Method Article

使用多色荧光检测液滴微流控光纤

DOI:

10.3791/54010

⸱

May 5th, 2016

 ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

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液滴微流控中的多色荧光检测通常涉及笨重而复杂的落射荧光显微镜检测系统。在这里，我们描述了一种紧凑的模块化多色检测方案，该方案利用光纤阵列对单个光电探测器收集的多色数据进行时间编码。

Abstract

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荧光检测是液滴微流体中最常用的读数，因为它们信号明亮且响应快。多重检测、酶进化和分子生物学增强细胞分选等应用需要检测两种或多种颜色的荧光。将自由空间激光器与落射荧光显微镜耦合的标准多色检测系统体积庞大、价格昂贵且难以维护。在本文中，我们描述了一种通过用耦合到光纤的激光器激发微流体通道的离散区域来执行多色检测的方案。发射光由耦合到单个光电探测器的光纤收集。由于激发发生在不同的空间位置，因此发射光的身份可以编码为时间偏移，无需更复杂的光过滤方案。该系统已用于检测含有四种独特染料组合的液滴群，并检测荧光素的亚纳摩尔浓度。

Introduction

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液滴的微流体通过在大量悬浮在载体油1水性液滴的compartmentalizing实验提供用于高通量生物学的平台。液滴已被用于应用程序作为不同的单细胞分析2中 ，数字聚合酶链反应（PCR）3，和酶进化4。荧光测定法检测的液滴的微流体的标准模式下，作为其亮信号和快速响应时间与在千赫速率检测子纳升液滴体积兼容。许多应用需要荧光检测用于同时至少两种颜色。例如，我们的实验室通常进行的PCR活化使用一个检测信道为一个化验结果液滴排序的实验中，并使用二次背景染料，使测定阴性液滴可数5。

液滴微流体典型检测站BAsed的上表面荧光显微镜，并需要复杂的光操作计划，以从自由空间激光引入激励光成显微镜被聚焦在样品上。荧光从液滴射出后，所发射的荧光的光进行滤波，使得每个检测信道利用中心波长频带设为一光电倍增管（PMT）。落射荧光显微镜基于光学检测系统，由于其费用，复杂性提供了一个进入门槛，并要求维修。光纤提供的装置构造的简化和健壮检测方案，由于纤维可以手动插入微流体装置，除去基于镜面光路由的需要，并且允许光路用光纤连接器相连接。

在本文中，我们描述了一个紧凑的模块化方案的组装和验证，利用光纤的阵列进行多色荧光检测DA单光电探测器6。光纤被耦合到单独的激光和被插入垂直于一个L形的流动通道以规则的空间偏移。的荧光收集....

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Protocol

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1. SU8主制造

  1. 设计使用设计软件三层制造微流体结构并通过在电路板胶片供应商与10微米的分辨率打印的设计。装置设计的细节都在所附的参考6给出的信道的几何形状在图1所示的层应包括对准标记，以帮助从每个制造层8并置的功能。
  2. 放置在旋涂机的预清洗3英寸直径的硅晶片，并开启真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm，然后在30秒在1750转，提供80μm的层厚度。
  3. 取出晶片并在135℃加热板上烘烤30分钟。允许在移动到下一步骤之前，晶片冷却至室温。
  4. 暴露涂覆的晶片到1层面具下的准直190米W，365纳米LED 3分钟。曝光后，放置在一个135℃热板上的晶片1分钟，然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  5. 放置在旋涂机在晶片和打开真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm，然后在30秒以5,000rpm，导致提供的40微米的附加厚度的层。
  6. 移动到下一步骤之前，取出晶片并烘烤上的135℃热板上进行30分钟，然后冷却至室温。
  7. 对准第二层掩模上在1.3图案化的几何形状和涂布的晶片暴露于准直的190毫瓦，365纳米LED 3分钟。曝光后，放置在135℃的热板4分30秒，然后冷却至RT在进行下一步骤之前。

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Results

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一个PDMS设备，其允许光纤的插入的制造需要多步光刻过程，以创建不同的高度（ 图1）的信道。首先，SU-8的80微米高的层被旋涂到硅晶片并使用掩模来创建流体处理几何图案。接着，附加40微米层的SU-8的旋涂在晶片上，并使用第二掩模来创建功能，将形成120微米高的激光光纤插入通道图案化。最后，100微米以上的SU-8旋涂在晶片上，并形成图案，得到220微米高的检测纤维插入通道。主开发和用于模塑PDMS设备，其反过来结合到载玻片。最终制造包含80微米高的流动几何形状，通过在该装置和120微米和220微米高的光纤信道通过的侧访问的顶部冲孔访问设备。

用于检测的装置的几何形状被示出在图2中。外部生成的80微米的乳剂被重新注入一滴回灌端口和它们流入L形检测信道之前通过垫片油隔开。两个激光耦合光纤插入120μm的高大通道在该流道的离散空间位置提供激励。因为插入这些通道中的多模光纤具有125μm的外.......

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Discussion

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光纤检测需要的光纤相对于流体通道的取向。因为我们的器件利用具有多层光刻制造导槽，以相对于彼此的掩模放置是非常重要的。如果光纤导槽太靠近流体通道，对于流体泄漏的可能性;如果导向通道位于太远或错位，由检测纤维收集的荧光信号可以显著减少。适当的对准可以通过设计对准标记，例如同心圆入口罩相片图案形成过程中共同定位来辅助。此外，光纤的手动插入装置是具有打破装置内的纤维的前端，使它们不可用的潜在一个微妙的过程。抑制针对键合到PDMS设备载玻片纤维并缓慢插入纤维，同时用显微镜观察被键SUCCessful纤维插入。预形成的乳液的最后，再注入应该以最小的处理发生。理想地，一旦该乳液是由和直接沉积到一个空的注射器，它不应该被传送，直到它被用于液滴回注。

多色检测要求在信号双峰的峰值是不同于彼此和从连续液滴的信号不会重叠。我们在这里使用的检测设置使用的一对125微米处的中心到中心的距离为300微米的分离光纤，激发区域之间提供〜175微米的非照射区域。这使得一个80微米的液滴，以仅由一个光源在一个时间被激发并确保每个在一个双峰的峰完全是一种类型的激光激发的结果。设计中的激发区域之间的间隔是类似于液滴直径给.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了 DARPA 资助号 84389.01.44908、NSF CAREER 奖 （DBI-1253293）、NIH 探索性/发展研究资助 （CA195709） 和 NIH 新创新者奖 （HD080351，DP2-AR068129-01） 的支持，以及来自 UCSF 资源分配计划的新方向资助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
光掩模CadArt 服务
3英寸硅片，P型，原始测试级大学晶圆447
SU-8 3035MicrochemY311074
SU-8 2050MicrochemY111072
Sylgard 184 有机硅弹性体套件Krayden4019862
1 ml 注射器BD
10 ml 注射器BD309604
27 个球针BD305109
PE 2 聚乙烯管Scientific Commodities， Inc.B31695-PE/2
Novec 7500Fisher Scientific98-0212-2928-5通常称为 HFE 7500
离子 Krytox 表面活性剂参考文献 #10 中的合成说明 葡
聚糖偶联级联蓝染料Life TechnologiesD-1976
荧光素钠盐Sigma28803
四带通滤光片SemrockFF01-446/510/581/703-25
PMTThorlabsPMM02
光纤端口ThorlabsPAFA-X-4-A
镜管ThorlabsSM1L05
带 200 μ 的跳线;M 核心 / 225 μm 包层光纤，带一个剥皮端和一个 FC/PC 连接器Thorlabs定制
跳线，带 105 μM 芯 / 125 μm 包层光纤，带有一个剥皮端和一个 FC/PC 连接器ThorlabsCustom
125 μm 纤维剥线工具ThorlabsT08S13
225 μm 光纤剥线工具ThorlabsT10S13
激光光纤适配器OptoEngineFC/PC 适配器
405 nm CW 激光器 50 mWOptoEngineMDL-III-405分配器，用于 CNI 激光器
473 nm CW 激光器，50 mW光引擎MLL-FN-473-50
309628

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, ....

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Droplet MicrofluidicsFluorescence DetectionOptical FibersMulticolor DetectionLaser ExcitationPhotodetector SystemMicrofluidic ChipFiber CouplingFluorescein DetectionHydrophobic Channels

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