同时评估心肌细胞DNA合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

摘要

心肌细胞更新率的定量具有挑战性。本文所述方案通过实现对新生心肌细胞核生成及细胞核倍性的准确且灵敏的定量，为解决这一难题做出了重要贡献。

摘要

尽管目前公认心脏在损伤后具有有限的心肌细胞再生能力，并且在正常衰老过程中存在低水平的心肌细胞更新，但对这些事件的定量仍然具有挑战性。部分原因在于该过程极为罕见，且多种细胞来源共同参与心肌的维持。此外，心肌细胞内的DNA复制常常导致细胞变为多倍体，而极少通过细胞分裂产生新的心肌细胞。因此，为了准确量化心肌细胞的更新，必须能够区分这些不同的过程。本文所述的方案采用长期核苷标记法，以标记所有因DNA复制而产生的细胞核，并结合细胞核分离及随后的PCM1免疫标记来鉴定心肌细胞核。该组合方法可实现对心肌细胞核群中核苷标记的准确且灵敏的识别。此外，通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚标记及细胞核倍性分析，可将新生成的心肌细胞核与在多倍化过程中掺入核苷的细胞核区分开来。尽管该方法无法控制心肌细胞双核化的影响，但其能够在考虑多倍化的基础上，快速且可靠地量化新生心肌细胞核。该方法具有多种下游应用，包括评估促进心肌细胞再生的潜在治疗手段，或研究心脏疾病对心肌细胞更新及倍性的影响。该技术还可与其它下游免疫组织化学技术兼容，从而实现对所有心脏细胞类型中核苷掺入的定量分析。

引言

近年来，越来越多的证据表明心脏并非终末分化的有丝后器官，这一传统观点正受到挑战^1,2。然而，心肌细胞更新与再生的定量分析仍然具有挑战性。

使用标准免疫组织化学技术准确鉴定罕见的心肌细胞生成现象存在诸多困难，已有大量文献报道³。此外，心肌细胞生成的细胞来源仍不明确，现有证据表明心肌细胞增殖和干细胞分化均可能参与其中^4-6。因此，依赖于已知心肌细胞前体细胞表型的谱系示踪模型无法应用，而对单一细胞群体（包括心肌细胞）的增殖进行量化也是不恰当的。此外，心肌细胞可能发生核内复制而不伴随核分裂（导致形成多倍体心肌细胞），或在缺乏胞质分裂的情况下发生核分裂（导致形成双核心肌细胞）^7,8。准确量化心肌细胞更新依赖于区分这些事件与真正的新心肌细胞生成。这带来了独特的挑战，因为心肌细胞中DNA复制以及周期蛋白依赖性激酶的表达并不 exclusively 表明真正意义上的细胞分裂^9,10。

为了辅助新生心肌细胞生成的定量分析，我们将一种已建立的细胞核分离技术与针对中心粒周围物质1（PCM1）的免疫标记方法相结合，用于心肌细胞核的鉴定，该方法由Bergmann 等^7,11先前描述，并进一步整合了长期DNA标记和倍性分析的新技术。PCM-1是一种中心体蛋白，可在已分化的非增殖性心肌细胞的核膜表面富集。以往研究表明，抗PCM-1抗体可特异性地标记心肌细胞核^7,11，因此PCM1已被多个独立研究团队用于心肌细胞的识别^1,12,13。此外，我们已证实，在TnT-cre转基因小鼠模型中，PCM1的表达与基因标记的心肌细胞核完全对应¹⁴（补充图1）。

本文所述方案能够准确且灵敏地鉴定小鼠心脏中新生成的心肌细胞核，而无需考虑其细胞来源（图1A 和 B），同时可在分析中排除因多倍体化导致的核苷标记干扰（图1C 和 D）。尽管该方法无法控制心肌细胞双核化的影响，但它可实现对新生心肌细胞核的快速且可靠的定量，这对于准确量化心肌细胞更新至关重要。此外，该方法还提供了一种快速筛选工具，用于评估心肌细胞生成动力学的潜在变化。

尽管DNA标记通常使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）作为胸苷类似物，但本文所述方案采用基于5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）的检测方法，因其所需处理步骤更少，通量更高，且无需对DNA进行变性即可进行免疫检测，因此可与其它免疫染色方案兼容，从而拓展了该方法的潜在下游应用范围。

图 1：持续EdU标记可标记新生心肌细胞，无论其来源如何。（A）EdU在细胞分裂过程中被整合到心肌细胞的DNA中。心肌细胞群体的增殖将导致心肌细胞数量的增加或替换，因此属于有效的DNA合成（有助于组织维持和修复）。（B）EdU在心脏前体细胞分裂过程中被整合到其DNA中，并在这些细胞向心肌细胞谱系分化时保留在细胞内。这种干细胞分化也会导致心肌细胞数量的增加，从而有助于组织的维持和修复。（C）心肌细胞可能发生“非有效”DNA复制，导致心肌细胞倍性增加，这一过程与心肌细胞肥大和心肌重塑相关，但并不能替代丢失的心肌细胞。多倍体化过程与双核化不同，其结果是形成一个具有单个细胞核的心肌细胞，该细胞核含有四套或更多套同源染色体（>2N）。（D）在持续的细胞核标记后，本方案描述了细胞核的分离，并通过PCM1表达来鉴定心肌细胞核，从而实现对心肌细胞倍性和EdU掺入情况的定量分析。PCM1表达和EdU掺入通过流式细胞术进行检测。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

动物实验已获得纽卡斯尔大学伦理审查委员会的授权和批准。所有动物实验操作均遵循欧洲议会关于用于科学目的动物保护的 2010/63/EU 指令指南。

1. EdU 给药

1. 将EdU溶解于无菌生理盐水（0.9% w/v）中，终浓度为12.5 mg/ml。
   1. 将溶液加热至40 °C，并涡旋振荡使其完全溶解。在4 °C下储存足量的EdU/生理盐水溶液，以满足实验中所有小鼠连续6天每日注射的需求。
      注意：每个实验组通常需要超过6只小鼠。但对于独立研究，应进行功效计算。
2. 称量每只小鼠的体重。根据每只小鼠100 µg/g的EdU/生理盐水溶液剂量，计算所需注射体积（每克体重注射8 µl的EdU储备液）。
3. 用25 G针头的胰岛素注射器吸取相应体积的EdU/生理盐水溶液。
4. 采用英国政府内政部批准的操作技术抓握小鼠，进行腹腔内（i.p.）注射。
   1. 将小鼠置于笼盖上，轻轻向后拉尾根部，并牢固抓住小鼠颈背部皮肤。
   2. 用食指和拇指靠近小鼠头部基部固定，并将小鼠头部向后下方倾斜，以暴露腹部注射区域。
   3. 用70%酒精溶液擦拭腹部。确定小鼠腹中线及右下腹区域，并将EdU/生理盐水溶液注射至右下腹区域。
   4. 对小鼠进行EdU/生理盐水溶液注射，并记录注射时间。
5. 每天在同一时间重复步骤1.2至1.4，连续进行6天。
   注意：为设置流式细胞术分析的门控，需设立EdU阴性对照组。另取一只年龄、性别及实验条件相匹配的小鼠，注射等体积不含EdU的生理盐水作为对照（无EdU对照）。每次实验均应包含该对照组，以校正试剂批次差异及流式细胞仪设置变化。

2. 心脏的收获

1. 6 小时后 24 小时^th EdU注射后，采用颈椎脱位法（或其它英国政府内政部批准的动物安乐死方法）处死小鼠。
2. 将处死的动物置于仰卧位，用手术剪从腹部中线至横膈膜处做皮肤切口。
3. 剪开膈肌，将胸骨从体腔向外提起，沿两侧剪开以暴露心脏。
4. 轻轻抬起心脏，剪断流出道的主要血管，将心脏从胸腔中分离出来。
5. 将每颗心脏立即放入含有10 ml预冷至4 °C的PBS的单独15 ml离心管中。
6. 将心脏转移至不同的10 cm培养皿中，用解剖刀沿矢状方向将每颗心脏切成两半，并用镊子轻轻挤压以冲洗心脏。随后更换PBS，尽可能去除血液。重复此步骤两次。
7. 将每颗心脏的两部分均放入同一个1.5 ml微量离心管中。
8. 继续进行步骤3，或按照步骤2.9和2.10所述，将样本储存于-80 °C。
9. 使用25 G针头在微量离心管盖上扎一个小孔，以防止心脏组织处理过程中因气体膨胀导致管盖打开。
10. 标记每个微量离心管，并放入液氮容器中冷冻。

3. 细胞核解离与心肌细胞核标记

注意：本细胞核解离及心肌细胞核标记方法改编自 Bergmann 的方案 等¹¹ 对所有注射了EdU的样本以及注射生理盐水（无EdU对照）的阴性对照样本执行此操作。参见 表1 有关执行这些步骤所需溶液的配方。

1. 每分析一个心脏组织，向超速离心管中加入 36 ml 的 1% BSA/PBS 溶液，孵育 30 分钟，弃去溶液后置于空气中干燥。
   注意：该管将在步骤 3.6 中使用。
2. 将单个冷冻的心脏组织置于冰上的 10 mm 培养皿中，用解剖刀进行切碎，使心脏在切碎过程中逐渐解冻。
3. 将切碎的心脏组织转移至含有 15 ml 细胞裂解缓冲液的 50 ml 离心管中，在室温下使用探头式匀浆器以 25,000 rpm 匀浆 15 秒。
4. 向离心管中再加入 15 ml 细胞裂解缓冲液，转移至 40 ml 玻璃匀浆器中，使用大间隙研杵进行 10 次研磨，随后依次通过 100 µm 和 40 µm 细胞筛过滤，收集滤液至 50 ml 离心管中。
5. 在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
6. 将核沉淀物重悬于 25 ml 蔗糖梯度溶液中，并将含细胞核的溶液小心铺加在已准备好的超速离心管（步骤 3.1 制备）中 10 ml 新鲜蔗糖梯度溶液的上层。
7. 使用摆动转子转头，在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 1 小时。
8. 离心结束后，弃去上清液，将核沉淀物重悬于 1.5 ml 微量离心管中的 1,300 µl 核储存缓冲液中，并标记为 PCM1。
9. 取 300 µl 上述悬液转移至新的微量离心管中，加入 700 µl 新鲜核储存缓冲液，将此管标记为 ISO 对照。
10. 向标记为 PCM1 的微量离心管中加入抗-PCM1 抗体，终浓度为 8 µg/ml；向标记为 ISO 对照的微量离心管中加入兔 IgG 同型对照抗体，浓度为 8 µg/ml。
11. 在 4 °C 条件下孵育过夜。孵育结束后，以 700 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，加入 1 ml 新鲜核储存缓冲液重悬，再次以 700 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，再加入 1 ml 新鲜核储存缓冲液。
12. 加入 1 µl 羊抗兔 IgG (H+L) 抗体的 F(ab')2 片段（FITC 或等效绿色荧光染料），使终浓度达到 2 µg/ml。
    注意：使用 F(ab')2 片段抗体可减少对免疫细胞（包括巨噬细胞和 B 细胞）的非特异性标记。
13. 用铝箔包裹离心管以避光，在 4 °C 条件下孵育 1 小时。

4. EdU 掺入的检测

1. 将10倍浓缩的EdU反应缓冲液用去离子水按1:10稀释。
2. 将标记有PCM-1和ISO对照的细胞核悬液在700 × g下离心10分钟，弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于1 ml的1% BSA/PBS溶液中。洗涤细胞核沉淀两次。
3. 最后一次洗涤后，弃去上清液，加入100 µl EdU固定剂。
4. 用铝箔包裹离心管以避光，室温孵育15分钟。
5. 用1 ml的1% BSA/PBS溶液洗涤样品两次，每次在700 × g下离心，然后在室温下用1×皂苷类通透溶液孵育15分钟。
6. 配制1× EdU标记混合液（见材料表）。至少需进行两组反应，以包含无EdU的对照组。
7. 将500 µl的1× EdU标记混合液直接加入已含有细胞核并悬浮于100 µl 1×皂苷类通透溶液中的各样品中，避光室温孵育30分钟。
8. 在700 × g下离心，将沉淀重悬于1 ml的1% BSA/PBS中，并重复此步骤两次。
9. 在700 × g下离心，弃去上清液，加入400 µl DNA染色溶液（见材料表）。

试剂名称

1. 细胞裂解缓冲液

0.32 M 蔗糖

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM 醋酸镁

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. 蔗糖梯度溶液

2.1 M 蔗糖

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM 醋酸镁

1 mM DTT

3. 细胞核储存缓冲液 (NSB)

0.44 M 蔗糖

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM 精胺

表1：细胞核分离缓冲液成分。 本方案第3节（细胞核解离与心肌细胞核标记）中所用所有缓冲液的配方。

5. 流式细胞术分析

注意：按照先前所述方法对分离的细胞核进行流式细胞术分析^7,11,15。

1. 首先，创建一个描述前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的图，以区分细胞核与碎片（图 2A）。
2. 通过绘制4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）面积（3-405/450/50-A）与高度（33-405/450/50-H）的关系图，创建一个用于区分单个细胞核与聚集体的图（图 2B）。确保3-405/450/50-A信号采集于线性尺度，以便准确测定DNA含量。
3. 创建一个描述488/535/30-A（PCM-1）与SSC关系的图，并仅显示来自步骤5.2中设定的单细胞门控事件，以评估单细胞群体中PCM-1的表达情况。
4. 运行同型对照样本，以建立PCM-1阳性门控（图 2C）。运行少量标记PCM-1的样本，以验证PCM-1表达细胞群及其门控位置。
5. 创建一个描述SSC-A与405/450/50-A（用于检测DAPI）关系的图。在此图中，仅显示步骤5.3中设定的门控所筛选出的单细胞PCM-1表达细胞核。利用此图建立一个额外的层级门控，仅包含2N细胞核（图 2D）。
6. 创建一个描述488/535/30-A与1-633/660/20-A关系的图，以识别表达PCM-1的心肌细胞群体中EdU的标记情况。仅显示通过上述门控筛选出的单细胞、PCM1+且为2N的细胞核。
7. 运行未添加EdU的对照心脏样本，以设定EdU阳性门控（图 2E）。为EdU+细胞创建适当的门控。
8. 记录并量化已掺入EdU的单细胞、表达PCM-1、2N的细胞核数量。
9. 将该细胞群数量计算为总单细胞PCM1+细胞核的百分比。这将提供在为期7天的EdU脉冲期间新生心肌细胞核生成速率，以总心肌细胞核的百分比表示。
   注意：由于DAPI与DNA的结合是化学计量的，其荧光强度与DNA含量成正比。根据405/450/50-A信号的强度确定倍性，方法如前所述⁷。
10. 为评估总心肌细胞群体内的倍性，使用步骤5.5中建立的图，并基于DNA浓度的门控策略⁷。

图2：心肌细胞EdU掺入率与倍性的定量分析设门策略。（A）根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）将细胞核与碎片区分开来。（B）建立线性门控，基于DAPI染色以及405/450/50高度与面积信号识别单个细胞核群体。（C）通过荧光设门，可将心脏组织中的心肌细胞核（PCM-1阳性）与非心肌细胞核（PCM-1阴性）分离。（D）利用DAPI信号强度测定DNA浓度，从而确定PCM1+心肌细胞群体的细胞核倍性。在小鼠中>80%的心肌细胞核为二倍体（2n）。（E）通过荧光设门可区分已掺入EdU的2N心肌细胞核（PCM+/EDU+ = 0.9%）与未掺入EdU的2N心肌细胞核（PCM+EDU-）。所有步骤详见方案5.0。图示为C57/BL10背景的mdx^-/y 小鼠示例。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

该方法可在控制多倍体化增加的前提下，定量分析因心肌细胞核分裂导致的EdU掺入增加。我们先前利用基于BrdU的检测方法证明，在杜氏肌营养不良的mdx小鼠模型中，哺乳动物心脏在慢性心肌细胞丢失的情况下会通过新生心肌细胞实现再生。我们已使用本文所述方法进一步验证了已发表的研究结果，并展示了该实验方案的实用性。根据所述方案，成年（12周龄）mdx小鼠和对照bl10小鼠连续7天每日注射一次EdU，此前已有报道表明该处理方式可实现实验组之间的静态分析^5,13。对EdU脉冲标记后的心脏进行免疫组织化学分析，结果显示存在表达PCM1且掺入EdU的心肌细胞（图3A）。然而，免疫组织化学方法获得的数据可能被误读，因为其他掺入EdU的细胞类型可能被错误鉴定为心肌细胞，这一点在补充图1A和B中有所示例。此外，免疫组织化学方法无法区分多倍体化与核分裂。本方案中详述的流式细胞术分析能够快速定量mdx小鼠和对照小鼠中心肌细胞核的分裂情况，同时排除因多倍体化而掺入EdU的细胞。与先前发表的数据相似¹³，分析结果显示，与同龄对照组相比，mdx小鼠心脏中新心肌细胞核的生成率显著升高（1.2% vs 0.17%；图3B和C）。

图3：野生型和mdx心脏中EdU标记的心肌细胞定量分析。（A）来自40 µm厚的mdx心脏切片的Z轴投影图像。表达PCM-1的心肌细胞核（绿色）已掺入EdU（红色）。黄色箭头指示EdU标记的心肌细胞。i和ii表示在Z平面中显示的单个EdU标记的心肌细胞。细胞核用DAPI染色（蓝色）。（B和C）分离细胞核的流式细胞术分析，显示来自12至13周龄野生型（C57/BL10）和mdx小鼠（mdx^-/y ，C57/BL10背景）的代表性图谱。（B）显示DAPI荧光强度以及2N与>2N细胞核区分的直方图。（C）根据本实验方案所述方法分析的2N心肌细胞核群体中EdU掺入情况的图谱。所有小鼠自12周龄起连续一周给予EdU处理。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：PCM-1 是心肌细胞核的特异性标记物。根据所述方案，从通过将 TNT-cre 小鼠¹⁴与 ROSA^nT/nG cre 敏感报告基因小鼠品系¹⁶杂交获得的双转基因小鼠中分离出细胞核。在该小鼠中，由肌钙蛋白T（TNT）启动子驱动的cre激活可导致GFP的不可逆表达，并定位于细胞核内。使用同型对照（Iso）标记的细胞核可用于识别表达GFP的心肌细胞核群体（488/530/30-A）。使用抗PCM1抗体标记细胞核（通过633-660/20-A检测二抗）显示PCM1的表达与GFP阳性心肌细胞核群体高度相关。在此示例中，由TNT启动子活性鉴定的98.8%的心肌细胞核可被PCM1抗体标记。请点击此处下载补充图1。

补充图 2：通过免疫组织化学技术定量心肌细胞更新的挑战。（A）二维图像显示两个表达 PCM-1 的心肌细胞核（绿色），似乎也标记了 EdU（红色）。黄色箭头指示看似已掺入 EdU 的心肌细胞。这是因为在二维成像观察时，PCM1 表达与 EdU 标记出现明显的共定位所致。（B）该图像的三维投影显示，EdU 标记的细胞并非心肌细胞，而是覆盖在表达 PCM1 的心肌细胞核上方的非心肌细胞。实验使用 12 周龄的 C57/BL10 小鼠。请点击此处下载补充图 2A。请点击此处下载补充图 2B。

反应组分	反应次数
	2	5
PBS	875 µl	2.19 ml
铜保护剂	20 µl	50 µl
荧光染料叠氮化物吡咯基	5 µl	12.5 µl
在步骤 4.1 中配制的稀释反应缓冲液	100 µl	250 µl
总反应体积	1 ml	2.5 ml

表2：EdU标记试剂组成。第4部分（EdU掺入检测）实验步骤中所需的EdU标记试剂配方。

讨论

为了准确量化心肌细胞的更新与再生，相关实验必须能够区分真正的心肌细胞生成与非生产性DNA复制事件。目前许多研究仍简单地忽略这些非生产性事件，仅通过细胞周期蛋白、胞质分裂及细胞周期标志物的表达来量化心肌细胞增殖。迄今为止，仍缺乏一种能够在排除非生产性事件干扰的前提下，准确量化心肌细胞更新的单一方法。特别是心肌细胞多倍体现象仍难以被充分考量，其可占心肌细胞DNA复制事件的约65%¹³。因此，为协助准确量化心肌细胞生成，我们开发了一种实验方案，可在排除导致倍性增加的DNA复制事件的基础上，稳健地量化新生心肌细胞核的生成速率。尽管该方案无法区分新生心肌细胞的生成与心肌细胞双核化现象，但其可快速且准确地计算出心肌细胞生成的上限值（已计入倍性因素）。因此，该方案可作为一种筛选工具，用于评估疾病模型中心肌细胞生成与多倍化速率的潜在变化，或用于评价治疗手段的潜在效率。一旦通过本方案识别出新生心肌细胞核生成速率的变化，后续研究可进一步确定该变化是源于心肌细胞生成数量的改变，还是心肌细胞核化数量的变化，如先前研究所述^2,13,17,18。这些后续分析包括在脉冲标记期间通过组织学方法量化心肌细胞核化动态，或分析EdU脉冲标记动物组织切片，以比较单核与多核心肌细胞群体中EdU的掺入情况。

由于心肌细胞更新率较低，本方案采用在7天内进行多次EdU注射。这也使得 "追逐" 所有潜在心肌细胞来源的心肌细胞生成情况，并允许对这一时间段内累积的心肌细胞核生成量进行定量分析。根据具体研究需求，该时间范围可进行调整，以适应预期的心肌细胞生成水平。为了准确量化EdU在心肌细胞核中的掺入情况，必须确保用于检测PCM-1反应性的二抗不会对细胞核产生非特异性标记。因此，建议开展额外的二抗滴定实验，以优化本方案中的这一环节，特别是在使用本方案未推荐的二抗时更应如此。本方案采用PCM-1表达来鉴定心肌细胞核。尽管PCM-1是已被公认的心肌细胞标志物，但仍可使用其他标志物对数据进行验证，例如特异性针对心肌肌钙蛋白T（cardiac Troponin T）的抗体，该蛋白已被证实部分定位于心肌细胞核¹同样，可使用其他定位于细胞核的蛋白来鉴定和定量非心肌细胞群体中的EdU掺入。分析时必须排除所有正处于有丝分裂阶段的心肌细胞核，因为这些细胞中DNA合成的最终命运尚不明确，可能导致细胞分裂或倍性增加。PCM1在细胞周期的M期会发生解聚，因此正在进行有丝分裂的心肌细胞不会被PCM1表达所识别。此外，细胞周期S期的所有细胞核也应从后续分析中排除。这可通过设门排除DAPI荧光强度高于2N峰的细胞核实现，包括DAPI强度介于2N与4N峰之间的细胞核。

尽管目前越来越被接受的观点是心脏在正常衰老过程中以及急性损伤后具有替换心肌细胞的能力，但这种再生能力的来源及其程度仍存在争议。此外，已有研究报道了不同的心肌细胞更新速率^1,7,20-22。这在一定程度上可能是由于准确识别和定量新生心肌细胞生成存在困难所致¹⁹。迄今为止，大多数研究仅依赖组织学分析，并通过检测包括肌节蛋白在内的胞质蛋白表达来鉴定心肌细胞，从而量化心肌细胞的更新与再生^2,4,23,24。使用这些方法检测增殖标志物的表达，或如本研究中所示，检测胸苷类似物的掺入，都可能容易将其他心脏细胞类型误判为心肌细胞。虽然三维共聚焦成像技术有助于缓解这些问题，但这些方法成本高昂且耗时。有趣的是，本文所述方案显示，新生心肌细胞核的生成速率为每周0.17%。这一结果与其他基于流式细胞术的研究一致，后者显示每周更新率可达0.13%⁵。尽管根据这些数据推算年度更新率具有吸引力，并且在以往研究中已有尝试^2,5,25,26，但这种外推并不恰当，因为心肌细胞的更新速率在整个动物生命周期中是动态变化的¹³。

该方法具有多种潜在应用，包括评估促进心肌细胞再生的潜在治疗手段，或研究心脏疾病对心肌细胞更新及心肌细胞多倍体化速率的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.32 M 蔗糖	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM 醋酸镁	sigma	M-5661
2.0 mM EDTA	Sigma	E5134
0.5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1.5 mM 精胺	Sigma	85590
同型兔 IgG- ChIP 级	abcam	abc7415
兔抗 PCM-1 抗体	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 片段山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体	Life technologies	A-11070
细胞筛网  70 μm 和 100 μm	Fisher scientific	11597522, 11517532
玻璃Dounce匀浆器（40 ml）及大间隙研杵	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 流式细胞术检测试剂盒	Life technologies	C10634	该试剂盒包含 实验所需的试剂、EdU反应缓冲液 、EdU固定剂、基于皂苷的通透化溶液以及EdU标记混合物所需的试剂。
CyStain DNA 两步法试剂盒	Sysmex Partec	05 5005	该试剂盒包含 DAPI标记（DNA染色溶液）所需的试剂
探头式匀浆器，例如，TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor 一次性探头	Qiagen	990890
超速离心机	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
超速离心管，薄壁，聚丙烯，38.5 ml，25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
牛血清白蛋白	Sigma	A2153