用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

摘要

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。

摘要

传统上，大多数细胞过程仅在二维条件下进行研究。尽管这些研究有助于了解一般的细胞信号传导机制，但却忽略了细胞从局部微环境和细胞外基质（ECM）的结构与力学特性中接收到的重要细胞信号。为了理解细胞在生理性的细胞外基质中的相互作用，有必要在三维检测体系中对其进行研究。细胞迁移、细胞分化和细胞增殖等过程均已被证实会受到三维细胞外基质力学性质局部变化的影响。I型胶原是细胞外基质中一种核心的纤维成分，其作用远不止是组织的简单结构组分。在正常条件下，来自胶原网络的力学信号可指导形态发生并维持细胞结构。在疾病状态下的微环境（如肿瘤微环境）中，胶原网络常发生显著重塑，表现为成分改变、沉积增加以及纤维排列结构异常。在乳腺癌中，纤维排列程度具有重要意义，垂直于肿瘤边界的排列纤维增加与患者预后较差相关¹。排列有序的胶原基质可通过持续性迁移促进肿瘤细胞的扩散^2,3。以下是一个将细胞嵌入三维纤维状胶原水凝胶中的简单实验方案。该方案易于适配多种实验平台，可重复地构建出有序或随机排列的胶原基质，用于在可调控的三维生理微环境中研究细胞迁移、细胞分裂及其他细胞过程。

引言

许多细胞过程已在二维条件下被广泛研究，从而形成了关于基本细胞信号传导机制的系统性认知。然而，这些研究忽略了细胞从局部细胞微环境及细胞外基质（ECM）的结构与力学特性中所接收到的重要细胞信号。为了更深入地理解细胞在生理环境中的相互作用，有必要在三维（3D）体系中对其进行研究。这些3D实验中的ECM可来源于细胞自身产生，也可由纯化的蛋白质重新构建。无论ECM来源如何，3D基质实验已被证实对于理解细胞如何在生理环境中迁移和相互作用具有不可估量的价值。例如，在3D基质中培养的细胞表现出依赖于周围ECM力学特性的独特运动模式，而这些模式在二维实验中并未观察到^4-6。此外，与在玻璃或塑料等坚硬表面培养的细胞相比，在3D环境中培养的细胞具有更少且不明显的应力纤维和黏着斑⁷。

然而，情境化三维检测的重要性并不仅限于细胞迁移。某些其他细胞信号事件也只能通过三维检测来进行研究。在组织和细胞分化过程中，细胞外环境和细胞外基质（ECM）的刚度可提供影响形态发生事件的信号。例如，乳腺上皮细胞的管状结构形成仅发生在低刚度的三维基质中，而在高刚度基质或二维基底上则无法发生^8,9。当在高刚度三维基质中培养时，这些上皮细胞会表现出异常表型，其特征是增殖增加以及由FAK和ERK信号通路改变所驱动的细胞膜突起增多¹⁰。已知许多其他信号通路和细胞过程同样受到局部细胞环境刚度的影响，这些信号级联反应凸显了在具有适当局部机械特性的三....

方案

1. 用于三维研究和细胞收缩检测的胶原蛋白溶液的中和、稀释与聚合

1. 在冰上、无菌细胞培养超净台中，用预冷的无菌100 mM HEPES（溶于2×PBS，pH 7.4）以1:1比例中和胶原蛋白，置于15 ml锥形管中。用塑料移液管充分混匀，直至溶液均匀，无可见混匀产生的旋涡。混匀过程中注意避免引入气泡。短暂置于冰上保存。
2. 用细胞培养基（如RPMI、DMEM）将中和后的胶原蛋白稀释至适当浓度 等等。).
   1. 为计算制备目标胶原蛋白浓度所需的中和胶原量，使用以下公式 N = (D×V)/(S/2)，其中 N 中和胶原所需的量， D 即所需的胶原蛋白浓度， V 是目标胶原蛋白浓度的终体积，S 是起始储备胶原蛋白浓度。
   2. 通过加入细胞和细胞培养基溶液，将中和后的胶原液体积补足。充分混匀后置于冰上保存，待准备浇铸时使用。
      1. 示例：制备1 ml体积、浓度为2 mg/ml的凝胶（在6孔板或50 mm玻璃底培养皿中成胶的典型体积），首先将目标浓度（2 mg/ml）乘以目标终体积（1 ml），得到2 mg。将该数值除以试剂瓶上标注的储存液浓度的一半（9.49 mg/ml）。在此情况下，取0.42 ml中和后的胶原蛋白溶液，与0.58 ml培养基/细胞混合液混合稀释。
      ....

结果

尽管三维实验可以在相同刚度的胶原凝胶中进行，但通过改变凝胶的刚度可用于确定细胞对其微环境力学变化的响应方式。当嵌入的细胞无法局部收缩周围胶原时，该胶原水凝胶即被定义为刚性凝胶。不同类型细胞的内在收缩力各不相同，因此最好首先建立一条简单的收缩力曲线，以确定细胞感知为顺应性或刚性的胶原浓度。

首先保持细胞数量恒定，逐步增加胶原凝胶的浓度。凝胶的刚度将随浓度呈指数级增长，如先前研究所示。^10,20一个收缩力测定实验的代表性示例如下所示 图1此处，将50,000个4T1细胞包埋于2 mg/ml或3.5 mg/ml的胶原凝胶中培养5天。4T1细胞系是一种高收缩性、具有转移能力的癌细胞系，但其仅能使高密度凝胶收缩约10%（图1a，c）。这种低程度收缩对于刚性凝胶分类而言是典型的。类似的低密度凝胶（2 mg/ml， 图1b，c在相同时间范围内收.......

讨论

三维胶原凝胶为我们理解细胞如何解读和响应其局部微环境提供了重要的工具。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原基质中的基本实验方案，并可重复地制备出具有随机排列或定向排列胶原纤维的基质。这两种方案均可作为可调节的平台，在聚合过程中可选择性地加入不同类型的胶原亚型、交联剂或其他基质蛋白。此外，该平台也易于改造，可用于评估不同时间点和终点的基因表达与蛋白质生成情况。成像分析、蛋白质和RNA水平检测以及代谢谱读取均能很好地与这些三维技术相兼容。

与所有技术一样，评估凝胶和检测的质量至关重要。高质量胶原凝胶的一个标志是能够耐受人工操作。例如，将1 ml [1 mg/ml]的胶原凝胶倒入六孔板后，应能用镊子轻松夹起并进行操作。如果凝胶出现撕裂或碎裂，则表明其质量不理想，需要采取措施改善胶原蛋白的聚合过程。温度和pH值是实现良好纤维形成和凝胶化的最重要参数。排查问题时，首先应确保所有组分在准备发生凝胶化之前始终保存在冰上。同时，必须确保中和缓冲液与胶原原液充分混合。接下来，需确认中和缓冲液的pH值为7.4。推荐使用HEPES缓冲的PBS，因为它与组织培养高度兼容，具有较宽的缓冲范围，且其储存液在4 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高浓度大鼠尾胶原蛋白	Corning	354249
Sylgard 184 弹性体试剂盒	Corning	NC9285739	用于PDMS通道的弹性体
HEPES	Fisher	BP310	用于HEPES中和缓冲液
KCl	Fisher	BP366	用于HEPES中和缓冲液
KH2PO4	Fisher	BP362	用于HEPES中和缓冲液
Na2HPO4	Fisher	S374	用于HEPES中和缓冲液
NaCl	Fisher	BP358	用于HEPES中和缓冲液
Levy 改良型 Neubauer 血细胞计数板	Fisher	15170-208	细胞计数
6孔非组织培养板	Corning	351146
50 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art 塑料真空干燥器	Bel-Art	F4200-2021	PDMS脱气室
透明胶片	3M	pp2950	用于浇注PDMS通道的塑料薄膜
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	用于固化PDMS微通道的加热板
真空调节器	Precision Medical	PM3100	胶原蛋白微通道用真空调节器
8" x 8" 橡胶片	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	用于浇注PDMS微通道的橡胶片
8" x 8" x 0.125" 丙烯酸板	Amazon	Plexiglass sheets	用于浇注PDMS微通道
10磅重物	Amazon	CAP Barbell	用于浇注PDMS微通道
15 ml 锥形管	Fisher	352097
50 ml 锥形管	Fisher	352098
塑料移液管	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% 乙醇	Fisher	NC9663244