用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 体内

摘要

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。

摘要

传统上，大多数细胞过程仅在二维条件下进行研究。尽管这些研究有助于了解一般的细胞信号传导机制，但却忽略了细胞从局部微环境和细胞外基质（ECM）的结构与力学特性中接收到的重要细胞信号。为了理解细胞在生理性的ECM中如何相互作用，有必要在三维检测体系的背景下对其进行研究。细胞迁移、细胞分化和细胞增殖只是少数几个已被证实会受到三维ECM力学特性局部变化影响的细胞过程。I型胶原是ECM中一种核心的纤维状成分，其作用远不止是组织的简单结构组分。在正常条件下，来自胶原网络的力学信号可指导形态发生并维持细胞结构。在疾病状态下的微环境（如肿瘤微环境）中，胶原网络常发生显著重塑，表现为成分改变、沉积增加以及纤维排列结构异常。在乳腺癌中，纤维排列程度具有重要意义，因为垂直于肿瘤边界的排列纤维增加与患者预后较差相关¹。排列有序的胶原基质可通过持续性迁移促进肿瘤细胞的扩散^2,3。以下是一个将细胞包埋于三维纤维状胶原水凝胶中的简单实验方案。该方案易于适配多种实验平台，可重复地构建出有序或随机排列的胶原基质，用于在可调控的三维生理微环境中研究细胞迁移、细胞分裂及其他细胞过程。

引言

许多细胞过程已在二维条件下被广泛研究，从而形成了关于基本细胞信号传导机制的系统性知识。然而，这些研究忽略了细胞从局部细胞微环境及细胞外基质（ECM）的结构和力学特性中所接收到的重要细胞信号。为了更深入地理解细胞在生理环境中的相互作用，有必要在三维（3D）体系中对其进行研究。这些3D实验中的ECM可以来源于细胞自身产生，也可由纯化的蛋白质重新构建。无论ECM来源如何，3D基质实验已被证明对于理解细胞如何在生理环境中迁移和相互作用具有不可估量的价值。例如，在3D基质中培养的细胞表现出依赖于周围ECM力学特性的独特运动模式，而这些模式在二维实验中并未观察到^4-6。此外，与在玻璃或塑料等坚硬表面培养的细胞相比，在3D环境中培养的细胞其应力纤维和黏着斑的数量更少且程度更弱⁷。

然而，三维环境相关检测的重要性并不仅限于细胞迁移。某些其他细胞信号事件也只能通过三维检测来进行研究。在组织和细胞分化过程中，细胞外环境和细胞外基质（ECM）的刚度可提供影响形态发生事件的信号。例如，乳腺上皮细胞的管状结构形成仅发生在低刚度的三维基质中，而在高刚度基质或二维基底上则无法发生^8,9。当在高刚度三维基质中培养时，这些上皮细胞会表现出异常表型，其特征是增殖增加以及由FAK和ERK信号通路改变所驱动的细胞膜突起增多¹⁰。已知许多其他信号通路和细胞过程同样受到局部细胞环境刚度的影响，这些信号级联反应凸显了在具有适当局部机械特性的三维细胞外基质背景下研究信号事件和细胞表型的重要性。

I型胶原是一种特别相关的蛋白质，可用于 体外 研究中至关重要，因为它是细胞外基质（ECM）中最丰富的成分，负责细胞微环境的多种力学特性。尽管最初被认为仅是一种结构蛋白，但其作用现已知远为复杂。胶原纤维的组成、结构、取向、密度和刚度共同构成了一个集中的信号信息微环境⁵在某些疾病的发展过程中，如慢性炎症和肿瘤发生，胶原网络会发生显著重塑。^2,11在乳腺癌中，胶原蛋白沉积增加和组织硬度升高伴随着肿瘤进展，且可能促进其发展。在这些早期肿瘤中，硬化后的胶原网络呈现受力状态且排列更为有序，大多数纤维包裹着生长中的肿瘤。²随着肿瘤的进展，胶原持续发生重组，纤维网络的某些区域逐渐垂直于肿瘤边界排列。^2,12垂直排列作为一种预后生物标志物，提示此类患者无病进展生存期和总生存期均较差¹一种对此相关性的解释是，不良预后是由于肿瘤细胞在排列有序的胶原网络中持续迁移，导致其扩散增加所致。³.

为了理解细胞如何特异性响应肿瘤进展过程中所观察到的排列与组织结构，有必要制备随机和定向排列的三维胶原基质用于实验。目前有三种基本方法可在纤维网络中诱导胶原排列。第一种技术利用应变诱导装置，通过在两点之间收缩或拉伸胶原以实现定向排列。沿受力轴方向的纤维被拉紧，而垂直于该轴的纤维则被压缩并发生屈曲。尽管应变诱导技术通常能实现优异的排列效果，但该方法需要体积较大的设备，难以适配多种实验平台^3,13。另一种方法是通过在局部接种细胞团块，由细胞自身收缩并牵引胶原纤维实现排列¹³。该方法的主要问题是结果变异性较大，因为多种参数可能发生变化。第二种方法是在胶原聚合过程中利用磁性微珠和外加磁场诱导排列^13,14。该方法使用简单设备即可获得良好效果，但需要借助抗体或其他手段使聚合物磁化，因此成本相对较高，且由于网络中连接点增加，可能改变胶原凝胶的刚度。此外，该过程中使用的磁性微珠通常具有自发荧光，对成像实验造成干扰。最后一种方法是利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道诱导排列^3,15,16。该方法通过将正在聚合的胶原溶液流经微小的微流控通道来实现定向排列。这些微流控通道可设计成多种结构，易于适配各种实验平台。此外，由于尺寸微小，所需胶原及其他试剂的用量极少，因此成本非常低廉。

本文提供了一种将细胞嵌入三维纤维状胶原水凝胶中的简单实验方案。此外，还介绍了一种更先进的技术，即利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道来控制胶原基质的排列与取向。该方案可轻松适配多种实验平台，能够可重复地生成有序或随机的胶原基质，用于在三维生理微环境中研究细胞迁移、细胞分裂及其他细胞过程。

方案

1. 用于三维研究和细胞收缩测定的胶原溶液的中和、稀释与聚合

1. 在冰上、无菌细胞培养超净台中，用预冷的无菌100 mM HEPES（溶于2×PBS，pH 7.4）以1:1比例中和胶原蛋白，置于15 ml锥形管中。用塑料移液管充分混匀，直至溶液均匀，无可见混匀产生的旋涡。混匀过程中注意避免引入气泡。短暂置于冰上保存。
2. 用细胞培养基（如RPMI、DMEM）将中和后的胶原蛋白稀释至适当浓度， 等等。).
   1. 为计算制备目标胶原蛋白浓度所需的中和胶原蛋白量，使用以下公式 N = (D×V)/(S/2)，其中 N 中和胶原蛋白所需的量， D 即所需的胶原蛋白浓度， V 是目标胶原蛋白浓度的终体积，S 是起始储备胶原蛋白浓度。
   2. 通过加入细胞和细胞培养基溶液，将中和后的胶原液体积补足。充分混匀后置于冰上保存，待准备浇铸时使用。
      1. 示例：制备1 ml体积、浓度为2 mg/ml的凝胶（在6孔板或50 mm玻璃底培养皿中成胶的典型体积），首先将目标浓度（2 mg/ml）乘以目标终体积（1 ml），得到2 mg。将该数值除以试剂瓶上标注的储存液浓度的一半（9.49 mg/ml）。在此情况下，取0.42 ml中和后的胶原蛋白溶液，与0.58 ml培养基/细胞混合液混合稀释。
3. 将冰冷的胶原蛋白/细胞/培养基混合物移液至未经组织培养处理的6孔板或50 mm玻璃底培养皿中。用移液枪头将溶液均匀铺开。
   注意：必须使用未经组织培养处理的培养板，以尽量减少细胞在胶原凝胶外的黏附或生长。
4. 室温下静置约10至15分钟，使其聚合。凝胶在聚合后应变为不透明状。
5. 待其变浑浊后，将培养皿转移至37 ˚C继续孵育45–60分钟，以完成聚合。
6. 孵育45至60分钟后，加入2至3毫升培养基，用P200移液器吸头沿孔或培养皿边缘缓慢移动，使凝胶从孔壁脱离。轻轻摇晃培养皿以释放凝胶，胶原凝胶应悬浮于培养基中。

2. 蛋白质印迹、细胞形态发生及凝胶收缩力测定

1. 为评估蛋白质水平、细胞形态或细胞收缩力与细胞外基质（ECM）刚度的关系，首先根据步骤1.1–1.6制备接种细胞的胶原凝胶，用于为期7–10天的实验。每种细胞系的接种密度需根据其生长速率和汇合度通过实验确定。对于10天的实验，接种密度可为每凝胶20,000–100,000个细胞。
2. 为测量细胞收缩力，每隔24小时或在适当的时间间隔，使用直尺或相机测量凝胶直径。
   注意：此外，还可通过显微镜采集的相应图像，检测凝胶中接种细胞系的特征性形态学特征，例如类腺泡结构、上皮细胞管状结构、细胞突起和片足。
3. 为评估蛋白质水平，使用 RIPA 缓冲液裂解凝胶，并按照 Wozniak 所述方法对目标蛋白质进行 Western 印迹分析 等. ¹⁷ 和 Gallagher 等. ¹⁸.
   1. 重要提示：在比较不同细胞系的收缩力时，应将收缩力归一化为总DNA量，该DNA可按照Lui所述方法从凝胶中提取。 等¹⁹，或一种不变的持家蛋白（组蛋白、GAPDH） 等等。通过蛋白质印迹分析，如Wozniak所述 等.¹⁷ 和 Gallagher 等.¹⁸若使用血细胞计数板对凝胶内的细胞进行计数，需将细胞数量归一化至凝胶的总面积，因为收缩的凝胶会使细胞浓缩。
4. 每3至4天更换一次凝胶培养基，移除1 ml旧培养基，并加入1 ml新鲜培养基。测量完成后应及时为凝胶补充培养基，因为添加新鲜培养基或血清会导致收缩力出现短暂升高。

3. 用于胶原纤维定向排列的聚二甲基硅氧烷微通道的制备

注意：为了生成取向的胶原基质，需要通过软光刻技术制备SU-8硅模板，以用于PDMS微通道的模具（图 2A）¹⁵。

1. 制备PDMS通道时，使用一次性杯子和搅拌棒将PDMS充分混合。对于6英寸的硅胶母模，将20 g弹性体基质与2 g固化剂混合。
2. 将装有PDMS混合物的一次性杯子置于真空腔中，在550 mm Hg的真空压力下脱气。脱气时间为1 – 1.5小时。
3. 在对PDMS进行脱气的同时，准备用于浇注的硅胶母模。将一张干净的透明薄膜放置在加热板上，然后将硅胶母模置于其上，确保微通道模具面朝上。
   注意：在PDMS浇铸和固化过程中，硅胶母模将被夹在两张透明薄膜之间。
4. 1 – 1.5小时后，从真空腔中取出脱气后的PDMS，缓慢倾倒至硅胶母模上。
   重要提示：避免产生气泡。持续从母模中心倾倒，并依靠重力使其均匀铺展。
   注意：PDMS液滴无需完全延伸至母模边缘。
5. 将PDMS浇注到母模上后，在硅胶母模和PDMS上方覆盖第二张透明薄膜。小心地将第二张透明膜从一端滚压至另一端，以避免夹入气泡。操作时请勿过快。此时PDMS应已均匀覆盖母模表面。
6. 在透明膜上方轻轻放置一片橡胶片，然后在其上放置一片1/8"的亚克力板。
7. 在亚克力板上放置三个10磅的重物。初始时重物会呈现“漂浮”状态"，待其自然沉降并稳定后再进行后续操作"。
8. 将加热板温度设定为70 ˚C，使PDMS固化4小时。固化完成后至少静置冷却1小时，再进行后续操作。
9. 小心地从晶圆上剥离顶部的透明薄膜，并用镊子取出通道结构。
10. 将制备好的PDMS通道存放在无尘培养皿中，待使用时取出。

4. 准备PDMS微通道以供使用

1. 将通道倒置放置在新的、干净的透明胶片上。使用尖头镊子以旋转方式清洁所有端口（图2b），清除任何PDMS碎片。
2. 使用一段包装胶带作为粘尘纸清洁通道。将胶带贴在实验台表面（粘性面朝上），然后将通道置于其上。用镊子的圆头按压通道，确保充分接触。取下并重复操作于两侧，直至可见碎屑被清除。
3. 将清洁并准备好的PDMS通道转移至50 ml锥形管中，加入70%乙醇。在最大转速下涡旋振荡30秒。弃去乙醇，更换为新鲜的70%乙醇。保存于70%乙醇中，待使用时取出。
4. 在组织培养超净台内，采用无菌操作技术，将PDMS通道转移至洁净无菌的盖玻片或玻璃底培养皿上。将通道面朝上放置，并进行紫外照射，直至乙醇完全挥发。
5. 待干燥后，翻转PDMS使通道面朝向盖玻片向下。将PDMS通道按压在玻璃表面，形成良好密封。添加一块无菌PDMS覆盖/封闭中心端口（端口B，图2b）。彻底干燥后方可进行后续操作。
6. 用无菌水中配制的10 µg/ml胶原蛋白预包被通道内表面。包被时，在通道顶部加入100 µl胶原溶液液滴，并通过负压抽吸使其流经通道。在37 ˚C孵育1小时后，将含有胶原包被液的通道转移至冰箱中。冷藏约15–30分钟。
7. 用抽吸装置或移液器移除胶原包被液，并开始胶原蛋白的制备步骤。

5. 微通道中使用的胶原蛋白制备

1. 在冰上，用预冷的100 mM HEPES（溶于2倍PBS，pH 7.4）以1:1比例中和胶原蛋白。充分混匀至溶液均匀（更多细节参见第1.1节）。
2. 用细胞培养基将中和后的胶原蛋白稀释至适当浓度（更多细节参见第1.2节）。在冰上孵育15分钟。
3. 同时，将安装好的通道置于冰上预冷。
   注意：目标是使通道操作中的所有组分温度均达到4 ˚C或更低。胶原蛋白成核的温度和时间是聚合过程中的关键参数，必要时可作为进一步优化的起始点。
4. 此时用血细胞计数板对细胞进行计数，并重悬至适当的接种密度。为便于计算，建议将细胞重悬至每毫升100万至300万个细胞（更多细节亦参见第2.1节）。
5. 细胞计数完成后且已过15分钟，即可进行胶原蛋白浇注。

6. 制备取向排列与随机分布的胶原微通道

1. 在将胶原蛋白吸入通道之前，使用在线真空调节器调整并设定真空压力。真空压力提供驱动力，以诱导并控制胶原蛋白流动速率，从而决定其排列程度。
   1. 对于随机或非定向排列的基质，使用宽通道（3 mm 宽 × 200 µm 高），真空压力为 10 mm Hg 或更低。
   2. 对于定向排列的基质，使用窄通道（1 mm 宽 × 200 µm 高），真空压力为 60 mm Hg 或更高。
2. 将安装好的通道从冰上取出，并放置于超净台清洁且已消毒的表面上。
3. 迅速操作，将 120–150 µl 中和后的胶原蛋白溶液加入端口 A（图 2b）。
4. 将连接至真空管路的 25 ml 移液器置于端口 C 上（图 2b），将胶原蛋白吸入通道内。操作时应以单一、均匀的动作完成吸入过程。重要提示：对于随机或非定向排列的基质，应缓慢地将胶原蛋白拉过通道（约 0.5–1 mm/秒），到达末端后即停止；对于定向排列的基质，应更快地拉动胶原蛋白，但需注意避免产生气泡。
5. 使用 P200 移液器或抽吸装置小心移除端口区域多余的胶原蛋白。
6. 在端口 A 和 C 上均覆盖无菌 PDMS 片段。此时所有端口均应被覆盖。
7. 2–3 分钟后，移除中央 PDMS 片段（端口 B），并向中央端口加入 2–3 μl 细胞悬液（5,000–10,000 个细胞）。在室温下静置 10–15 分钟，使其部分聚合（变为不透明）。
8. 10–15 分钟后，转移至 37 ˚C 继续孵育 15–30 分钟以完成聚合。移除 PDMS 覆盖物，加入培养基完全覆盖通道，并根据需要培养细胞。可通过移除 1 ml 旧培养基并替换为 1 ml 新培养基的方式进行换液。

结果

尽管三维实验可以在相同刚度的胶原凝胶中进行，但通过改变凝胶的刚度可用于确定细胞对其微环境中机械变化的响应方式。当嵌入的细胞无法局部收缩周围胶原时，该胶原水凝胶即被定义为刚性凝胶。不同类型细胞的内在收缩力各不相同，因此最好首先建立一个简单的收缩力曲线，以确定被细胞感知为顺应性或刚性的胶原浓度。

首先保持细胞数量恒定，逐步增加胶原凝胶的浓度。凝胶的刚度将随浓度呈指数级增长，如先前研究所示。^10,20一个代表性收缩力测定实验示例如下所示 图1此处，将50,000个4T1细胞包埋于2 mg/ml或3.5 mg/ml的胶原凝胶中培养5天。4T1细胞系是一种高收缩性、具有转移能力的癌细胞系，但其仅能使高密度凝胶收缩约10%（图1a，c）。这种低程度收缩对于刚性凝胶分类而言是典型的。类似的低密度凝胶（2 mg/ml， 图1b，c在相同时间范围内...

讨论

3D collagen gels are a valuable addition to our toolbox to understand how cells interpret and respond to their local microenvironment. This manuscript has provided a very basic protocol for embedding cells within a 3D collagen matrix, and to reproducibly generate matrices with random or aligned collagen fibers. Both protocols work as adaptable platforms where different collagen isoforms, crosslinkers, or other matrix proteins could potentially be added at the time of polymerization. It is also easy to modify the platform...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高浓度大鼠尾胶原蛋白	Corning	354249
Sylgard 184 弹性体试剂盒	Corning	NC9285739	用于 PDMS 通道的弹性体
HEPES	Fisher	BP310	用于 HEPES 中和缓冲液
KCl	Fisher	BP366	用于 HEPES 中和缓冲液
KH2PO4	Fisher	BP362	用于 HEPES 中和缓冲液
Na2HPO4	Fisher	S374	用于 HEPES 中和缓冲液
NaCl	Fisher	BP358	用于 HEPES 中和缓冲液
Levy 改良型牛鲍计数板	Fisher	15170-208	细胞计数
6 孔非组织培养板	Corning	351146
50 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P50g-1.5-30-f
Bel-Art 塑料真空干燥器	Bel-Art	F4200-2021	PDMS 脱气室
透明胶片	3M	pp2950	用于浇注 PDMS 通道的塑料薄膜
ThermoScientific CimaRec	ThermoScientific	HP141925	用于固化 PDMS 微通道的加热板
真空调节器	Precision Medical	PM3100	胶原蛋白微通道用真空调节器
8" x 8" 橡胶片	Amazon - Rubber-Cal	Silicone - 60A	用于浇注 PDMS 微通道的橡胶片
8" x 8" x 0.125" 丙烯酸板	Amazon	Plexiglass sheets	用于浇注 PDMS 微通道
10 磅重物	Amazon	CAP Barbell	用于浇注 PDMS 微通道
15 ml 圆锥形离心管	Fisher	352097
50 ml 圆锥形离心管	Fisher	352098
塑料移液管	Dot Scientific	229202B, 229206B, and 667225B	2 ml, 5 ml, and 25 ml
70% 乙醇	Fisher	NC9663244