体外 设计了用于检测从成年小鼠胰腺分离的前体细胞自我更新和分化能力的克隆形成实验。在这些实验中，胰腺前体细胞在含有甲基纤维素的半固体培养基中以三维形式形成细胞克隆。本文描述了单细胞操作及单个克隆表征的实验方案。
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方法文章
体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
来自成年胰腺的干细胞和祖细胞可能是治疗1型糖尿病患者的一种潜在的治疗性类β细胞来源。然而，目前尚不清楚成年胰腺中是否存在干细胞和祖细胞。利用成年小鼠进行cre-lox谱系示踪的研究策略得出了相互矛盾的结果：一些研究支持β细胞可由导管产生——这正是推测成年胰腺祖细胞可能存在的部位；而另一些研究则否定了这一观点。然而，这些体内 cre-lox谱系示踪方法无法回答自我更新和多向分化能力这两个定义干细胞所必需的关键问题。为了初步弥补这一技术空白，我们设计了用于胰腺祖细胞的三维克隆形成实验。在我们首次发表该方法后不久，其他实验室独立开发出一种类似但并不完全相同的方法，称为类器官实验。与类器官实验相比，我们的方法采用甲基纤维素，其可形成黏性溶液，从而允许在较低浓度下添加细胞外基质蛋白。含甲基纤维素的实验体系更便于在单细胞水平上检测和分析祖细胞，这对于祖细胞仅占极小亚群的情况尤为重要——许多成年器官的干细胞正是如此。综合多个实验室的研究结果表明，从小鼠胰腺中分离出的类祖细胞可在体外实现自我更新和多向分化。本实验方案描述了两种基于甲基纤维素的克隆形成实验，用于鉴定小鼠胰腺祖细胞：一种含有商用的小鼠细胞外基质蛋白制剂，另一种则含有一种称为层粘连蛋白水凝胶的人工细胞外基质蛋白。本文展示的技术包括：1）成年小鼠胰腺的解离及CD133+Sox9/EGFP+导管细胞的分选；2）分选后细胞的单细胞操作；3）利用微流控qRT-PCR和整体免疫染色对单个克隆进行分析；以及4）将初级克隆解离为单细胞悬液，并重新接种至次级克隆实验中，以评估其自我更新或分化潜能。
引言
胰腺由三种主要细胞谱系组成：腺泡细胞分泌消化酶，导管细胞分泌黏蛋白以抵御病原体并将消化酶转运至肠道，内分泌细胞则分泌包括胰岛素和胰高血糖素在内的激素，以维持葡萄糖稳态。在胰腺的胚胎发育过程中，早期导管细胞是三向潜能祖细胞的来源，这些祖细胞能够分化为成年动物胰腺中的三种细胞谱系1,2。由于成体干细胞和祖细胞（如骨髓干细胞）已成功用于治疗多种疾病3，因此寻找存在于成体胰腺中的干细胞和祖细胞引起了广泛关注。如果能够实现对成体胰腺干细胞和祖细胞的分离与操控，这些细胞将有望用于治疗1型糖尿病等疾病，该病中胰岛素分泌细胞因自身免疫反应而被破坏。
在胚胎发育完成后，三潜能祖细胞是否仍存在于成年胰腺导管中，这一问题在科学界存在激烈争论。在此争议中，Inada 及其同事利用 体内 cre-lox 谱系示踪技术表明，用碳酸酐酶 II 作为标记的成年小鼠导管细胞能够产生全部三种胰腺谱系细胞4。然而，使用其他导管细胞标记物（如 HNF1b5 和 Sox92）的研究则得出结论：导管细胞并非成年小鼠中 β 细胞的主要来源。
几年前，我们提出，上述争议的原因可能是由于该领域缺乏 6,7，以及可用于测量自我更新和多向分化能力的适当分析工具——这两项是定义干细胞所必需的标准。该 体内 上述....
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方案
伦理声明：我们遵循广泛认可的伦理标准开展研究，以确保结果的质量和完整性。动物实验均按照经希望之城机构动物照护与使用委员会批准的方案进行。
1. 从成年小鼠胰腺制备单细胞悬液
注意：在先前的出版物中7,11，使用了 CD-1 或 B6 背景的小鼠；两种背景均得到相似的结果。在 CD-1 背景下构建了一种转基因小鼠品系（命名为 Sox9/EGFP），其增强型绿色荧光蛋白由 Sox9 基因位点驱动19,20。
- 使用气体 CO2 对 3 至 5 只成年小鼠实施安乐死，持续 1-2 分钟或直至呼吸停止。随后对每只小鼠进行颈椎脱位。
- 解剖并制备胰腺。
注意：应在安乐死后尽快对小鼠进行解剖。这一点至关重要，以避免因死后变化导致胰腺发生自消化。- 使用剪刀在小鼠腹壁中线处做一纵向切口，打开腹腔。找到脾脏，并用镊子轻轻提起。用剪刀剪断脾脏与胰腺脾叶之间的结缔组织。
- 对胰腺的十二指肠叶和胃叶重复上述操作。将胰腺组织置于含有冷的 Dulbecco 改良磷酸盐缓冲液（DPBS）、0.1% 牛血清白蛋白（BSA）以及青霉素和链霉素（P/S；该完整溶液指定为 PBS/BSA）的冰上培养皿中。
- 在解剖显微镜下使用尖头镊子去除胰腺周围的脂肪组织。
注意：此步骤对后续分离胰腺细胞的健康状态至关重要....
- 使用剪刀在小鼠腹壁中线处做一纵向切口，打开腹腔。找到脾脏，并用镊子轻轻提起。用剪刀剪断脾脏与胰腺脾叶之间的结缔组织。
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结果
可通过荧光激活细胞分选技术富集成年胰腺前体细胞（图1）。本研究中使用的Sox9/EGFP转基因小鼠品系最初由GENSAT脑图谱项目构建19，其中EGFP报告基因受控于一个细菌人工染色体，该染色体包含Sox9基因上游约75 kb和下游约150 kb的序列20。在这些小鼠中，EGFP能够高效且特异性地标记胰腺导管22。获取胰腺组织后，将其消化为单细胞悬液，并使用与生物素偶联的抗CD133抗体进行染色，随后用与STV-APC偶联的二抗进行染色。所得细胞通过流式细胞术结合适当的设门参数进行分析（图1）。采用不同设门参数获得的细胞可被分选并接种至含甲基纤维素的克隆形成实验中以评估克隆形成能力。既往研究表明，克隆形成能力仅存在于分选得到的CD133+Sox9/EGFP+导管细胞中7。
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讨论
此处所述的胰腺集落实验及单个集落分析，借鉴了过去几十年中在解析造血祖细胞生物学方面发挥重要作用的含甲基纤维素的造血集落实验。 23。在这些实验中（图5将解离的胰腺细胞接种至含有甲基纤维素的半固体培养基中，该培养基包含支持形成环状、致密状或内分泌/腺泡样克隆的适当生长因子和细胞外基质蛋白 7一种能够产生细胞克隆的单个前体细胞被称为PCFU。通过微流控qRT-PCR和整体免疫染色对单个克隆进行表征，可推断出起源PCFU的谱系潜能。研究发现，大多数成年小鼠PCFU具有三向分化潜能，能够分化为导管细胞、腺泡细胞和内分泌谱系细胞 体外 7,9虽然小鼠细胞外基质蛋白可促进三向潜能集落形成单位向导管系分化，但层粘连蛋白水凝胶能够支持高效的内分泌和腺泡细胞系分化 7,9. 为了评估 体外 PCFUs 的自我更新能力可通过将初次小鼠 ECM 集落形成实验中生长的环状或致密集落消化为单细胞悬液，并重新接种至二次小鼠 ECM 集落形成实验中进行验证 7研究发现，在小鼠ECM蛋白中，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢希望之城分析流式细胞术核心实验室的Lucy Brown和Alexander Spalla在细胞分选方面的协助。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01DK081587和R01DK099734（授予H.T.K.），U01DK089533（授予A.D.R.），以及美国国家科学基金会NSF-DMR-1206121和加州再生医学研究所RB5-07398（授予D.A.T.）。同时感谢加州理工学院Joseph J. Jacobs分子医学工程研究所对D.A.T.的支持，以及Oxnard基金会和Ella Fitzgerald基金会对H.T.K.的支持。
资助信息：本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）向 H.T.K. 提供的 R01DK081587 和 R01DK099734 基金、向 A.D.R. 提供的 U01DK089533 基金，以及美国国家科学基金会（NSF-DMR-1206121）和加州再生医学研究所（RB5-07398）向 D.A.T. 提供的资助支持。同时感谢加州理工学院 Joseph J. Jacobs 分子医学工程研究所向 D.A.T. 提供的支持，以及 Oxnard 基金会和 Ella Fitzgerald 基金会向 H.T.K. 提供的支持。本出版物所报告的研究包括在分析流式细胞术核心设施和光显微镜数字成像核心设施中完成的工作，这些设施由美国国立卫生研究院国家癌症研究所通过资助号 P30CA33572 ....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠细胞外基质蛋白（Matrigel） | Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖） | 354230 | 储存于 -20 °C |
| 层粘连蛋白水凝胶 | 由 David Tirrell（美国加利福尼亚州帕萨迪纳）提供 | -20 保存的储备液 °C | |
| 甲基纤维素 | Shinetsu Chemical（日本东京） | 1,500 厘泊（动力黏度单位，等于 15 g/cm/sec）（高黏度） | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 | Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯） | 21-031-CV | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco（美国纽约州格兰岛） | 15070-063 | |
| 50 ml 圆锥形瓶 | 康宁股份有限公司（Corning, NY, USA） | 352070 | |
| 100 mm × 20 mm 悬浮培养皿 | 康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市） | 430591 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | A8412 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco（美国纽约州格兰岛） | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem（德国达姆施塔特） | 260913 | |
| 胶原酶B | 罗氏（CH-4070，巴塞尔，瑞士） | 11088831001 | 储存于 -20 °C |
| 抗小鼠 CD16/32 | Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | 101310 | 低内毒素，无叠氮化物 |
| PE-Cy7 大鼠 IgG2a κ 同型对照 | Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | 400522 | |
| 大鼠IgG1 κ 同型对照 | eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | 13-4301-82 | |
| 抗CD133-生物素 | eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | 13-1331-82 | |
| 抗CD71-PE-Cy7 | Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | 113812 | |
| 链霉亲和素-别藻红蛋白 | Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | 405207 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆， 美国 | 3571 | -20 保存的储备液 °C |
| 抗黏蛋白1 | 赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 山羊抗叙利亚仓鼠 | 杰克逊免疫（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫） | 127-495-160 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基：F-12营养混合物 | Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯） | 10-092-CV | |
| 胎牛血清 | Tissure Culture Biologicals（美国加利福尼亚州长滩） | 101 | -20 保存的储备液 °C |
| Tris 乙二胺四乙酸 | TEKnova（美国加利福尼亚州霍利斯特） | T0221 | |
| RNeasy Micro 试剂盒 | Qiagen（荷兰芬洛） | 74004 | |
| QuantiTec 逆转录试剂盒 | Qiagen（荷兰芬洛） | 205310 | |
| CellsDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒 | Ambion/Invitrogen（美国纽约州格兰岛） | 11753-100 | |
| 多聚甲醛 | Santa Cruz Bio（美国加利福尼亚州圣克鲁斯） | SC-281692 | |
| 山羊血清 | 杰克逊免疫（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫） | 005-000-121 | 储存于 -20 °C |
| 驴血清 | 杰克逊免疫（West Grove, PA, USA） | 0017-000-121 | 储存于 -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | T9284 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | T-4799 | |
| 乙二胺四乙酸 | Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆， 美国 | 15575-020 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | 25200-056 | |
| 无菌水 | Gibco（美国纽约州格兰岛） | 15230-147 | 分子生物学级 |
| 巴斯德吸管 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm滤器网 | Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡） | 08-771-1 | |
| 70 μm 滤膜网格 | Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡） | 08-771-2 | |
| TC板 96孔悬浮 | Sarstedt | 83.3924（先前为83.1835） | |
| 1 cc 注射器 | Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖） | 309659 | |
| 10 cc 注射器 | Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖） | 301604 | |
| 48.48 动态阵列芯片 | Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山） | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 动态阵列样本 & 检测上样试剂盒 | Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山） | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems（美国纽约州格兰岛） | 4304437 | |
| 聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯 | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | P7949 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek（美国马萨诸塞州阿什兰） | P35G-1.5-14-C | 带玻璃底的35 mm培养皿 |
| 吹嘴/橡胶管 | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| 烟酰胺 | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | N0636 | -20 保存的储备液 °C |
| 血管内皮生长因子 | R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯） | 293-VE | -80 保存的储备液 °C |
| 激活素B | R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯） | 659-AB | 储存于 -80 °C |
| 艾塞那肽4 | Sigma（美国密苏里州圣路易斯） | E7144 | -20 保存的储备液 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯） | 3474-RS | 储存于 -80 °C |
| Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | 康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市） | 352054 | |
| PrecisionGlide 针头 18 G x1 1/2 | Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖） | 305196 | |
| PrecisionGlide 针头 16 G x 1 1/2 | Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖） | 305198 | |
| Costar 超低吸附表面 24 孔平底板 | 康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市） | 3473 | |
| Costar 96 孔黑色培养板 | 康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市） | 3603 | 平底、透明，带盖。 黑色聚苯乙烯TC处理的细胞培养微孔板 |
| 蔡司 LSM510 META NLO Axiovert 200M 倒置显微镜 | 卡尔蔡司股份公司（Carl Zeiss AG，德国奥伯科亨） | ||
| Biomark HD | Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山） | ||
| Aria 特殊订单研究产品细胞分选仪 | Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖） | ||
| PBS/BSA | 1× PBS 0.1% (wt/vol) BSA 青霉素-链霉素（49 单位/毫升青霉素，49 μg/ml 链霉素 | ||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1× PBS 0.1% (wt/vol) BSA 青霉素-链霉素（49 单位/毫升青霉素，49 μg/ml 链霉素 Dnase 1（每胰腺2,400单位/毫升） |
参考文献
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al.
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