扫描浸软组织的电子显微镜可视化的细胞外基质

摘要

这里显示的是一种可视化脱细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。

摘要

纤维化是所有形式心脏病的一个组成部分，无论病因如何，虽然在心脏基质生物学领域已经取得了很大进展，但在基质如何形成、生理和病理重塑如何不同，以及最重要的是如何纵基质动力学以促进愈合和抑制纤维化方面仍然存在重大差距。目前没有控制、预防或逆转心脏纤维化的治疗选择。部分原因可能是心脏瘢痕形成的复杂性，例如心肌梗死后发生的心肌瘢痕形成会立即替换死亡或垂死的心肌细胞。细胞外基质本身通过激活驻留细胞以及帮助引导浸润细胞至已失效的病灶来参与重塑。该基质也是基质细胞蛋白的某种储存库，这些蛋白质对正常基质更新以及纤维化信号传导至关重要。该基质还被证明在心脏组织中起机电作用。大多数评估纤维化的技术本质上不是定性的，而是提供定量结果，这些结果可用于比较两组，但不提供与底层基质结构相关的信息。这里重点介绍的一种可视化心脏基质超微结构的技术。脱细胞心脏组织的扫描电子显微镜揭示了结构的显着差异，否则使用传统的定量研究方法可能会遗漏这些差异。

引言

纤维化破坏了正常的心肌胶原网络，这对心肌细胞的正常机制功能 ^1,2 以及细胞间通讯、细胞内信号传导和细胞存活 ³ 至关重要。纤维化的发展是心脏功能的主要决定因素，由各种病因引起的心脏间质纤维化重塑导致左心室僵硬和舒张功能障碍增加 ⁴。心肌纤维化也可能导致心律失常，无论纤维化重塑的进展是一般现象还是局部现象，它与缺血性和非缺血性心肌病患者的不良预后高度相关 ⁵。同样，没有心肌纤维化是心室功能恢复和长期生存率的有力预测指标 ⁶。

纤维化的标志是过量胶原蛋白的沉积，胶原蛋白具有钢 ⁷ 的抗拉强度，可在多个层面上对心肌细胞功能产生不利影响。过多的胶原基质产生的机械力可导致心肌细胞萎缩 ^8,9、被动组织僵硬 ¹⁰、强直性收缩诱导的心肌僵硬 ^11-13，以及向剩余心肌细胞群输送氧气的减少。心肌细胞和 myoFbs 的间隙连接偶联也会损害心脏的电特性，从而为心律失常的发展带来更大的风险 ^14-16。血管周围纤维化会改变壁内冠状动脉和小动脉的血管舒缩反应性 ¹⁷，并导致管腔狭窄，从而减少氧气供应，从而减少心肌细胞的存活 ^17-22。致病性纤维化和电重构，源自缺血性损伤或能量失衡的初始部位，不可避免地发展为心力衰竭。

心肌细胞坏死引发纤维化反应，随后的不良纤维化重塑可能发生，与病因无关。寻找一种控制心脏纤维化的方法对治疗缺血性和特发性心肌病、高血压性心脏病、肥厚型心肌病、瓣膜性心脏病和肌营养不良蛋白病具有临床益处 ^23-42。无论纤维化疾病过程如何开始，可溶的促纤维化因子都可以穿过间质间隙，并在远离初始纤维化瘢痕的部位引起间质和外膜成纤维细胞的激活，从而产生级联效应，最终导致心力衰竭。最佳方案是使用靶向治疗来利用原纤维生成过程，该治疗可在心肌病的代偿性肥厚阶段应用，然后再发展为收缩泵衰竭、舒张性心力衰竭或其他终末期结果。最终目标是逆转纤维化，以便可以替代死亡的心肌细胞并完全恢复心脏功能。

基质的重要性已被广泛理解，但研究基质的方法主要限于主要结构成分（特别是胶原蛋白）的定量测量，以及不同基质和基质细胞蛋白的相对水平。该协议强调了一种很少使用的技术，该技术可用于评估心脏基质中的定性差异。该技术最近用于比较和对比来自不同心脏病病因（在人类外植体中）的心脏基质的根本差异，检查用神经调节蛋白-1β 的神经胶质生长因子 （GGF） 亚型处理的梗死后猪的心脏，相对于未处理的动物 ⁴³，并探测来自 mdx 的心脏组织基质的差异不同年龄的小鼠（杜氏肌营养不良症的常用动物模型）并与野生型对照进行比较。这项技术最早是由 Caulfield 和 Borg 博士于 1979 年 ⁴⁴ 引入的，但此后很少有研究采用这种强大的技术 ^45-47，在这里重新引入，只需稍作修改。这种方法是一种有价值的研究工具，因为它提供了有关细胞外基质超微结构的定性信息，否则在仅测量基质成分含量和/或纤维化水平时可能会被忽略。

方案

伦理声明:动物处理的协议是由范德比尔特机构动物护理和使用委员会（IACUC批准，根据AAALAC -国际标准协议数M / 10/117（猪）和M / 10/219（小鼠）和进行。开户人的心脏组织的使用是经范德比尔特大学医学中心IRB（协议号为100887）。

1.样品采集和存储

1. 使在0.1M磷酸盐缓冲液（PB）的溶液新鲜的4％戊二醛。
   注意:戊二醛是有毒的，戴手套和工作在通风橱。
   1. 使用21.8克Na ₂ HPO ₄和6.4克的NaH ₂ PO _4。 量子SATIS（QS）的PB，pH为7.4的0.2M的原液达1,000ml卫生署₂ O.
   2. 加入400微升50％戊二醛的2.5毫升PB原液和2.1毫升卫生署₂ O.
2. 沉浸在一个块（不大于2 C米^2）的组织的成4％的戊二醛溶液中。注意:小片也可以使用，但应具有足够的尺寸（不小于5 ^平方毫米），以容易地通过眼睛，以便于以后的协议的步骤可视化的。
3. 在室温下孵育1小时，然后在4℃下无限期地存储。

2.心脏组织的脱细胞

1. 使用10克NaOH粒料/100毫升卫生署₂ O.新鲜的10％NaOH水溶液
   注意:NaOH溶液具有腐蚀性，可引起碱烧伤，戴手套。
2. 冲洗组织在卫生署₂ O.
3. 在室温下6孵育在10％NaOH溶液 - 10天（直至从红褐色组织变为灰白色或白色）。
4. 在冲洗卫生署₂ O，直到组织变得透明。
5. 浸泡在1％的单宁酸的组织，在室温下4小时。使用每4毫升卫生署₂ O.1毫升5％原液
   注意:单宁酸强烈的刺激性，戴手套。
6. 在冲洗卫生署₂ O过夜。

3. Osmication和心脏组织脱水（在通风橱安全）

1. 使用21.4克二甲胂酸钠10.0g二氯化钙和450毫升卫生署₂ O的二甲胂酸钠缓冲液中的0.2M的原液混合，然后根据需要将pH调节至7.4 QS添加盐酸。到500毫升的dh ₂ O
   注意:二甲胂酸钠和盐酸是有毒的，戴手套，工作在通风橱中。
2. 使在通风橱安全四氧化锇的2％水溶液原液通过在50毫升的dh ₂ O1克四氧化锇晶体溶解
   注意:四氧化锇是一个重度吸入性危害;粘膜或眼球蒸汽固定是可能的，因此，只有在带着手套通风柜处理。推荐使用防溅板。
3. 在冲洗0.1M的二甲胂酸钠缓冲组织（1混合原液:1与卫生署 _{2 O）对转子5分钟（或轻柔搅拌）。}
4. 重复先前的步骤两次，总共三个缓冲器漂洗。
5. 浸泡在1％的四氧化锇组织在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（混合二甲胂库存钠和库存的四氧化锇1:1）上旋转1小时。
6. 冲洗组织在0.1M二甲胂酸钠缓冲液3次，每次在旋转器5分钟。
7. 使用的乙醇浓度增加（30％，50％，75％，85％，95％，最后100％）对转子每15分钟冲洗组织。

4.截面表面准备SEM

1. 在100％乙醇转移组织以一个浅培养皿还含有100％的乙醇。
2. 容纳两个非常尖锐的刀片，使得双方的单位都与彼此和切削刃交叉接触，以形成检体上方的等边三角形的两个方面。要做到这一点，用左手放置一个刀片对样品的最右侧，切向左。在同一时间，用右手放置在第二刀片上最左边的向右样品和切片。因此，刀片会互相从相反的方向滑动，以一个单一的顺利晋级。
3. 滑动平刃双方对对方做出最小失真或撕裂力的标本非常干净的切割，最好露出尽可能大的表面积尽可能不破坏样品。
4. 重复每个标本暴露清洁的横截面表面在扫描电镜检查。

心脏组织5.临界点干燥（CPD）

1. 用刮刀或镊子组织转移到临界点干燥器（CPD）的样品架，以确保组织在任何时候都保持在100％的乙醇。确保该支架被浸入在乙醇中，该传送与暴露于空气中不超过几秒钟的组织来实现。
2. 每个操作CPD我们呃手册完成3吹扫和填充循环用液体二氧化碳来代替乙醇。
3. 操作每个用户的手册CPD实现样品的临界点干燥，并将它们与_二氧化碳的控制排气返回到大气压力_。

6.安装心脏组织样本进行扫描电镜

1. 制备的SEM样品存根为每个试样，通过粘附碳粘合剂标签，所述铝存根的顶表面。
2. 用立体显微镜的帮助下，小心地附着试样到与感兴趣的横截面表面的粘合剂标签朝上（从标签中，可见的距离），并与样品存根表面的平面尽可能接近平行。不要探头或触摸的感兴趣的表面。
3. 打破木制涂药棒，实现了锥形刷，非常适合涂料应用。在基座和试样的两侧施加银或碳涂料，以提高粘附到存根。
4. 延伸的非常薄的银或碳的线画到感兴趣的表面的边缘，以提供从感兴趣的地面表面的电荷的路径。
5. 应用银或碳涂料的2或3小的dAb围绕碳片的周边，以提供从碳片表面到金属短截线的导电路径，从而接地。
6. 允许导电性涂料干燥两小时。
7. 操作每个用户的手册溅射镀膜机施加相对重的涂层（30目标范围 - 40纳米）金 - 钯合金或金。泵样品室约0.1毫巴;设置定时器为40秒。打开设置阀8:00位置（中等氩气流量）。按Start开始溅射镀膜在30毫安。紫色辉光放电应在试样腔室是可见的。

7.心脏组织样本的扫描电镜检查

1. 执行在相对低的加速电压的扫描电子显微镜，以减少成像p与样品中电荷耗散不良有关roblems（充电）。建议初始成像条件是:5千伏加速电压10毫米的工作距离。
2. 用一个有经验的操作者的协助下，雇用增加的工作距离，以在需要用于在z方向相当长延伸的多个焦平面纤维，或纤维的焦点成像条件延伸景深。
   1. 对于这里使用的显微镜（见材料表 ），在用户界面访问在右上角导航选项卡。
   2. 从舞台菜单进入坐标标签。以增加的工作距离，以毫米为在Z输入一个较大的值的坐标，然后就转到点击到标签到样品台移动到输入工作距离。
3. 用一个有经验的操作者的协助下，采用试样倾斜和旋转到兴趣正交的表面定位到电子束。的10至30 DEGR附加倾斜EES从该位置可以改进基体结构的观察和记录。
   1. 对于这里使用的显微镜（见材料表 ），在用户界面中，单击并按住鼠标右键，然后向左或向右滑动关注感兴趣的准备好的表面平面的外围附近的样本，并指出聚焦工作距离。
   2. 与手动用户界面摇杆导航到附近的表面和重复焦点的相对边缘移动。如果工作距离不近似等于所述第一位置，倾斜检体来实现在使用Stage菜单的坐标标签（7.2），并进入在T的倾斜坐标值两个位置近似一致。
   3. 旋转样品九十度（输入值成R坐标场）和直至所有的位置都集中在大致相同的工作距离重复上述过程。
      注意:可变压力SEM可以用于改善电荷耗散如果可供使用的话。高真空是用于扫描电子显微镜的标准操作模式。

结果

突出显示的技术应用于心脏组织从一个未使用的人体心脏移植供体（ 图1），从移植，从野生型和营养不良的小鼠（ 图3）的心外植组织和从猪心肌梗死后心脏的样品中心脏损伤模型（ 图2）。 如图1所示，人的心脏基质的横截面中观察时显示一个蜂巢状图案的交联蛋白质的一种复杂的编织。每个'蜂窝'结构是约40微米宽，通常绕过单个肌细胞，考虑图1中的平面图时，当由闰盘相连，几个心肌可以为杆通过"隧道"当隐喻纵向运行设想延伸到立体感。 图1还亮点在切割过程中比在切割过程（ 图1，右上）中被"打碎"节中的重要性，以更高的精度得到更多启示地形数据（ 图1，左上）。

驻地心肌细胞，血管，和之前的SEM处理循环细胞的...

讨论

横截面表面处理是协议中最关键的一步。为了保持精细结构，脱水标本必须在任何时候都保持在100％的乙醇，直到引入到临界点干燥工序。因此样品的切片，以实现EM检查表面必须同时标本在乙醇浸没在浅盘来完成。它也是至关重要的暴露表面不触及或后续处理期间探测。任何重大修改，预计在这一技术到其他组织类型相似矩阵的观测应用程序，不过协议的SEM部分可能需要基本的电子显微镜故障排除任何样本来源。从纤维样品采集到的图像易于由电荷差耗散（"充电"）介绍了伪像。充电的问题通常可以通过降低加速电压，增加扫描速度（也称为停留时间被最小化）和减小电子束的斑点尺寸。收集几个扫描积分的速度不够快，以避免电荷的工件将产生可比较的信号噪声质量的图像，而不存在于较慢，更高质量的单个扫描图像的电荷工件。

这种技术是固有的定性，因此当沿着定量测量（ 例如 ，Masson三色或picoserius红染色，羟脯氨酸含量，质谱和RNA测序测量），以确定可视结构差异如何可以与各种发育或疾病状态被认为补充。然而，尽管有这种限制，该方法是超出心脏纤维化特别显著，由于细胞外基质在体内几乎每个器官的一个基本组成部分。在心脏，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钙	电子显微镜科学	12340	100 克
碳胶粘剂	电子显微镜科学	12664	30 克
碳胶粘剂片	电子显微镜科学	77825	订购以适合短管
双刃剃须刀片 不锈钢	Ted Pella， Inc	121-6	250/包
	电子显微镜科学	15055	450 毫升
戊二醛，50% 溶液	电子显微镜科学	16310	EM 级，蒸馏纯化
盐酸	显微镜科学	16760 或 16770	100 毫升
磷酸钠 NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 克
锇四氧化四醇	电子显微镜科学	19100	1 g
银导电胶	电子显微镜科学	12686-15	15 g
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
磷酸氢二钠 （Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
单宁酸，5%水性	电子显微镜科学	21702-5	500 毫升
三水合物二甲胂酸钠	电子显微镜科学	12300	100 克
金钯合金或金	精炼系统公司	因	溅射镀膜机品牌和型号而异
临界点干燥机	电子显微镜 科学	850
普通木制涂抹器	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 环境 SEM	FEI	Q250 SEM
射镀膜机	Cressington Scientific Instruments Ltd.	108
型 Alluminum SEM 样品存根	Electron Microscopy Sciences	75220-12	专用于 miscroscope