此处展示了一种用于可视化脱细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。
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本文内容
摘要
摘要
无论病因如何，纤维化是所有类型心脏病的共同特征。尽管心脏基质生物学领域已取得诸多进展，但在基质形成机制、生理性与病理性重塑之间的差异，以及更为重要的——如何调控基质动态以促进组织修复并抑制纤维化等方面，仍存在重大知识空白。目前尚无任何治疗手段能够控制、预防或逆转心肌纤维化。部分原因可能在于心脏瘢痕形成过程本身的极端复杂性，例如心肌梗死后立即发生以替代死亡或濒死心肌细胞的过程。细胞外基质本身通过激活组织驻留细胞，并协助引导浸润性细胞迁移至功能丧失的病灶区域，从而参与重塑过程。基质还类似于一种储存库，可储存对正常基质 turnover 及纤维化信号传导至关重要的基质细胞蛋白。此外，已有研究证实基质在心肌组织中具有电机械功能。目前大多数评估纤维化的方法并非定性性质，而是提供可用于比较两组之间的定量结果，却无法反映基质底层结构的相关信息。本文重点介绍一种用于可视化心脏基质超微结构的技术。对去细胞化心脏组织进行扫描电子显微镜观察，可揭示出传统定量研究方法难以发现的显著结构差异。
引言
纤维化会破坏心肌正常的胶原网络，而该网络对于心肌细胞的正常力学功能1,2以及细胞间通讯、细胞内信号传导和细胞存活至关重要3。纤维化的形成是决定心脏功能的重要因素，由多种病因引起的心肌间质纤维化重构会导致左心室僵硬度增加和舒张功能障碍4。心肌纤维化还可能引发心律失常，无论纤维化重构是全身性还是局部性的进展，均与缺血性和非缺血性心肌病患者的不良预后密切相关5。同样，心肌纤维化的缺失是心室功能恢复和长期生存的强有力预测指标6。
纤维化的特征是过量胶原蛋白的沉积，其抗张强度与钢相当7，可在多个层面不利地影响心肌细胞功能。由过度胶原化基质产生的机械力可导致心肌细胞萎缩8,9、组织被动僵硬度增加10、张力性收缩引起的心肌僵硬11-13，以及向残存心肌细胞输送氧气的能力下降。心肌细胞与肌成纤维细胞之间的缝隙连接耦合也可能损害心脏的电学特性，增加心律失常发生的风险14-16。血管周围纤维化会改变心壁内冠状动脉和小动脉的血管运动反应性17，并导致管腔狭窄，从而减少氧气供应，影响心肌细胞的存活17-22。病理性纤维化及电学重构从最初的缺血性损伤或能量失衡部位开始，最终不可避免地进展为心力衰竭。
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方案
伦理声明： 动物操作方案已获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，方案编号 M/10/117（猪）和 M/10/219（小鼠））批准，并依照国际实验动物评估和认证委员会（AAALAC-International）标准进行。使用储存的人类心脏组织已获得范德堡大学医学中心机构审查委员会（IRB）批准（方案编号 100887）。
1. 样本采集与保存
- 配制新鲜的4%戊二醛磷酸盐缓冲液（0.1 M PB）溶液。
注意：戊二醛具有毒性，操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。- 使用21.8 g Na2HPO4 和6.4 g NaH2PO4 配制pH 7.4的0.2 M PB储备液，用去离子水（dH2O）定容至1,000 ml。Quantum satis（Q.s.）。
- 将400 µl 50%戊二醛加入2.5 ml PB储备液和2.1 ml dH2O中。
- 将一块组织（面积不超过2 cm2）浸入4%戊二醛溶液中。注意：也可使用更小的组织块，但应保证足够大小（不小于5 mm2），以便肉眼清晰观察，利于后续实验步骤的操作。 ....
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结果
该高亮技术已应用于未使用的人类心脏移植供体的心脏组织（图1）、心脏移植受体的切除组织、野生型和营养不良型小鼠的心脏组织（图3），以及猪心肌损伤模型中心肌梗死后的心脏样本（图2）。如图1所示，人类心肌基质是由交联蛋白构成的复杂网状结构，在横切面观察时呈现出蜂窝状结构。在图1的平面视图中，每个“蜂窝”结构的宽度约为40 µm，通常环绕单个心肌细胞。当通过闰盘连接时，多个心肌细胞可被视为沿“隧道”纵向延伸的一根杆状结构，若将此比喻扩展至三维空间则更为直观。图1还强调了切割操作的重要性：切割过程中精度更高可获得更具揭示性的拓扑结构数据（图1，左上），而切割过程中被“压碎”的切片则效果较差（图1，右上）。
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讨论
横截面表面制备是本实验方案中最关键的步骤。为了保持精细结构，脱水后的样品必须始终保存在100%乙醇中，直至进入临界点干燥步骤。因此，为获得用于电子显微镜观察的表面，样品切片操作必须在浅皿中的乙醇浸没条件下进行。此外，在后续操作中，必须避免触碰或探压暴露的表面。该技术应用于其他组织类型以进行类似的基质观察时，预计无需进行重大修改，尽管无论样品来源如何，实验方案中的扫描电镜部分都可能需要进行基本的电子显微镜故障排查。从纤维性样品获取的图像容易因电荷散逸不良而引入伪影（"荷电"）。通常可通过降低加速电压、提高扫描速度（也称为停留时间）以及减小电子束斑尺寸来最小化荷电问题。将多次快速扫描图像进行叠加，可在避免电荷伪影的同时，获得与较慢、高分辨率的单次扫描图像相当的信噪比图像质量。
该技术本质上是定性的，因此在结合定量测量（例如，Masson 三色染色或苦味酸-天狼星红染色、羟脯氨酸含量测定、质谱分析和 RNA 测序）时具有互补价值，可用于判断所观察到的结构差异可能如何与不同的发育阶段或疾病状态相关联。然而，尽管存在这一局限性，该方法的意义远不止于心脏纤维化.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、心肺血液研究所（NIHLB）资助：K01-HL-121045、K08-HL-094703、5T32HL007411-35、P20 HL101425、U01 HL100398。
成像和组织处理（经氢氧化钠消化后）由范德比尔特大学医学中心（VUMC）细胞成像共享资源中心（CISR）完成（该中心由美国国立卫生研究院资助项目 CA68485、DK20593、DK58404、DK59637 和 EY08126 支持）。我们特别感谢范德比尔特大学医学中心细胞成像共享资源中心的核心负责人 Sam Wells 博士和 W. Gray (Jay) Jerome 博士，他们提供了宝贵的技术建议，并为拍摄本文所强调的技术方法提供了核心实验空间和资源。
我们谨向范德堡大学转化与临床研究心脏病学核心实验室的Yan Ru Su博士和Kelsey Tomasek女士致以最诚挚的谢意，感谢她们为本研究提供了专业技术支持并收集了所使用的人体组织样本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钙 | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| 碳导电胶 | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| 碳导电胶片 | Electron Microscopy Sciences | 77825 | 按样品台尺寸订购 |
| 双刃不锈钢剃须刀片 | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/包 |
| 乙醇 | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| 戊二醛，50% 溶液 | Electron Microscopy Sciences | 16310 | 电镜级，蒸馏提纯 |
| 盐酸 | Electron Microscopy Sciences | 16760 或 16770 | 100 ml |
| 磷酸二氢钠 NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| 银导电胶 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| 单宁酸，5% 水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| 三水合二甲胂酸钠 | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| 金-钯合金或金靶材 | Refining Systems, Inc. | 视情况而定 | 根据溅射镀膜仪的具体型号确定 |
| 临界点干燥仪 | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| 普通木质涂药棒 | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 环境扫描电镜 | FEI | Q250 SEM | |
| 溅射镀膜仪 | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| 铝制 SEM 样品台 | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | 与显微镜型号匹配 |
参考文献
- Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
- Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M.
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