本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。
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摘要
摘要
人原代绒毛细胞滋养层细胞是研究胎盘功能和调控机制以及理解妊娠相关疾病非常有用的原代细胞来源。在本方案中，通过标准的DNase/胰蛋白酶法从胎盘新鲜分离的人原代绒毛细胞滋养层细胞，采用小干扰RNA（siRNA）进行微孔电穿孔转染。与基于脂质体转染（lipofection）的方法相比，该方法显著提高了siRNA的转染效率。转染后的细胞可在转染后3至4天内通过标准的蛋白质印迹法（Western blot）进行分析。此外，利用培养的人原代绒毛细胞滋养层细胞，对电泳迁移率变动分析（EMSA）进行了优化，并在培养第1至第4天的细胞提取物中实施了该分析。使用这些原代培养细胞及所述实验方案，可评估特定基因和转录因子在绒毛细胞滋养层分化为类似合体滋养层细胞层过程中的作用。然而，由于原代细胞在体外培养中的有效时间较短，无法采用需要更长时间的方法，例如建立稳定细胞群体。因此，对该细胞群体的功能验证依赖于高度优化的基因转导方案。
引言
人类胎盘功能障碍与多种妊娠相关疾病（如子痫前期和宫内生长受限）的发生有关1。胎盘的重要细胞组分是滋养层细胞，可进一步分为绒毛外滋养层细胞和绒毛细胞滋养层细胞。绒毛细胞滋养层细胞融合后进一步分化为合体滋养层，形成一种多核细胞结构，在母胎物质交换和激素生成中发挥重要作用2。人类原代绒毛细胞滋养层细胞及其分化后的细胞是重要的生物学样本，可使研究人员在体外培养条件下研究多种与胎盘相关的生物学过程，例如细胞融合。此外，目前仍在持续开展研究，以鉴定有助于合理管理并改善妊娠相关疾病预防性治疗的生物标志物。实验室通常采用基于胰蛋白酶消化胎盘绒毛的标准分离方法，从新鲜胎盘中分离原代人类绒毛细胞滋养层细胞3。由于培养的细胞滋养层细胞会迅速失去增殖能力，并在培养过程中快速分化为类似合体滋养层的结构4，因此需要高效的转染方法和优化的分析手段。先前的研究已确定了这些原代细胞滋养层细胞转染的最佳条件5。本文介绍了一种不同的siRNA转染方法，该方法此前已在该类细胞中进行过测试6。与基于脂质体转染（lipofection）的方法相比，这种微孔电穿孔（microporation）方法可显著提高转染效率，其评估依据为特定基因沉默程度的增强。
启动子和基因表达研究也有助于更深入理解胎盘功能。尽管由于初级绒毛细胞滋养层细胞的培养时间较短而较难使用，但采用标准实验方案进行启动子分析仍是....
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方案
这些方案已获得魁北里大学（UQAM）伦理委员会批准，符合蒙特利尔大学医院中心圣吕克医院（蒙特利尔，加拿大）伦理委员会的指导方针。参与者均已签署知情同意书。
1. 培养基制备与初级绒毛细胞滋养层细胞的分离
- 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 25 mM HEPES、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，制备人原代绒毛细胞滋养层细胞的培养基。将配制好的培养基经无菌 0.22 µm 滤器过滤后，分装为每份 50 ml，保存于 -20 °C 冰箱中。
- 按照标准方案3从新鲜胎盘组织中分离原代绒毛细胞滋养层细胞。
- 使用镊子轻轻刮除组织表面的胎儿膜，注意避免去除绒毛组织。用手术刀和剪刀将剩余的胎盘绒毛切成约 3 x 3 cm 的小块。用含 0.9% NaCl 的水彻底冲洗，以去除母体血液。
- 用镊子夹住每一块组织，用剪刀小心地从残留的血管和纤维组织中分离出绒毛组织。
- 取 15 至 30 mg 绒毛组织，在含有胰蛋白酶（9.6 x 105 至 1.8 x 106 U；终浓度 1.2 mg/ml）和脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）（终浓度 200 µg/ml）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，于 37 °C 水浴中持续振荡消化 30 分钟，共进行四次消化。
注：第一次消化使用总体积 150 m....
- 使用镊子轻轻刮除组织表面的胎儿膜，注意避免去除绒毛组织。用手术刀和剪刀将剩余的胎盘绒毛切成约 3 x 3 cm 的小块。用含 0.9% NaCl 的水彻底冲洗，以去除母体血液。
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结果
足月妊娠后获取的新鲜胎盘用于分离人原代绒毛滋养层细胞，并开展方案部分所述的一系列实验。细胞分离后，我们首先利用细胞角蛋白-7标记物分析滋养层细胞的纯度（图1因此，使用单克隆抗细胞角蛋白-7抗体对细胞样本进行染色。 图1 代表通过密度梯度步骤分离纯化原代绒毛细胞滋养层细胞后，采用标准流式细胞术分析的典型实验结果。 >在标准实验中，97%的细胞（本例中为99%）对细胞角蛋白-7呈阳性染色，表明该细胞类型的纯化效率非常高。
分离后，人原代细胞滋养层细胞可直接用于转染。评估了两种不同的实验方案， 即， 显微穿孔和脂质体转染。两种方案均使用特异性靶向合体素-2 mRNA的siRNA进行测试，并以乱序siRNA作为阴性对照。随后通过蛋白质印迹分析评估转染效率。结果证实，在采用显微穿孔法处理的细胞滋养层来源提取物中，合体素-2的表达显著被抑制图2
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讨论
通过优化分离各种胎盘细胞群体的方案，人类胎盘功能与发育的研究已得到显著改进。其中研究最为深入的胎盘细胞群体之一是绒毛细胞滋养层细胞，其研究得益于能够高效且可靠地分离该细胞的优化方案。这进一步使得多种实验成为可能，例如转染和启动子研究。采用先前描述的方案3，可以获得纯度较高的原代绒毛细胞滋养层细胞群体。CK-7 是一种中间丝蛋白，在细胞滋养层细胞中表达。抗该蛋白的单克隆抗体可用于检测从胎盘分离后的滋养层细胞群体的纯度10。当96%的细胞呈CK-7阳性时，即定义为纯度达标。细胞随后可直接用于转染。基于脂质的转染方法被广泛用于将核酸导入原代细胞11,12。然而，某些细胞中脂质制剂的毒性成为其应用的不利因素。微孔电穿孔是一种利用移液器吸头作为电穿孔空间的电穿孔技术，其产生的热量极少，并可最大限度减少金属离子溶出、pH变化及氧化物形成；这些因素均可能对细胞造成损害。根据本文所提供的数据，通过Western blot分析判断，微孔电穿孔在siRNA递送方面比基于脂质的转染方法更为高效。采用EMSA方法，检测了一个针对合胞素-2（Syncytin-2）启动子特定区域设计的探针，该区域已.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金（#298527）（BB）的资助。CT 获得了机构 FARE 奖学金的支持。AV 获得了 NSERC Graham Bell 博士奖学金的支持。BB 担任加拿大人类逆转录病毒学研究主席（第二级）。感谢 Beatrix Beisner 在文本修改过程中提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含 HBSS Ca2+，Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS（10倍浓度） | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM高糖培养基（不含Hepes） | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| 青霉素-链霉素-新霉素（100倍浓缩液） | Gibco | #15640-055 | |
| 两性霉素 B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO₄4.7H2O | Sigma | #M | |
| 胎牛血清 | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | 用于密度梯度 |
| 合胞素-2 siRNA | Ambion Life Technologies | #AM16708 | |
| 随机对照siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| 胰蛋白酶 I 型 | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT 脂质转染 试剂 | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | 罗氏诊断 | #11873580001 | |
| Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记抗体 | 细胞信号传导 | #7074 | |
| BM 化学发光 Western 印迹底物（POD） | 罗氏诊断 | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 多核苷酸激酶 | NEB | #M0201S | |
| ATP，[γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| 丙烯酰胺 | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | #A3678 | |
| 抗人细胞角蛋白-7 抗体克隆 LP5K，FITC 标记 | Millipore | CBL194F | 稀释比例 1:200 |
| FcR封闭试剂 | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | 稀释比例 1:10 |
| BD Acuri 流式细胞仪系统 | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 仪器 | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R（Neon 转染系统 100） µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | 用甲醇活化 |
| 抗人GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体或抗小鼠抗体 | 细胞信号传导 | #7074 | 1:10,000 |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体 | 细胞信号传导 | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER 核与胞质提取试剂 | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25柱 | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| 化学发光和荧光成像设备 | 莫恩特éal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% 天然凝胶 | 自制 | ||
| PBS | 自制 | 1x | |
| 个人分子成像仪（PMI）系统 | 伯乐（BioRad） |
参考文献
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta....
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重印与许可
