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方法文章

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

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DOI：

10.3791/54016

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2016年6月10日

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1Diabetes and Metabolism Research Institute, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

体外 设计了用于检测从成年小鼠胰腺分离的前体细胞自我更新和分化能力的克隆形成实验。在这些实验中，胰腺前体细胞在含有甲基纤维素的半固体培养基中以三维形式形成细胞克隆。本文描述了单细胞操作及单个克隆表征的实验方案。

摘要

来自成年胰腺的干细胞和祖细胞可能是治疗1型糖尿病患者的一种潜在的治疗性类β细胞来源。然而，目前尚不清楚成年胰腺中是否存在干细胞和祖细胞。利用成年小鼠进行cre-lox谱系示踪的研究策略得出了相互矛盾的结果：一些研究支持β细胞可由导管产生——这正是推测成年胰腺祖细胞可能存在的部位；而另一些研究则否定了这一观点。然而，这些体内 cre-lox谱系示踪方法无法回答自我更新和多向分化能力这两个定义干细胞所必需的关键问题。为了初步弥补这一技术空白，我们设计了用于胰腺祖细胞的三维克隆形成实验。在我们首次发表该方法后不久，其他实验室独立开发出一种类似但并不完全相同的方法，称为类器官实验。与类器官实验相比，我们的方法采用甲基纤维素，其可形成黏性溶液，从而允许在较低浓度下添加细胞外基质蛋白。含甲基纤维素的实验体系更便于在单细胞水平上检测和分析祖细胞，这对于祖细胞仅占极小亚群的情况尤为重要——许多成年器官的干细胞正是如此。综合多个实验室的研究结果表明，从小鼠胰腺中分离出的类祖细胞可在体外实现自我更新和多向分化。本实验方案描述了两种基于甲基纤维素的克隆形成实验，用于鉴定小鼠胰腺祖细胞：一种含有商用的小鼠细胞外基质蛋白制剂，另一种则含有一种称为层粘连蛋白水凝胶的人工细胞外基质蛋白。本文展示的技术包括：1）成年小鼠胰腺的解离及CD133+Sox9/EGFP+导管细胞的分选；2）分选后细胞的单细胞操作；3）利用微流控qRT-PCR和整体免疫染色对单个克隆进行分析；以及4）将初级克隆解离为单细胞悬液，并重新接种至次级克隆实验中，以评估其自我更新或分化潜能。

引言

胰腺由三种主要细胞谱系组成：腺泡细胞分泌消化酶，导管细胞分泌黏蛋白以抵御病原体并将消化酶转运至肠道，内分泌细胞则分泌包括胰岛素和胰高血糖素在内的激素，以维持葡萄糖稳态。在胰腺的胚胎发育过程中，早期导管细胞是三向潜能祖细胞的来源，这些祖细胞能够分化为成年动物胰腺中的三种细胞谱系1,2。由于成体干细胞和祖细胞（如骨髓干细胞）已成功用于治疗多种疾病3，因此寻找存在于成体胰腺中的干细胞和祖细胞引起了广泛关注。如果能够实现对成体胰腺干细胞和祖细胞的分离与操控，这些细胞将有望用于治疗1型糖尿病等疾病，该病中胰岛素分泌细胞因自身免疫反应而被破坏。

在胚胎发育完成后，三潜能祖细胞是否仍存在于成年胰腺导管中，这一问题在科学界存在激烈争论。在此争议中，Inada 及其同事利用 体内 cre-lox 谱系示踪技术表明，用碳酸酐酶 II 作为标记的成年小鼠导管细胞能够产生全部三种胰腺谱系细胞4。然而，使用其他导管细胞标记物（如 HNF1b5 和 Sox92）的研究则得出结论：导管细胞并非成年小鼠中 β 细胞的主要来源。

几年前，我们提出，上述争议的原因可能是由于该领域缺乏 6,7，以及可用于测量自我更新和多向分化能力的适当分析工具——这两项是定义干细胞所必需的标准。该 体内 上述提到的 cre-lox 谱系示踪技术可在群体水平上提供祖细胞与子代细胞之间谱系关系的证据。然而，该谱系示踪技术在判断单个祖细胞是否具有自我更新能力并分化为多个谱系方面存在局限性。单细胞分析至关重要，因为若将多个具有不同谱系潜能的单能祖细胞合并分析，其总体结果可能表现出多谱系分化能力的假象。此外，干细胞通常仅占成体器官中的少数细胞群体，其活性可能被优势细胞群体所掩盖。因此，群体水平研究的阴性结果并不一定意味着干细胞的缺失。最后，目前的 cre-lox 谱系示踪技术尚无法用于评估自我更新能力。

为了填补胰腺前体细胞生物学领域的技术空白，研究人员设计了使用三维培养系统的克隆7-11或类器官12-15检测方法。我们实验室开发了两种针对胰腺前体细胞的克隆检测方法：一种包含商用的小鼠细胞外基质蛋白（ECM）制剂（见方法和设备表），另一种则包含层粘连蛋白水凝胶，即一种定义明确的人工ECM蛋白7-11。前体细胞被混合在含有甲基纤维素的半固体培养基中。甲基纤维素是一种由木浆纤维制备而成的生物学惰性且黏稠的物质，长期以来被常规用于造血克隆检测16。含甲基纤维素的半固体培养基限制了单个前体细胞的移动，从而防止其重新聚集；但该培养基又足够柔软，允许前体细胞在三维空间中生长并分化为细胞克隆。沿袭血液学领域的传统，能够产生细胞克隆的胰腺前体细胞被称为胰腺克隆形成单位（PCFU）。PCFU在含小鼠ECM的克隆检测体系中培养时，会形成囊状克隆，命名为"环状"克隆7。当在含小鼠ECM的培养体系中加入Wnt激动剂R-spondin1后，部分环状克隆会转变为"致密"克隆7。本文中，将这两种在小鼠ECM培养体系中生长的克隆统称为"环状/致密"克隆。当环状/致密克隆被解离为单细胞悬液，并重新接种至含有层粘连蛋白水凝胶的培养体系中时，会形成"内分泌/腺泡"克隆7。

通过单克隆分析发现，来自成年（2-4月龄）的大多数环状/致密型以及内分泌/腺泡型克隆 7,11 或幼龄（1周龄） 9 小鼠胰腺中表达全部三种谱系标志物。这表明大多数起源的PCFU具有三向分化潜能。在含小鼠细胞外基质的克隆形成实验中，成年小鼠PCFU在培养中表现出强大的自我更新能力，在11周内扩增约500,000倍。 7小鼠ECM优先支持导管细胞向导管系的分化，而非内分泌系和腺泡系；而在层粘连蛋白水凝胶存在的情况下，小鼠胰腺前体细胞集落形成单位（PCFUs）则更倾向于分化为内分泌细胞和腺泡细胞，向导管系的分化则相对减少。 7,9,11. 重要的是，胰岛素+胰高血糖素- 在层粘连蛋白水凝胶培养中生成单激素细胞，并在葡萄糖刺激下分泌胰岛素 体外 7,9，表明其功能上的成熟性。三谱系分化潜能 7,9 自我更新 11 通过单细胞显微操作确认单个PCFU的形成 即，每孔接种一个细胞以形成克隆。综上，这些结果表明，在出生后小鼠胰腺中存在具有三维培养活性的、能够自我更新且具有三向分化潜能的类祖细胞。

本文所述的小鼠PCFU检测方法源自先前为小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化而来的祖细胞设计的克隆形成实验17。该方案已在另一篇JoVE出版物中有详细记录18。用于成年小鼠PCFU的含小鼠细胞外基质（ECM）克隆形成实验所需的培养组分和技术，与用于mESC来源祖细胞的方法相同17,18。因此，本文不再重复这些内容，而将重点介绍以下操作步骤：1）成年小鼠胰腺的解离及CD133+Sox9/EGFP+导管细胞的分选，以富集成年小鼠中的PCFU7；2）分选后细胞的单细胞操作；3）利用微流控qRT-PCR和整体免疫染色进行单克隆分析；4）将克隆解离为单细胞悬液，并重新接种至含小鼠ECM或层粘连蛋白水凝胶的克隆形成实验体系中。

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方案

伦理声明：我们遵循广泛认可的伦理标准开展研究，以确保结果的质量和完整性。动物实验均按照经希望之城机构动物照护与使用委员会批准的方案进行。

1. 从成年小鼠胰腺制备单细胞悬液

注意：在先前的出版物中7,11，使用了 CD-1 或 B6 背景的小鼠；两种背景均得到相似的结果。在 CD-1 背景下构建了一种转基因小鼠品系（命名为 Sox9/EGFP），其增强型绿色荧光蛋白由 Sox9 基因位点驱动19,20。

  1. 使用气体 CO2 对 3 至 5 只成年小鼠实施安乐死，持续 1-2 分钟或直至呼吸停止。随后对每只小鼠进行颈椎脱位。
  2. 解剖并制备胰腺。
    注意：应在安乐死后尽快对小鼠进行解剖。这一点至关重要，以避免因死后变化导致胰腺发生自消化。
    1. 使用剪刀在小鼠腹壁中线处做一纵向切口，打开腹腔。找到脾脏，并用镊子轻轻提起。用剪刀剪断脾脏与胰腺脾叶之间的结缔组织。
      1. 对胰腺的十二指肠叶和胃叶重复上述操作。将胰腺组织置于含有冷的 Dulbecco 改良磷酸盐缓冲液（DPBS）、0.1% 牛血清白蛋白（BSA）以及青霉素和链霉素（P/S；该完整溶液指定为 PBS/BSA）的冰上培养皿中。
    2. 在解剖显微镜下使用尖头镊子去除胰腺周围的脂肪组织。
      注意：此步骤对后续分离胰腺细胞的健康状态至关重要。
      1. （可选）在荧光体视显微镜下使用 488-509 nm 激发光检测胰腺是否存在绿色荧光，以确认 EGFP 的表达。
    3. 在组织培养罩内，依次将组织在三个盛有 10 ml 冷 PBS/BSA 的 100 mm 培养皿中各清洗三次。
  3. 将组织切成小块。
    1. 将解剖后的胰腺转移至一个干燥无菌的培养皿中，尽可能去除 PBS/BSA 液体，然后将其转移到另一个置于冰上的干燥培养皿中。
    2. 通过向每 1 ml PBS/BSA 中加入 2 µl DNase I 储存液（100 万单位 [MU]/ml），配制含 DNase I 的 PBS/BSA 溶液。
      注意：该溶液记为 PBS/BSA/DNase I。建议一次性配制约 200 ml，足以满足一次分选实验的需求。
    3. 使用弹簧剪刀将胰腺剪碎 2-3 分钟，直至组织呈细小碎片状。向培养皿中的组织碎片中加入 2-3 ml 冷的 PBS/BSA/DNase I 溶液以悬浮组织。
    4. 用 10 ml 移液器将组织碎片转移至一个置于冰上的 50 ml 锥形管中。在尽可能回收全部组织后，用 PBS/BSA/DNase I 将总体积补至 10 ml。
  4. 将胰腺组织碎片消化为以单细胞为主的细胞悬液。
    1. 向组织碎片中加入胶原酶 B（100 mg/ml 储存液），用量为每 10 ml 加 350-450 µl，在 37 °C 水浴中孵育 8 分钟，每隔 3-4 分钟轻轻摇动一次。使用带有 16½ G 针头的 10 ml 注射器将组织溶液吸入，然后沿 50 ml 管内壁喷射冲洗。重复此操作七次。
      注意：施加足够力量以打散细胞团块，但应避免产生气泡，以免损伤细胞。
    2. 将管子重新放回 37 °C 水浴中继续孵育 8 分钟，每隔 3-4 分钟轻轻摇动混合一次。如上所述，用注射器反复吹打七次，取 10 µl 组织溶液滴加到干燥的培养皿中。在倒置的相差显微镜下使用 10X 物镜观察组织溶液，预期可见单个细胞及少量小细胞团块。
    3. 从此步骤开始，所有操作均需在冰上进行，以减缓或终止胶原酶的活性。用冷的 PBS/BSA/DNase I 将体积调整至 50 ml，在 4 °C 条件下以 400 x g 离心 5 分钟，并用 P1000 移液器将细胞重悬于 5 ml 冷的 PBS/BSA/DNase I 溶液中。
  5. 过滤获得单细胞悬液并洗涤。
    1. 先将细胞悬液通过 70 µm 尼龙网筛滤杯过滤，再通过 40 µm 尼龙网筛滤杯过滤。
    2. 用 5 ml 冷的 PBS/BSA/DNase I 重悬细胞，并进行细胞计数。
      注意：对于 2-4 月龄的 B6 或 CD-1 小鼠，每只胰腺分别可获得约 500 万或 1000 万个细胞。不同实验操作者之间结果可能存在差异。若计数时发现过多细胞碎片，可用冷的 PBS/BSA/DNase I 将体积补至 50 ml，在 4 °C 条件下以 400 x g 离心 5 分钟。
    3. 用冷的 PBS/BSA/DNase I 将细胞悬液调整至浓度为 2 x 107 个细胞/ml。

2. 分选细胞以富集胰腺集落形成祖细胞 

注意：对于B6小鼠，CD133+ 细胞（而非 CD133- 细胞）富集了胰腺集落形成单位（PCFUs）7,9,11。在应用所有设门参数后，CD133+ 细胞约占总解离胰腺细胞的13%11。对于CD-1小鼠，CD133+Sox9-EGFP+ 细胞通常占总胰腺细胞的约4%，该细胞群体富集了PCFUs7。本文描述了CD133+Sox9/EGFP+ 细胞的分选方法。

  1. 染色离解的胰腺细胞。
    1. 为减少非特异性结合，将胰腺单细胞悬液与抗小鼠 CD16/32 抗体在冰上孵育 5 分钟，终浓度为 10 µg/ml，进行封闭处理。
    2. 取一份 1 × 106 个细胞（50 µl），在冰上用同型对照抗体（生物素标记的大鼠 IgG1）染色 20 分钟，终浓度为 5 µg/ml，每 5–7 分钟轻柔涡旋混匀一次。
    3. 另取一份 1 × 106 个细胞（50 µl），置于冰上作为未染色对照。
    4. 将剩余细胞在冰上用生物素标记的抗小鼠 CD133 一抗染色 20 分钟，终浓度为 5 µg/ml，每 5–7 分钟轻柔涡旋混匀一次。
  2. 洗涤细胞。
    1. 向同型对照组和一抗染色样本中加入 PBS/BSA/DNase I 至终体积 1 ml，于 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，洗涤样本。重复此洗涤步骤一次。
    2. 将同型对照组和一抗染色样本重悬于 PBS/BSA/DNase I 中，调整至终浓度为 2 × 107 个细胞/ml。
  3. 用链霉亲和素（STV）标记的别藻蓝蛋白（APC）对同型对照组和一抗染色样本进行染色，终浓度为 2 µg/ml，在冰上孵育 15 分钟，每 5–7 分钟轻柔涡旋混匀一次。
  4. 洗涤细胞并进行 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。
    1. 参照步骤 2.2 的方法，用 PBS/BSA/DNase I 对同型对照组和一抗染色样本洗涤两次。然后将细胞重悬于含 DAPI 的 PBS/BSA/DNase I 中，DAPI 终浓度为 0.2 µg/ml。同型对照样本的终体积应为 0.5 ml。
      注意：确保一抗染色样本的终密度适合所用分选仪的要求。通常分选时使用 5 × 106 个细胞/ml 的浓度。
    2. 用 PBS/BSA/PS/DNase I 将未染色细胞调整至 0.5 ml。所有细胞在分选前需经 20 µm 滤膜过滤，并在冰上避光保存。
  5. 细胞分选。
    1. 分选时使用 80 µm 或更大孔径的喷嘴。
      注意：小鼠胰腺内分泌细胞易受物理应力影响。然而，研究表明小鼠胰腺集落形成单位（PCFUs）似乎不受流式分选过程中的剪切应力影响7。
    2. 在分选仪上获取细胞事件并设置分析参数。根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）面积设门，排除细胞碎片7；根据 FSC 和 SSC 宽度设门，排除双联体细胞；根据 DAPI+ 信号设门，排除死细胞7。根据同型对照细胞的信号值，设定 EGFP 和 CD133-APC 的设门参数（图 1）。
    3. 将分选出的细胞收集至含有 1.5 ml 添加 5% 胎牛血清（FCS）的 DMEM/F12 培养基的 5 ml 聚苯乙烯管中。将分选后的细胞群体于 400 × g 离心 5 分钟，弃上清后重悬于少量（约 200 µl）DMEM/F12 或含 5% FCS 的 PBS/BSA/DNase I 中。细胞使用前需保持在冰上。
  6. 计数从分选仪获得的 CD133+Sox9-EGFP+ 细胞数量。取 10 µl 细胞样本，使用血细胞计数板进行细胞计数，以确定细胞密度。
    注意：建议使用血细胞计数板，因为分选仪自带的计数功能往往不可靠。

3. 将分选后的细胞接种至含有小鼠ECM蛋白的克隆形成实验中 

注意：请参阅 JoVE 另一篇出版物中关于将细胞接种至含小鼠 ECM 的集落形成实验的详细方案18。 

  1. 准备培养基。
    1. 配制含有DMEM/F12培养基、1% (wt/v) 甲基纤维素、5% (v/v) 小鼠ECM蛋白、50% (v/v) 来自mESC分化胰腺样细胞的条件培养基、5% (v/v) 胎牛血清（FCS）、10 mmol/L 烟酰胺、10 ng/ml 人重组激活素B、0.1 nmol/L 艾塞那肽-4以及1 ng/ml 血管内皮生长因子-A的培养基。条件培养基的制备方法详见其他文献18。
    2. 若需促进致密集落形成，可在培养基中添加750 ng/ml的RSPO-1。
    3. 将含小鼠ECM蛋白的培养物在37 °C、5% CO2条件下孵育3周。

4. 将分选后的细胞以每孔1个细胞进行培养

注意：以下步骤适用于使用手控和口控移液管操作单个细胞。另一种方法是购买显微操作仪。典型的显微操作仪包括一台倒置显微镜和一个由操纵杆控制的电动载物台。

  1. 准备玻璃巴斯德移液管。
    1. 使用本生灯，将玻璃巴斯德移液管的尖端拉成细点（开口处约 30 µm）。玻璃巴斯德移液管应配有棉塞，以阻隔操作者呼出的气流。
    2. 将经火焰灭菌的玻璃巴斯德移液管在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟，以完成灭菌。
  2. 准备用于培养的 96 孔板。
    1. 根据先前描述的方案18，制备冷的半固体培养基。
    2. 使用 1 ml 注射器将培养基以每孔 100 µl 的量加入低吸附平底 96 孔板的内圈孔中。外圈孔加入无菌水以维持湿度。
    3. 将培养皿置于冰上，待用。
  3. 准备分选后的细胞。
    1. 将分选仪收集的约 6,000 个细胞加入 5 mL 聚苯乙烯管中，终体积为 2.5 mL，含 DMEM/F12/PS 培养基、10% FCS 和 1% 甲基纤维素。剧烈震荡以混匀组分。静置 5 分钟或待气泡完全上浮至管顶。此步骤无需在冰上操作。
    2. 使用带 18½ G 针头的 1 ml 注射器，将细胞悬液以每皿 1 ml 的量分装至两个 35 mm 培养皿中。
    3. 用手轻轻晃动培养皿，使细胞悬液均匀铺展。注意避免半固体培养基接触 35 mm 培养皿边缘，因为边缘处的单个细胞在倒置光学显微镜下无法清晰观察。
  4. 准备显微镜周围的工作区域。
    1. 配制不含细胞的 DMEM/F-12 培养基与 1% 甲基纤维素的混合溶液（“无细胞”培养基），并按照步骤 4.3.2 所述方法，使用注射器将该溶液以每皿 1 ml 的量分装至两个 35 mm 培养皿中。
    2. 用 70% 乙醇溶液清洁并擦拭倒置相差显微镜周围的工作区域。
  5. 组装移液管与吹嘴。
    1. 选取步骤 4.1 中已准备的无菌玻璃巴斯德移液管，将 1 ml 塑料移液管吸头的大端连接至玻璃巴斯德移液管顶部，将吸头的小端连接至一段薄壁橡胶管的一端，橡胶管另一端连接吹嘴。同一组细胞的多个细胞挑选应使用同一根玻璃移液管。
    2. 用嘴吸气，通过玻璃巴斯德移液管吸取少量（约 10 至 50 µl）步骤 4.4.1 中制备的"无细胞"半固体溶液。
      注意：半固体溶液在玻璃巴斯德移液管狭窄尖端处形成流动阻力，可作为屏障防止待挑选细胞被污染。
  6. 挑选单个细胞。
    1. 将含有分选细胞的 35 mm 培养皿置于显微镜载物台上，并移去皿盖。
    2. 使用 10X 物镜寻找细胞，并对准一个适合挑选的细胞进行调焦。
    3. 将移液管尖端开口置于目标细胞附近，通过吹嘴施加吸力。
      注意：细胞移动应缓慢，以避免在后续操作中丢失细胞。应能观察到细胞进入移液管尖端的过程。若流速过快，应更换为开口更窄的移液管。
  7. 将单个细胞接种至培养孔中。
    1. 当细胞进入移液管后，用舌头堵住吹嘴开口以阻断气流。在将移液管尖端从半固体培养基中撤出前稍作停顿，确保半固体培养基停止流动。
    2. 将移液管尖端插入步骤 4.2 中准备的 96 孔板的某一孔中，通过轻吹吹嘴缓慢将细胞推出。细胞接种后应标记该孔，以避免同一孔中接种两个细胞。
  8. 确认单个细胞已接种至培养孔中。
    1. 将移液管尖端插入步骤 4.4.1 中制备的“无细胞”培养基中。在显微镜下观察尖端开口处，推动剩余的半固体溶液排出。应无细胞从移液管尖端流出。
    2. 为再次确认，检查培养孔中单个细胞植入的位置。
  9. 将单个细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养，最长可培养 3 周。

5. 从半固体培养物中挑取单个菌落进行微流控qRT-PCR分析

注意：将分选后的 CD133+Sox9/EGFP+ 细胞接种至含小鼠细胞外基质（ECM）的克隆形成实验中三周后，会形成环状或致密型克隆7（图2）。当将环状/致密型克隆解离为单细胞悬液并重新接种至层粘连蛋白水凝胶培养体系中后，约一周内可生成内分泌/腺泡样克隆7（图2）。为确定每种克隆的谱系组成，采用微流控 qRT-PCR 分析检测谱系标志物的表达水平7。在预扩增步骤中，将一个克隆与含有 TaqMan 探针混合液、反应缓冲液和 SuperScript III 的主混合液混合21。随后使用 48.48 阵列芯片进行微流控 PCR 反应21。 

  1. 准备包含 48 种探针的预扩增 PCR 混合液。
    1. 用移液器吸取每种 TaqMan 探针（20x 原液）1.5 µl 至一个 1.5 ml 离心管中。加入 78 µl TE 缓冲液，使总体积调整至 150 µl。
  2. 按照制造商提供的方案21制备主混合液。
  3. 将 9 µl 主混合液加入每个适用于 PCR 的 0.2 ml 薄壁反应管中，并对最多 48 个反应管重复此步骤。
  4. 从半固体培养物中挑取单菌落。
    注意：环状/致密型菌落大于内分泌/腺泡样菌落，直径范围约为 ~50 至 400 µm9,11。因此，使用装有弯曲 10 µl 吸头的 P10 移液器挑取单个环状/致密型菌落。对于挑取较小的内分泌/腺泡样菌落（图 2），请参见步骤 4。
    1. 在高倍镜下（例如，20X 物镜）定位目标菌落，降低放大倍数后吸取菌落。（可选）在此步骤拍摄菌落的相差图像，以记录其可见特征。
    2. 将菌落转移至含有 9 µl 主混合液的 PCR 管中。
    3. 挑取下一个菌落。每次 PCR 运行最多可分析 45 个菌落，预留 3 个位置用于对照。
  5. 进行 RNA 提取及 cDNA 合成并进行预扩增。
    1. 在进行热循环反应前，剧烈涡旋混匀样品。
    2. 根据制造商说明书21进行热循环反应。环状/致密型菌落需 14 个循环，内分泌/腺泡样菌落需 16–20 个循环，单细胞需 22 个循环。
      注意：预扩增得到的 cDNA 可在微流控 PCR 分析前保存于 -20 °C。
  6. 根据制造商说明书21，使用微流控芯片进行后续 PCR 反应。

6. 类器官整体免疫染色

  1. 收获并固定克隆。
    1. 在显微镜下挑取菌落，步骤同4或5.4，并将其加入4%多聚甲醛溶液中。4 °C条件下轻轻振荡孵育过夜。
    2. 用1×PBS在室温下洗涤菌落两次，每次10–30分钟。将固定的菌落置于1.5 ml离心管中，用石蜡密封后于4 °C保存。
  2. 用抗体对菌落进行染色。
    1. 将菌落转移至含有 200 µl 封闭缓冲液（5% 驴和/或山羊血清，0.1% Triton X-100 溶于 1x PBS）的 96 孔黑色板（透明底）的一个孔中。在 4 °C 轻柔振荡孵育过夜。
    2. 将一抗稀释至预设浓度（例如，仓鼠抗Mucin 1抗体使用封闭缓冲液按1:500稀释。将菌落转移至含200 µl一抗的洁净孔中，4℃孵育过夜 在4 °C下轻柔振荡。用含0.1% Tween 20的PBS洗涤菌落3次。每次洗涤时，将菌落转移至新的孔中，加入200 µl 1× PBS/0.1% Tween 20，在室温下孵育10分钟。
    3. 将二抗稀释至预设浓度（例如，1:2,000 稀释的山羊抗 Armenian 仓鼠抗体）使用封闭缓冲液。避光保存。将菌落转移至含有 200 µl 二抗的洁净孔中，室温孵育 2 小时。按照步骤 6.2.2 的方法，用 PBS/0.1% Tween 20 洗涤菌落 3 次。
  3. 用DAPI对菌落进行复染，并使用共聚焦显微镜观察。
    1. 将菌落转移至含有300 nM DAPI的PBS孔中，在室温下孵育5分钟。
    2. 将经DAPI染色的菌落转移至35 mm玻璃底培养皿中用于观察。在菌落上方加盖盖玻片以防止蒸发。
    3. 使用共聚焦显微镜采集图像。为观察DAPI染色，采用730–950 nm的双光子激发波长。使用波长为458 nm的氩离子激光器激发发射波长为519 nm和561 nm的荧光染料。使用波长为633 nm的氦氖激光器激发发射波长为665 nm的荧光染料。

7. 将原代环状/致密集落解离并重新接种至次级集落检测

注意：所有操作均应在无菌条件下进行。在本实验过程中应尽可能避免细胞受到冷休克，例如将细胞置于冰上或用冷的 PBS/BSA 洗涤细胞，此类操作会降低重新接种细胞的存活率。 

  1. 配制溶液。
    1. 将洗涤缓冲液（DMEM/F12；P/S；0.1% BSA）置于 37 °C 水浴中预热。
    2. 将一块 96 孔板（平底，低吸附）放入 37 °C 培养箱中预热。向板中一个孔加入 100 µl 100% FCS，向第二个孔加入 100 µl 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
  2. 收集克隆。
    1. 使用 10 µl 吸头，按照步骤 5.4 的描述，挑取并汇集原代培养物中总共 20 个或更多的环状/致密克隆。
    2. 将克隆置于含有约 1,000 µl 温热（至少室温）洗涤缓冲液的 1.5 ml 离心管中，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  3. 使用胰蛋白酶将克隆解离为单细胞悬液。
    1. 将含有克隆的剩余液体（20 µl 或更少）转移至含有预热胰蛋白酶溶液的孔中（按步骤 7.1 预备）。
    2. 将培养板置于 37 °C 培养箱（非水浴）中孵育 1.5 分钟。取出培养板，反复吹打数次。再于 37 °C 孵育 1.5 分钟。
    3. 取出培养板，进一步上下吹打数次以打散克隆。在显微镜下检查克隆是否主要解离为单细胞悬液。避免对克隆过度消化。
  4. 加入 FCS 终止胰蛋白酶反应。
    1. 将 100 µl 预热的 FCS 加入含有细胞的孔中，上下吹打数次。将细胞转移至含有 1,000 µl 预热洗涤缓冲液的 1.5 ml 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
    2. 用预热缓冲液洗涤两次。
    3. 将细胞重悬于约 200 µl 缓冲液或培养基中。
  5. 使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。将细胞悬液置于室温保存。
  6. 将解离后的细胞重新接种至次级克隆形成实验中，培养基中含小鼠 ECM 蛋白（5% v/v）或层粘连蛋白水凝胶（100 µg/ml），并在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
    注：将细胞重新接种至含小鼠 ECM 蛋白的培养体系时，每孔接种 2,500–5,000 个细胞，培养 2–3 周；接种至层粘连蛋白水凝胶培养体系时，每孔接种 10,000–25,000 个细胞，培养 7–12 天。

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结果

可通过荧光激活细胞分选技术富集成年胰腺前体细胞（图1）。本研究中使用的Sox9/EGFP转基因小鼠品系最初由GENSAT脑图谱项目构建19，其中EGFP报告基因受控于一个细菌人工染色体，该染色体包含Sox9基因上游约75 kb和下游约150 kb的序列20。在这些小鼠中，EGFP能够高效且特异性地标记胰腺导管22。获取胰腺组织后，将其消化为单细胞悬液，并使用与生物素偶联的抗CD133抗体进行染色，随后用与STV-APC偶联的二抗进行染色。所得细胞通过流式细胞术结合适当的设门参数进行分析（图1）。采用不同设门参数获得的细胞可被分选并接种至含甲基纤维素的克隆形成实验中以评估克隆形成能力。既往研究表明，克隆形成能力仅存在于分选得到的CD133+Sox9/EGFP+导管细胞中7。

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讨论

此处所述的胰腺集落实验及单个集落分析，借鉴了过去几十年中在解析造血祖细胞生物学方面发挥重要作用的含甲基纤维素的造血集落实验。 23。在这些实验中（图5将解离的胰腺细胞接种至含有甲基纤维素的半固体培养基中，该培养基包含支持形成环状、致密状或内分泌/腺泡样克隆的适当生长因子和细胞外基质蛋白 7一种能够产生细胞克隆的单个前体细胞被称为PCFU。通过微流控qRT-PCR和整体免疫染色对单个克隆进行表征，可推断出起源PCFU的谱系潜能。研究发现，大多数成年小鼠PCFU具有三向分化潜能，能够分化为导管细胞、腺泡细胞和内分泌谱系细胞 体外 7,9虽然小鼠细胞外基质蛋白可促进三向潜能集落形成单位向导管系分化，但层粘连蛋白水凝胶能够支持高效的内分泌和腺泡细胞系分化 7,9. 为了评估 体外 PCFUs 的自我更新能力可通过将初次小鼠 ECM 集落形成实验中生长的环状或致密集落消化为单细胞悬液，并重新接种至二次小鼠 ECM 集落形成实验中进行验证 7研究发现，在小鼠ECM蛋白中，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢希望之城分析流式细胞术核心实验室的Lucy Brown和Alexander Spalla在细胞分选方面的协助。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01DK081587和R01DK099734（授予H.T.K.），U01DK089533（授予A.D.R.），以及美国国家科学基金会NSF-DMR-1206121和加州再生医学研究所RB5-07398（授予D.A.T.）。同时感谢加州理工学院Joseph J. Jacobs分子医学工程研究所对D.A.T.的支持，以及Oxnard基金会和Ella Fitzgerald基金会对H.T.K.的支持。

资助信息：本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）向 H.T.K. 提供的 R01DK081587 和 R01DK099734 基金、向 A.D.R. 提供的 U01DK089533 基金，以及美国国家科学基金会（NSF-DMR-1206121）和加州再生医学研究所（RB5-07398）向 D.A.T. 提供的资助支持。同时感谢加州理工学院 Joseph J. Jacobs 分子医学工程研究所向 D.A.T. 提供的支持，以及 Oxnard 基金会和 Ella Fitzgerald 基金会向 H.T.K. 提供的支持。本出版物所报告的研究包括在分析流式细胞术核心设施和光显微镜数字成像核心设施中完成的工作，这些设施由美国国立卫生研究院国家癌症研究所通过资助号 P30CA33572 提供支持。

研究资助方： 资助方未参与本研究的设计、数据收集、分析或解释。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠细胞外基质蛋白（Matrigel）Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）354230储存于 -20 °C
层粘连蛋白水凝胶由 David Tirrell（美国加利福尼亚州帕萨迪纳）提供-20 保存的储备液 °C
甲基纤维素Shinetsu Chemical（日本东京）1,500 厘泊（动力黏度单位，等于 15 g/cm/sec）（高黏度）
杜尔贝科磷酸盐缓冲液Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）21-031-CV
磷酸盐缓冲液Gibco（美国纽约州格兰岛）15070-063
50 ml 圆锥形瓶康宁股份有限公司（Corning, NY, USA）352070
100 mm × 20 mm 悬浮培养皿康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）430591
牛血清白蛋白Sigma（美国密苏里州圣路易斯）A8412
青霉素/链霉素Gibco（美国纽约州格兰岛）15070-063
DNase1Calbiochem（德国达姆施塔特）260913
胶原酶B罗氏（CH-4070，巴塞尔，瑞士）11088831001储存于 -20 °C
抗小鼠 CD16/32Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）101310低内毒素，无叠氮化物
PE-Cy7 大鼠 IgG2a κ 同型对照Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）400522
大鼠IgG1 κ 同型对照eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥）13-4301-82
抗CD133-生物素eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥）13-1331-82
抗CD71-PE-Cy7Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）113812
链霉亲和素-别藻红蛋白Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）405207
4',6-二脒基-2-苯基吲哚Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，  美国3571-20 保存的储备液 °C
抗黏蛋白1赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）HM-1630-P1
Dylight 649 山羊抗叙利亚仓鼠杰克逊免疫（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）127-495-160
杜尔贝科改良伊格尔培养基：F-12营养混合物Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）10-092-CV
胎牛血清Tissure Culture Biologicals（美国加利福尼亚州长滩）101-20 保存的储备液 °C
Tris 乙二胺四乙酸TEKnova（美国加利福尼亚州霍利斯特）T0221
RNeasy Micro 试剂盒Qiagen（荷兰芬洛）74004
QuantiTec 逆转录试剂盒Qiagen（荷兰芬洛）205310
CellsDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒Ambion/Invitrogen（美国纽约州格兰岛）11753-100
多聚甲醛Santa Cruz Bio（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）SC-281692
山羊血清杰克逊免疫（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）005-000-121储存于 -20 °C
驴血清杰克逊免疫（West Grove, PA, USA）0017-000-121储存于 -20 °C
Triton X-100Sigma（美国密苏里州圣路易斯）T9284
胰蛋白酶Sigma（美国密苏里州圣路易斯）T-4799
乙二胺四乙酸Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，  美国15575-020
胰蛋白酶-EDTALife Technologies（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）25200-056
无菌水Gibco（美国纽约州格兰岛）15230-147分子生物学级
巴斯德吸管Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)13-678-8B
40 μm滤器网Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）08-771-1
70 μm 滤膜网格Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）08-771-2
TC板 96孔悬浮Sarstedt83.3924（先前为83.1835）
1 cc 注射器Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）309659
10 cc 注射器Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）301604
48.48 动态阵列芯片Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山）BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 动态阵列样本 & 检测上样试剂盒Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山）85000800
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems（美国纽约州格兰岛）4304437
聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯Sigma（美国密苏里州圣路易斯）P7949
玻璃底培养皿MatTek（美国马萨诸塞州阿什兰）P35G-1.5-14-C带玻璃底的35 mm培养皿
吹嘴/橡胶管Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)MP-SET
烟酰胺Sigma（美国密苏里州圣路易斯）N0636-20 保存的储备液 °C
血管内皮生长因子R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）293-VE-80 保存的储备液 °C
激活素BR&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）659-AB储存于 -80 °C
艾塞那肽4Sigma（美国密苏里州圣路易斯）E7144-20 保存的储备液 °C
Rspondin-1R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）3474-RS储存于 -80 °C
Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）352054
PrecisionGlide 针头 18 G x1 1/2Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）305196
PrecisionGlide 针头 16 G x 1 1/2Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）305198
Costar 超低吸附表面 24 孔平底板 康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）3473
Costar 96 孔黑色培养板康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）3603平底、透明，带盖。  黑色聚苯乙烯TC处理的细胞培养微孔板
蔡司 LSM510 META NLO Axiovert 200M 倒置显微镜卡尔蔡司股份公司（Carl Zeiss AG，德国奥伯科亨）
Biomark HD Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山）
Aria 特殊订单研究产品细胞分选仪Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）
PBS/BSA1× PBS
0.1% (wt/vol) BSA
青霉素-链霉素（49 单位/毫升青霉素，49 μg/ml 链霉素
PBS/BSA/Dnase11× PBS
0.1% (wt/vol) BSA
青霉素-链霉素（49 单位/毫升青霉素，49 μg/ml 链霉素
Dnase 1（每胰腺2,400单位/毫升）

参考文献

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胰腺前体细胞甲基纤维素实验CD133 Sox9 EGFP微流控qRT-PCR整体免疫染色自我更新多谱系分化细胞外基质蛋白共聚焦显微镜
体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞
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