本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行处理的实验方案，同时重点介绍了基因表达分析及蛋白质数据标准化的正确方法。
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本文内容
摘要
摘要
原代肠道类器官是一种有价值的研究模型系统，有望对黏膜免疫学领域产生重大影响。然而，类器官的生长特性较为复杂，研究者需注意其中存在的诸多局限性。具体而言，每个类器官的生长模式高度可变，导致培养物中上皮细胞群体具有异质性。由于细胞结构的复杂性，常规的组织培养方法无法直接适用于类器官系统。仅基于细胞数量进行计数和接种——这种方法常用于单个分离的细胞（如细胞系）——对于类器官而言并不可靠，除非应用某种标准化技术。由于类器官中存在固有的蛋白质基质，以总蛋白含量作为标准化方法也变得复杂。在评估类器官群体分泌产物时，必须充分考虑细胞数量、形态和细胞类型等方面的特性。本实验方案旨在概述一种简单的方法，用于培养小肠类器官并以微生物病原体或病原体相关分子模式（PAMPs）对其进行处理。同时，本方案也强调了在进行此类刺激后开展蛋白质分析时应采用的标准化技术。
引言
已有关于小肠、结肠、胰腺、肝脏和脑类器官的分离与培养技术的报道，这些进展对于理解更接近生理状态的组织生物学现象具有重要意义1-5首次描述小肠类器官培养与维持方法的研究由 Sato 报道 等 来自汉斯·克利弗斯实验室1在本方法出现之前，原代肠上皮细胞的分离与培养在维持上皮细胞生长方面一直存在局限性且效果不佳。传统方法包括通过胶原酶和分散酶等酶类孵育组织进行消化，但最终往往导致原代成纤维细胞混杂生长。6这些条件在维持上皮细胞培养方面也存在时间限制。由于缺乏适当的生长因子或细胞接触完整性丧失（称为失巢凋亡），上皮细胞将进入凋亡，因而几乎无法形成上皮细胞生态位。73D类器官培养系统的出现为长期培养包含多种肠道细胞类型的原代肠道细胞提供了一种方法1这些上皮类器官相较于细胞系具有优势，因其由多种分化的细胞组成，能够更真实地模拟其来源器官的结构与功能。 体内8最终的过程 "在培养皿中培育迷你肠道" 已被证明是评估肠道上皮在不同刺激下反应的有力工具。研究原代肠道细胞与微生物病原体相关分子模式（PAMPs）的相互作用在免疫学领域具有重要意义，因为这些分子模式能够调控宿主与微生物双方的多种反应。9研究人员如今不仅能够利用小鼠类器官研究这些相互作用，还可以培养人类来源的类器官。2这项技术有望彻底改变个性化医疗，人们不禁推测该技术....
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方案
所有研究均经弗吉尼亚理工大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在其指导下进行
1. 从 HEK293T-Rspo1 细胞系制备 R-Spondin1 条件培养基
- HEK293T-Rspondin1 细胞的制备方法此前已有描述10。将分泌 Rspondin1 的 HEK293T-Rspondin1 细胞以 5–10% 的汇合度（约 8 × 105–1.7 × 106 个细胞）接种于含 40 ml 1× Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）+ 10% 胎牛血清（FBS）的 T-175 培养瓶中作为生长培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
注意：分泌 Rspondin1 的 HEK293T-Rspondin1 细胞所用生长培养基即为含 R-spondin1 的条件培养基。R-spondin1 也可购自商业来源的重组生长因子，使用终浓度为 500 ng/ml。 - 将 HEK293T-Rspondin1 细胞培养七天，或直至通过明场显微镜观察达到 95% 汇合度。收集 40 ml 条件培养基并转移至 50 ml 锥形管中。弃去 T-175 培养瓶中的 HEK293T-Rspondin1 分泌细胞。
- 将含有条件培养基的管在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。收集上清液（称为含 R-s....
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结果
按照本方案培养肠道类器官时，收获后可见典型的球形类器官。每天添加R-spondin1条件培养基可启动类器官的生长和出芽。类器官的生长情况如图1A-F所示，分别代表培养第1、2、4、5、6和第14天的肠道类器官典型形态。图1F显示了第14天类器官生长的非均一性特征。
当类器官扩增至足够数量后，可将其重新接种，并用各种病原体相关分子模式（PAMP）和/或微生物进行刺激。可通过标准技术进行表达分析。如图2A-C所示，展示了类器官经热灭活单核细胞增生李斯特菌 L. monocytogenes和PAMP鞭毛蛋白刺激24小时后，炎症性细胞因子IL-18、IL-6和TNFα的mRNA表达水平。选择分析IL-18、IL-6和TNFα细胞因子mRNA表达的原因在于，这些因子是上皮细胞在应对病原体刺激时可能被调控的良好候.......
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讨论
肠道类器官的培养与维持是一种任何具备适当组织培养技术的人员均可掌握的操作。与传统的单层细胞培养相比，在传代过程中存在一些细微差别，但这些差异并不难克服。该方法的关键步骤在于能够将类器官培养至足够高的密度，以实现最佳的接种效果。由于细胞系常能达到较大的接种密度，而这对类器官而言并不现实，因此实验需根据类器官的特点进行规模调整。当存在多个处理组时，这一点尤为明显。
本方案旨在提供一种逐步研究肠上皮与多种不同细菌之间宿主-病原体相互作用的方法， 病毒和真菌病原体，并解决在此系统中进行标准化时所遇到的困难。已有研究报告描述了肠道类器官与细菌病原体之间的相互作用 沙门氏菌 但未涉及在检测分泌型细胞因子时的标准化方法13.
在通过不同方法对类器官培养物进行标准化时会遇到一些困难。通过二辛可宁酸法对分泌蛋白进行标准化 （BCA）是一种可选方法；然而，类器官培养所需的生长组分（N2 和/或维生素 B27）会干扰 BCA 检测 (数据未.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Sheryl Coutermarsh-Ott 博士、Dylan McDaniel 和 Bettina Heid 提供的技术讨论。作者感谢 Nanda Nanthakumar 博士提供 Caco-2 细胞。作者还感谢弗吉尼亚理工学院的多元文化学术机会计划（Multicultural Academic Opportunities Program, MAOP）。本研究由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目 K01DK092355（授予 I.C.A.）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11050 | （第1、3、6节）或同等品牌 |
| Sorvall Legend XTR 离心机 | Thermo | （第1、3节） | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | （第1、6节）用于Caco-2和HEK293 Rspondin1细胞 |
| HEK293T-Rspondin1分泌细胞系 | （第1节）根据Kim, K.A. 等人描述并改进：慢病毒颗粒包含克隆至pReceiver-Lv105骨架的RSPO1(NM_138683) ORF cDNA，由GeneCopoeia定制订购并购买。 | ||
| 50 ml 锥形管 | Falcon | 352070 | （第1节）或同等品牌 |
| T-175 培养瓶 | Corning | 431079 | （第1节）或同等品牌 |
| 蛋白基质 | Corning | 356231 | （第2、3、4、5、6节）生长因子减少型Matrigel |
| HyClone杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | GE Healthcare | SH30264.01 | （第2、3节） |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | （第2、3节）高级DMEM/F12 |
| Corning 24孔组织培养板 | Corning | 3524 | （第2节） |
| N2添加剂（100倍浓缩） | Life Technologies | 17502-048 | （第2节） |
| B27添加剂（不含维生素A，50倍浓缩） | Life Technologies | 12587-010 | （第2节） |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | （第2节） |
| 谷氨酰胺添加剂（Glutamax） | Life Technologies | 35050-061 | （第2节）可与高级DMEM/F12混合使用 |
| HEPES（1 M） | Life Technologies | 15630-080 | （第2节）可与高级DMEM/F12混合使用 |
| 10 ml 移液管 | Falcon | 357551 | （第2节）或同等品牌 |
| 小鼠Noggin | Peprotech | 250-38 | （第2节）储存液浓度 = 100 mg/ml |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | （第2节）储存液浓度 = 1 M |
| 重组小鼠EGF | Biolegend | 585608 | （第2节）储存液浓度 = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | （第3节） | |
| 解剖剪刀 | （第3节） | ||
| 镊子 | （第3节） | ||
| 载玻片 | （第3节） | ||
| 解剖镊 | （第3节） | ||
| 25 ml 移液管 | Falcon | （第3节） | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | （第3节）0.5 M 或其他组织培养级EDTA |
| 无菌培养皿（100 mm × 15 mm） | Fisher | FB0875712 | （第3节）或同等尺寸组织培养皿 |
| 1 ml 注射器 | Becton Dickinson | 309659 | （第4节） |
| Precision Glide 针头 | Becton Dickinson | 305120 | （第4节）23G × 1 1/4（0.6 mm × 30 mm） |
| 枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白 | Invivogen | tlrl-bsfla | （第5、6节） |
| 单核细胞增生李斯特菌 | ATCC | 19115 | （第5、6节） （Murray 等 ） |
| 血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | （第5、6节）或同等品牌 |
| BBL 脑心浸液琼脂 | Becton Dickinson | 211065 | （第5节） |
| Bacto 脑心浸液 | Becton Dickinson | 237500 | （第5节） |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | （第6节） |
| 胰蛋白酶 | gibco | 25200056 | （第6节） |
| 甲醇 | Fisher | A412-4 | （第6节） |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | （第6节） | |
| 96孔检测板 | Corning | 3603 | （第6节）黑色板，透明底部，经组织培养处理 |
| 核染色染料 | Life Technologies | H1399 | （第6节）Hoechst 33342 |
| T-75 培养瓶 | Corning | 430641 | （第6节）或同等品牌 |
| 15 ml 锥形管 | Falcon | 352096 | （第1、3节）或同等品牌 |
| 1.7 ml 聚丙烯管 | Bioexpress | C-3262-1 | 或同等品牌 |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | 或同等品牌 |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman基因表达检测试剂盒 |
| IL-6 | Applied Biosystems | Mm 00446190_m1 | Taqman基因表达检测试剂盒 |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman基因表达检测试剂盒 |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman基因表达检测试剂盒 |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman基因表达检测试剂盒 |
| 7500 Fast 实时PCR系统 | Applied Biosystems | ||
| Nexus梯度Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA 反转录试剂盒 | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96孔反应板，0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| 重组小鼠R-Spondin 1蛋白 | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C7559 |
参考文献
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelia....
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