强子验证。

荧光素酶报告基因测定中最关键的步骤是转染效率。建议包括一个GFP构建体，以便估计每个实验中的转染效率。拥有新鲜且高质量的质粒至关重要，可以显着改善转染。所提出的协议可以适用于任何蜂窝模型系统。强烈建议使用适当的细胞类型来表征组织特异性增强子。因此，荧光素酶报告基因测定要求为实验选择的细胞应具有有效的转染性。或者，应在目标转录因子（过度）表达的地方使用易于转染的细胞。这对于某些组织特异性增强剂尤其重要。

相比之下，增强子RNA可以很容易地用于任何细胞中，而没有这样的限制来研究 体内不同条件下的增强子活性。上面列出了高效 eRNA 检测的关键参数。分离高质量、未降解的 RNA 至关重要。DNase 处理对于避免检测基因组 DNA 而不是 eRNA 的检测非常重要。由于RNA...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA 聚合酶	Merck Millipore	71085-3	用于 gDNA
DNeasy Blood 和增强子的 PCR 扩增纸巾套装	Qiagen	69504	用于基因组 DNA 分离
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106	用于 PCR 产物纯化
凝胶提取试剂盒	Qiagen	28706	用于凝胶提取（如果有更多 PCR 产物
HindIII	NEB	R3104L	限制性内切酶
BamHI	NEB	R3136L	限制性内切酶
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	中释放 5'-和 3'-磷酸基
			，用于连接
QIAprep离心小量制备试剂盒	Qiagen	27106	用于质粒分离
DMEM	Gibco	31966-021	ES 培养基
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES 培养基
MEM 非必需氨基酸	Sigma	M7145	ES 培养基
青霉素-链霉素	Sigma	P4333	ES 培养基
β 巯基乙醇	Sigma	M6250	ES 培养基
FuGENE HD	Promega	E2311	转染试剂
Opti-MEM®I 减血清 Medium	Life Technologies	31985-062	用于转染
全反式视黄酸	Sigma	R2625	配体，用于 RAR/RXR
96 孔透明板	Greiner	655101	，用于 β 半乳糖苷酶测定
96 孔白板	Greiner	655075	，用于荧光素酶测定
D-荧光素、钾盐	Goldbio.com	115144-35-9	用于荧光素酶测定
ATP 盐	Sigma	A7699-1G	用于荧光素酶测定
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	用于荧光素酶测定
HEPES	Sigma	H3375-25G	用于荧光素酶测定
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	用于 β 半乳糖苷酶测定
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	用于 β 半乳糖苷酶测定
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	用于 β 半乳糖苷酶测定
KCl	Sigma	P9541-500G	用于 β 半乳糖苷酶测定
ONPG（邻硝基苯基-&β;-D-半乳糖苷酶）	Sigma	N1127-1G	用于 β 半乳糖苷酶测定
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	RNA 分离
高容量 cDNA 逆转录试剂盒	Life Technologies	4368814	eRNA 逆转录
无 Rnase 的 Dnase	Promega	M6101	Dnase 处理
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR 预混液
CFX384 Touch™实时荧光定量 PCR 检测系统	BioRad		qPCR 机
BioTek Synergy 4 微孔板检测仪	BioTek		发光计数器