本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。
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摘要
摘要
人原代绒毛细胞滋养层细胞是研究胎盘功能和调控机制以及理解妊娠相关疾病非常有用的原代细胞来源。在本方案中，通过标准的DNase/胰蛋白酶法从胎盘新鲜分离的人原代绒毛细胞滋养层细胞，采用小干扰RNA（siRNA）进行微孔电穿孔转染。与基于脂质体转染（lipofection）的方法相比，该方法显著提高了siRNA的转染效率。转染后的细胞可在转染后3至4天内通过标准的蛋白质印迹法（Western blot）进行分析。此外，利用培养的人原代绒毛细胞滋养层细胞，对电泳迁移率变动分析（EMSA）进行了优化，并在培养第1至第4天的细胞提取物中实施了该分析。使用这些原代培养细胞及所述实验方案，可评估特定基因和转录因子在绒毛细胞滋养层分化为类似合体滋养层细胞层过程中的作用。然而，由于原代细胞在体外培养中的有效时间较短，无法采用需要更长时间的方法，例如建立稳定细胞群体。因此，对该细胞群体的功能验证依赖于高度优化的基因转导方案。
引言
人类胎盘功能障碍与多种妊娠相关疾病（如子痫前期和宫内生长受限）的发生有关1。胎盘的重要细胞组分是滋养层细胞，可进一步分为绒毛外滋养层细胞和绒毛细胞滋养层细胞。绒毛细胞滋养层细胞融合后进一步分化为合体滋养层，形成一种多核细胞结构，在母胎物质交换和激素生成中发挥重要作用2。人类原代绒毛细胞滋养层细胞及其分化后的细胞是重要的生物学样本，可使研究人员在体外培养条件下研究多种与胎盘相关的生物学过程，例如细胞融合。此外，目前仍在持续开展研究，以鉴定有助于合理管理并改善妊娠相关疾病预防性治疗的生物标志物。实验室通常采用基于胰蛋白酶消化胎盘绒毛的标准分离方法，从新鲜胎盘中分离原代人类绒毛细胞滋养层细胞3。由于培养的细胞滋养层细胞会迅速失去增殖能力，并在培养过程中快速分化为类似合体滋养层的结构4，因此需要高效的转染方法和优化的分析手段。先前的研究已确定了这些原代细胞滋养层细胞转染的最佳条件5。本文介绍了一种不同的siRNA转染方法，该方法此前已在该类细胞中进行过测试6。与基于脂质体转染（lipofection）的方法相比，这种微孔电穿孔（microporation）方法可显著提高转染效率，其评估依据为特定基因沉默程度的增强。
启动子和基因表达研究也有助于更深入理解胎盘功能。尽管由于初级绒毛细胞滋养层细胞的培养时间较短而较难使用，但采用标准实验方案进行启动子分析仍是可行的，如先前已发表的研究所示。 7电泳迁移率变动分析（EMSA）是这些常用方法之一 体外 方法，可快速简便地监测DNA-蛋白相互作用。利用这些原代滋养层细胞的核提取物，检测合胞素-2（Syncytin-2）启动子区域的特异性相互作用。结果显示，在培养的不同时间点均可特异性且可重复地检测到结合因子。
本方案中提供的数据证实，我们的转染方法和电泳迁移率变动分析（EMSA）方案可用于分离的原代绒毛细胞滋养层细胞，将对研究绒毛细胞滋养层细胞在正常或病理条件下的多种功能具有重要意义。
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方案
这些方案已获得魁北里大学（UQAM）伦理委员会批准，符合蒙特利尔大学医院中心圣吕克医院（蒙特利尔，加拿大）伦理委员会的指导方针。参与者均已签署知情同意书。
1. 培养基制备与初级绒毛细胞滋养层细胞的分离
- 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 25 mM HEPES、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，制备人原代绒毛细胞滋养层细胞的培养基。将配制好的培养基经无菌 0.22 µm 滤器过滤后，分装为每份 50 ml，保存于 -20 °C 冰箱中。
- 按照标准方案3从新鲜胎盘组织中分离原代绒毛细胞滋养层细胞。
- 使用镊子轻轻刮除组织表面的胎儿膜，注意避免去除绒毛组织。用手术刀和剪刀将剩余的胎盘绒毛切成约 3 x 3 cm 的小块。用含 0.9% NaCl 的水彻底冲洗，以去除母体血液。
- 用镊子夹住每一块组织，用剪刀小心地从残留的血管和纤维组织中分离出绒毛组织。
- 取 15 至 30 mg 绒毛组织，在含有胰蛋白酶（9.6 x 105 至 1.8 x 106 U；终浓度 1.2 mg/ml）和脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）（终浓度 200 µg/ml）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，于 37 °C 水浴中持续振荡消化 30 分钟，共进行四次消化。
注：第一次消化使用总体积 150 ml，第二次使用 100 ml，后两次各使用 75 ml。
- 收集含有分散细胞的上清液，在 1,250 x g 条件下离心 15 分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 预热的含 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 中。
- 将分散的细胞铺在不连续的 5%–70% 聚乙烯吡咯烷酮包被的二氧化硅梯度液上（梯度液配制见表 1），在 507 x g 条件下离心 23 分钟（不启用刹车）。用移液器吸取密度介于 1.017 至 1.033 之间的层，并收集梯度中 40% 至 50% 区间的细胞层。用含 1% 青霉素/链霉素的 10 ml 预热 DMEM 对细胞进行充分洗涤。
注：所收集的组分对应密度为 1.048 至 1.062，其中富含滋养层细胞。 - 使用血细胞计数板对细胞进行计数。简要步骤如下：混匀细胞悬液，取 10 µl 加入新的微量离心管中，加入 10 µl 台盼蓝，再次轻柔混匀。吸取细胞悬液填充血细胞计数板的计数室，在 10X 物镜下进行细胞计数。
- 将 1 x 106 和 4.5 x 106 个细胞分别放入不同的离心管中，用于后续第 1.3 节和第 2 节实验。将剩余细胞以每孔 1.5 x 106 个细胞的密度接种于补充培养基中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养，最长不超过 4 天，用于其他实验。
- 使用镊子轻轻刮除组织表面的胎儿膜，注意避免去除绒毛组织。用手术刀和剪刀将剩余的胎盘绒毛切成约 3 x 3 cm 的小块。用含 0.9% NaCl 的水彻底冲洗，以去除母体血液。
- 评估分离的原代绒毛细胞滋养层细胞纯度
- 将 1 x 106 个 freshly isolated 的细胞在微量离心管中以 300 x g 离心。弃去上清液，加入 1 ml 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。再次以 300 x g 离心，用移液器吸除 PBS。
- 向细胞中加入 1 ml 冷甲醇，在 -20 °C 孵育 20 分钟。以 300 x g 离心 5 分钟，吸除甲醇。
注意：操作甲醇时应佩戴防毒面具、护目镜和橡胶手套。 - 加入 1 ml 室温 PBS 重悬细胞以进行再水化，以 300 x g 离心后吸除 PBS。
- 将细胞在含 FBS（1:50 [v/v] 稀释）和 FcR 封闭试剂（1:10）的 PBS 中室温孵育 45 分钟，以消除非特异性结合。
- 用 500 µl 室温 PBS 洗涤两次，每次以 300 x g 离心 5 分钟，吸除 PBS。将细胞重悬于 100 µl 室温 PBS 中。
- 在含 0.2% BSA 的 PBS 中，加入鼠抗人细胞角蛋白-7（cytokeratin-7）荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的单克隆抗体 LP5K 克隆（1:200）或同型对照非特异性抗体，室温避光孵育 45 分钟。孵育后用 PBS 洗涤细胞。
- 通过流式细胞术3分析细胞。选择流式细胞术检测显示 CK-7 阳性细胞比例不低于 96% 的细胞样本用于后续实验。
2. 人原代绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染
- 使用微电穿孔装置转染人原代绒毛细胞滋养层细胞
- 准备6孔板，每孔加入2 ml含补充物的DMEM培养基，用于培养显微穿孔处理的细胞。
- 原代滋养层细胞分离后（见第1.2节），取部分细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞数量。
- 转移 1.5 × 106 将细胞转移至微量离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。用1 ml杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（含Mg）洗涤细胞2+，Ca2+离心前去除上清，然后在室温下以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 吸除上清液，并将细胞在100 µl重悬缓冲液中轻轻重悬。
注意：为最大限度地保持细胞活力和转染效率，避免将细胞悬液在室温下放置超过15-30分钟。 - 向1.5 ml离心管中加入300 ng Syncytin-2 siRNA（或对照用乱序siRNA），用100 µl转染枪头吸取细胞-siRNA混合液。将枪头插入电穿孔仪（见材料列表）中，对细胞施加一次1,300 V、30 msec的单脉冲。
- 立即将细胞转移至已制备的6孔板（步骤2.1.1）中，孔内含37 °C预热的完全培养基，以避免细胞损伤。
- 对剩余样品重复步骤 2.1.5 和 2.1.6。
- 轻轻摇动培养板30秒，以确保细胞均匀分布。将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育。2 置于培养箱中培养24至48小时。转染后24小时更换培养基。
- 通过蛋白质印迹分析评估转染效率（见步骤3至6）。
- 人原代细胞滋养层细胞中siRNA的脂质体转染
- 绒毛细胞滋养层细胞分离后，以1.5 x 10⁶细胞/毫升的密度接种细胞6 每孔加入2 ml培养基，接种细胞至6孔板，每孔细胞数为指定数量，培养18小时。
- 将300 ng的Syncytin-2特异性siRNA（或对照性随机siRNA）和5 µl脂质转染试剂分别加入两个1.5 ml离心管中，每管用无抗生素和无血清的培养基补足至总体积10 µl。孵育5分钟。
- 将稀释后的试剂混合，在室温下继续孵育20分钟，以形成转染复合物。向混合物中加入90 µl不含抗生素和血清的培养基，最终体积为100 µl。
- 从6孔板中移除培养基（步骤2.2.1）。向每孔加入2 ml新鲜培养基和100 µl转染混合物。将细胞在37 °C、CO₂2 在培养箱中孵育24至48小时。转染后24小时更换培养基。
- 通过蛋白质印迹分析评估转染效率（见步骤3至6）。
3. 全细胞培养物裂解液的制备
- 移除培养基，使用预热的不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 DPBS 洗涤每个孔（来自步骤 2.1.8 和 2.2.4）。吸除 DPBS，每孔加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 1–3 分钟。加入 500 µl 含血清的生长培养基以终止胰蛋白酶消化。
注意：根据培养瓶/培养皿类型使用适当的培养基体积：每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 培养瓶使用 1 ml；每 5 × 106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 培养瓶使用 0.5 ml。 - 将细胞转移至 1.5 ml 微量离心管中，在室温下以 300 × g 离心 2 分钟以收集细胞沉淀。用不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 DPBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 × g 离心 2 分钟以再次收集细胞沉淀。
- 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。将离心管置于冰上。用 50–200 µl 冰冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液重悬沉淀（缓冲液成分见表 2），其中加入新鲜配制的蛋白酶和磷酸酶抑制剂至终浓度为 1×。短暂涡旋混匀后，冰上静置 30 分钟。
- 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 20 分钟。小心将离心管放回冰上。使用移液器将上清液转移至另一置于冰上的预冷干净微量离心管中。弃去沉淀。
4. 培养细胞核提取物的制备
- 对于每个孔（步骤 1.2.5），用 1 ml 预热的不含 Mg2+、Ca2+ 的 DPBS 洗涤培养的细胞滋养层细胞两次。吸除 DPBS，加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶/EDTA。在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 1–3 分钟，并通过加入 500 µl 含血清的生长培养基终止胰蛋白酶消化。
- 将细胞转移至 1.5 ml 微量离心管中，在室温下以 300 × g 离心 2 分钟收集细胞沉淀。用不含 Mg2+、Ca2+ 的 DPBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 × g 离心 2 分钟再次收集细胞沉淀。小心吸除所有上清液，避免扰动沉淀，将离心管置于冰上。
- 根据制造商说明书提取核蛋白。使用蛋白定量检测法（Bradford 法或二喹啉酸法（BCA））测定各样品的蛋白浓度。
5. 样品制备与电泳
- 使用蛋白质定量检测法（例如 Bradford8 或 BCA9）测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。
- 根据制造商说明书（如果抗体可在还原和变性条件下使用），向 20–30 µg 总蛋白中加入等体积的 2x Laemmli 上样缓冲液（表 2）。
- 将细胞裂解液在 100 °C 下煮沸 5 分钟。将裂解液分装为 50–100 µl 每管，以避免反复冻融，并将剩余样品管储存于 -20 °C 以备后续使用。
- 在样品加热的同时，配制 1 L 的 1x 电泳缓冲液（凝胶组成见 表 2）。
- 将样品在 16,000 x g 下离心数秒，然后置于冰上冷却。
- 将等量蛋白样品与分子量标准蛋白标记物一同加入 12% SDS-PAGE 凝胶的各孔中（凝胶组成见 表 2），在 100 V 电压下电泳 1 至 2 小时。
6. 将蛋白质从凝胶转移至膜上
- 用甲醇活化聚偏二氟乙烯（PVDF）膜1分钟，并用1×转移缓冲液/10%甲醇溶液冲洗。根据蛋白大小，按照制造商说明书，转移30分钟至1小时。
注意：可在封闭步骤前使用丽春红S染色评估转移效率。
7. 抗体染色
- 使用 5% 封闭液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4 °C 下封闭过夜。
- 将膜与抗 Syncytin-2 抗体（4 µg/ml；1:5,000）6 或抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；0.4 µg/ml；1:500）在 5% 封闭液中于 4 °C 下孵育过夜（抗 Syncytin-2）或在室温下孵育 45 分钟。用 Tris 缓冲盐水 Tween（TBST；缓冲液成分见表 2）洗涤膜三次，每次 5 分钟。
- 将膜在 TBST 中的 5% 封闭缓冲液内，与适当的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔或抗小鼠二抗（1:10,000）在室温下孵育 1 小时。用 TBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟，然后用 TBS 冲洗。使用基于化学发光的印迹底物检测信号。
8. 单链寡核苷酸的放射性标记
- 磷酸化反应
- 在微量离心管中，加入50 ng的正向寡核苷酸，以及1× T4多聚核苷酸激酶缓冲液、1 U T4多聚核苷酸激酶和20 µCi (γ-32P) ATP，用无核酸酶水将反应体系补至20 µl。
- 在37 °C孵育30分钟。加入5 µl 0.5 M EDTA终止反应，再用无核酸酶水将体积调至50 µl。
- 从寡核苷酸中去除未掺入的核苷酸
- 按照生产商说明书，使用TE缓冲液（表2）平衡G-25柱。将柱子置于新的无DNase的1.5 ml微量离心管中。
- 将50 µl探针（来自步骤8.1.2）缓慢加至树脂上，注意不要搅动树脂层。在350 × g离心2分钟，使纯化后的样品收集到1.5 ml微量离心管中。用36 µl无核酸酶水洗涤G-25柱，并在350 × g离心2分钟，将洗涤液收集至同一微量离心管中。
- 与互补链寡核苷酸杂交
- 将放射性标记的探针（86 µl）转移至1.5 ml微量离心管中，加入200 ng反向寡核苷酸和1×退火缓冲液（表2）。在95 °C加热5分钟，然后在室温下静置过夜冷却。
- 在1.5 ml微量离心管中加入50 ng未标记的正向和反向寡核苷酸以及1×退火缓冲液，制备非放射性双链寡核苷酸。用无核酸酶水将体积调至100 µl。按照步骤8.3.1所述进行加热并置于室温保持。
9. EMSA用非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
- 制备一块4%的天然凝胶（10 × 12 cm），使用1.5 mm间隔的梳子（凝胶组分见表2）。用蒸馏水清洗所有玻璃板。
注意：必须确保玻璃板完全不含离子型去污剂（如SDS）。 - 立即在两块玻璃板之间倒入丙烯酰胺溶液，并使其充分聚合（约30分钟）。
- 组装电泳装置，向电泳槽中加入0.5× TBE缓冲液。在上样前，以150 V预电泳30分钟至1小时。
10. DNA 结合反应
- 在1.5 ml 微量离心管中，加入10 µg 核提取物（步骤4.3），用1×凝胶迁移结合缓冲液（表2）溶解，并用无核酸酶水将终体积调至10 µl。作为对照，准备一个不含核提取物的管。对于竞争反应，加入1 µl 冷的非特异性或特异性双链寡核苷酸（步骤8.3.2）。
- 向每个反应体系中加入1 µl 来自步骤8.3.1的放射性探针。在室温下孵育20分钟。每管加入1 µl 10×凝胶上样缓冲液，然后将各样品上样至第9节中制备的凝胶中。
- 在150 V电压下电泳1.5至2小时。电泳结束后，将凝胶和玻璃板用塑料膜包裹，置于磷屏成像曝光盒中，紧贴磷屏下方。将曝光盒于4 °C放置24小时。
- 从曝光盒中取出磷屏，插入磷屏成像仪中进行扫描。
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结果
足月妊娠后获取的新鲜胎盘用于分离人原代绒毛滋养层细胞，并开展方案部分所述的一系列实验。细胞分离后，我们首先利用细胞角蛋白-7标记物分析滋养层细胞的纯度（图1因此，使用单克隆抗细胞角蛋白-7抗体对细胞样本进行染色。 图1 代表通过密度梯度步骤分离纯化原代绒毛细胞滋养层细胞后，采用标准流式细胞术分析的典型实验结果。 >在标准实验中，97%的细胞（本例中为99%）对细胞角蛋白-7呈阳性染色，表明该细胞类型的纯化效率非常高。
分离后，人原代细胞滋养层细胞可直接用于转染。评估了两种不同的实验方案， 即， 显微穿孔和脂质体转染。两种方案均使用特异性靶向合体素-2 mRNA的siRNA进行测试，并以乱序siRNA作为阴性对照。随后通过蛋白质印迹分析评估转染效率。结果证实，在采用显微穿孔法处理的细胞滋养层来源提取物中，合体素-2的表达显著被抑制图2
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讨论
通过优化分离各种胎盘细胞群体的方案，人类胎盘功能与发育的研究已得到显著改进。其中研究最为深入的胎盘细胞群体之一是绒毛细胞滋养层细胞，其研究得益于能够高效且可靠地分离该细胞的优化方案。这进一步使得多种实验成为可能，例如转染和启动子研究。采用先前描述的方案3，可以获得纯度较高的原代绒毛细胞滋养层细胞群体。CK-7 是一种中间丝蛋白，在细胞滋养层细胞中表达。抗该蛋白的单克隆抗体可用于检测从胎盘分离后的滋养层细胞群体的纯度10。当96%的细胞呈CK-7阳性时，即定义为纯度达标。细胞随后可直接用于转染。基于脂质的转染方法被广泛用于将核酸导入原代细胞11,12。然而，某些细胞中脂质制剂的毒性成为其应用的不利因素。微孔电穿孔是一种利用移液器吸头作为电穿孔空间的电穿孔技术，其产生的热量极少，并可最大限度减少金属离子溶出、pH变化及氧化物形成；这些因素均可能对细胞造成损害。根据本文所提供的数据，通过Western blot分析判断，微孔电穿孔在siRNA递送方面比基于脂质的转染方法更为高效。采用EMSA方法，检测了一个针对合胞素-2（Syncytin-2）启动子特定区域设计的探针，该区域已...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金（#298527）（BB）的资助。CT 获得了机构 FARE 奖学金的支持。AV 获得了 NSERC Graham Bell 博士奖学金的支持。BB 担任加拿大人类逆转录病毒学研究主席（第二级）。感谢 Beatrix Beisner 在文本修改过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含 HBSS Ca2+，Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS（10倍浓度） | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM高糖培养基（不含Hepes） | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| 青霉素-链霉素-新霉素（100倍浓缩液） | Gibco | #15640-055 | |
| 两性霉素 B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO₄4.7H2O | Sigma | #M | |
| 胎牛血清 | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | 用于密度梯度 |
| 合胞素-2 siRNA | Ambion Life Technologies | #AM16708 | |
| 随机对照siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| 胰蛋白酶 I 型 | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT 脂质转染 试剂 | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | 罗氏诊断 | #11873580001 | |
| Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记抗体 | 细胞信号传导 | #7074 | |
| BM 化学发光 Western 印迹底物（POD） | 罗氏诊断 | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 多核苷酸激酶 | NEB | #M0201S | |
| ATP，[γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| 丙烯酰胺 | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | #A3678 | |
| 抗人细胞角蛋白-7 抗体克隆 LP5K，FITC 标记 | Millipore | CBL194F | 稀释比例 1:200 |
| FcR封闭试剂 | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | 稀释比例 1:10 |
| BD Acuri 流式细胞仪系统 | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 仪器 | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R（Neon 转染系统 100） µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | 用甲醇活化 |
| 抗人GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体或抗小鼠抗体 | 细胞信号传导 | #7074 | 1:10,000 |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体 | 细胞信号传导 | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER 核与胞质提取试剂 | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25柱 | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| 化学发光和荧光成像设备 | 莫恩特éal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% 天然凝胶 | 自制 | ||
| PBS | 自制 | 1x | |
| 个人分子成像仪（PMI）系统 | 伯乐（BioRad） |
参考文献
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