本文介绍了一种从感染小鼠巨噬细胞的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）中分离细菌RNA的方法。该技术也可用于其他胞内病原体与哺乳动物宿主细胞。
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本文内容
摘要
摘要
在哺乳动物感染期间对细菌病原体的转录组进行分析，是研究介导感染的基因和因子的有力工具。然而，从感染的细胞或组织中分离细菌RNA是一项具有挑战性的任务，因为感染细胞裂解物中的RNA主要来自宿主。本文介绍了一种优化的RNA分离方法，用于从骨髓来源的巨噬细胞内生长的Listeria monocytogenes细菌中提取RNA。感染后，轻度裂解细胞并迅速过滤，以去除大部分宿主蛋白和RNA，同时保留完整的细菌。随后，采用热酚-SDS法提取细菌RNA，并进行DNase处理。所获得的RNA适用于多种技术进行基因转录分析。该方法已成功应用于我们对Listeria monocytogenes在巨噬细胞感染过程中基因调控的研究1-4。本方案可轻松修改，以适用于其他细菌病原体和细胞类型的研究。
引言
胞内细菌病原体 ─ 引起传染性疾病且能在人类宿主细胞内生长和繁殖的细菌 ─ 是全球主要的健康问题5为了侵入并在哺乳动物细胞内复制，胞内病原菌已获得复杂的毒力机制和因子。尽管这些机制对致病能力至关重要，但我们对其调控和动态过程知之甚少。由于在液体培养基中培养的细菌基因表达谱并不能反映其在宿主细胞内的真实环境，因此迫切需要对在胞内生态位中生长的细菌进行转录组分析。此类分析将有助于解析由宿主触发的细菌特异性适应机制，并有助于发现新的治疗靶点。由于哺乳动物RNA的数量至少是细菌RNA的十倍，对胞内生长细菌的转录组分析极具挑战性。本文中，我们描述了一种从感染细胞中分离细菌RNA的实验方法 单核细胞增生李斯特菌 在小鼠巨噬细胞内生长的细菌。所提取的RNA可用于通过多种转录分析技术（如RT-PCR、RNA-Seq、微阵列及其他基于杂交的技术）研究病原菌的胞内适应性及毒力机制。
单核细胞增生李斯特菌 是人类李斯特菌病的致病菌，该疾病主要影响免疫功能低下者、老年人和孕妇6。它 是一种革兰氏阳性兼性胞内病原菌，可侵入多种哺乳动物细胞，数十年来已被用作宿主-病原体相互作用研究的模型7入侵后，它最初存在于一个液泡或吞噬体（在吞噬细胞的情况下）中，必须从中逃逸至宿主细胞的胞质溶胶中才能进行复制。已有研究显示，多种毒力因子参与介导这一逃逸过程，主要包括成孔溶血素....
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方案
注意：整个实验过程中，巨噬细胞在37 °C、5% CO2的强制通风培养箱中孵育，仅在进行实验操作时短暂取出，所有操作均在II级生物安全柜中进行。L. monocytogenes细菌的操作需遵循生物安全二级（BSL-2）规定。
1. 细胞准备与细菌感染（第1天和第2天）
- 第1天
- 在145 mm培养皿中，以30 ml BMDM + 青霉素-链霉素培养基（表2）接种2.0 × 107个骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。每种待分析的细菌菌株接种3个培养皿。在37 °C、5% CO2的强制通风培养箱中过夜培养。
- 在标准培养箱中，于30 °C条件下，在10 ml脑心浸液（BHI）培养基中启动野生型（WT）L. monocytogenes菌株10403S的过夜细菌培养。将培养管倾斜放置，不进行振荡。注意：这些生长条件可上调鞭毛基因的表达，从而促进高效感染。
- 第2天
- 将BMDM培养基（不含青霉素-链霉素抗生素）（表2）和磷酸盐缓冲液（PBS）预热至37 °C。
- 用25 ml预热的PBS洗涤巨噬细胞单层两次，以去除抗生素。加入30 ml新鲜的BMDM培养基。
- 取1.5 ml过夜细菌培养物....
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结果
模型系统如图1所示，包括感染了L. monocytogenes细菌的巨噬细胞，该细菌在巨噬细胞的细胞质中进行复制。图2展示了实验方案。图3显示了野生型L. monocytogenes在巨噬细胞内生长期间毒力基因RT-qPCR分析的典型结果，与在富含营养的实验室培养基BHI中的生长情况进行比较。结果显示了L. monocytogenes两种主要毒力因子的转录水平：hly基因编码李斯特溶血素O（LLO）毒素，以及actA基因编码肌动蛋白组装蛋白，这两个基因在感染巨噬细胞后均显著上调。
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讨论
此处所述方案代表了一种从细菌中分离RNA的优化方法 L. monocytogenes 在巨噬细胞内生长的细菌。该方案基于细胞差异裂解法，包含两个主要步骤以富集细菌RNA：通过离心实现巨噬细胞核的沉淀，以及通过过滤快速收集细菌。随后进行标准的RNA提取流程。尽管本方案描述的是李斯特菌RNA的纯化，但可轻松修改用于其他细菌病原体。虽然该方法侧重于转录分析所需的RNA纯化，但其中用于将胞内生长的细菌与其宿主分离的原理，也可应用于纯化其他细菌组分，如DNA、蛋白质、细胞壁等。 等等。 此类基因组学和生物化学分析将有助于更深入地理解并表征胞内病原体在感染过程中的生命周期。
该实验步骤可获得约 100 ng 的总细菌 RNA。尽管 RNA 产量相对较低，但仍适用于多种下游基因转录分析技术，如 RT-qPCR、RNA-Seq 以及现代基于杂交的技术。为提高 RNA 产量，建议使用新鲜的细菌接种物，以及新鲜的苯酚溶液、无核酸酶水和缓冲液，以避免可能的 RNase 污染。在提取过程中，收集的细菌和分离的 RNA 始终应置于冰上保存。感染时间可根据具体研究的生物学问.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Herskovits 实验室的研究工作得到了欧洲研究理事会（ERC）335400 项目和美国国立卫生研究院（NIH）R01A/109048 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 单核细胞增生李斯特菌 10403S | 20 | ||
| 由 C57B/6 雌性小鼠骨髓制备的巨噬细胞 | 21 | ||
| H2O，无RNA酶 | 赛默飞世尔科技 | 10977-015 | 可使用DEPC处理水 |
| DMEM | 吉布科 | 41965039 | |
| 谷氨酰胺 | 吉布科 | 25030081 | |
| 丙酮酸钠 | 吉布科 | 11360-088 | |
| β-巯基乙醇 | 吉布科 | 31350010 | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | 吉布科 | 15140-122 | |
| 庆大霉素 | 西格玛-奥德里奇 | G1397 | |
| 胎牛血清（FBS） | 吉布科 | 10270106 | |
| 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS） | 西格玛-奥德里奇 | D8537 | |
| 脑心浸出液培养基（BHI） | 默克密理博 | 1104930500 | |
| 饱和酚，pH 4.3 | 菲舍尔 | BP1751I-400 | |
| 氯仿 | 菲舍尔 | BP1145-1 | |
| 异戊醇 | 西格玛-奥德里奇 | W205702 | |
| 乙酸钠 | 西格玛-奥德里奇 | W302406 | |
| EDTA | 西格玛-奥德里奇 | EDS | |
| DNaseI | 费尔蒙塔斯 | EN0521 | |
| 10% SDS | 西格玛-奥德里奇 | L4522 | |
| 无水乙醇 | 默克密理博 | 1070174000 | |
| 37 °C、5% CO2 强制通风培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 型号 3111 | |
| 细胞刮刀 | 南克 | 179693 | |
| 45 mm 滤膜用 Kontes 玻璃支架 | 菲舍尔 | K953755-0045 | |
| MF-Millipore 滤膜，45 mm，0.45 µm | 默克密理博 | HAWP04700 | |
| 真空离心浓缩系统（SpeedVac） | 赛默飞世尔科技 | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 涡旋振荡器 | 科学工业公司 | 型号 G560E | |
| NanoDrop 核酸蛋白测定仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 145 mm 细胞培养皿 | 格瑞纳 | 639 160 | |
| 1.7 ml 无RNA酶离心管 | 爱吉森 | MCT-175-C | |
| 30 °C 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 65 °C 加热块 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 4 °C 台式离心机 | 艾本德 | 5417R | |
| 无菌移液管，25 ml | 格瑞纳 | ||
| Falcon 管，50 ml | 格瑞纳 | ||
| 液氮 |
参考文献
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A.
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