本文介绍了一种从感染小鼠巨噬细胞的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）中分离细菌RNA的方法。该技术也可用于其他胞内病原体与哺乳动物宿主细胞。
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摘要
摘要
在哺乳动物感染期间对细菌病原体的转录组进行分析，是研究介导感染的基因和因子的有力工具。然而，从感染的细胞或组织中分离细菌RNA是一项具有挑战性的任务，因为感染细胞裂解物中的RNA主要来自宿主。本文介绍了一种优化的RNA分离方法，用于从骨髓来源的巨噬细胞内生长的Listeria monocytogenes细菌中提取RNA。感染后，轻度裂解细胞并迅速过滤，以去除大部分宿主蛋白和RNA，同时保留完整的细菌。随后，采用热酚-SDS法提取细菌RNA，并进行DNase处理。所获得的RNA适用于多种技术进行基因转录分析。该方法已成功应用于我们对Listeria monocytogenes在巨噬细胞感染过程中基因调控的研究1-4。本方案可轻松修改，以适用于其他细菌病原体和细胞类型的研究。
引言
胞内细菌病原体 ─ 引起传染性疾病且能在人类宿主细胞内生长和繁殖的细菌 ─ 是全球主要的健康问题5为了侵入并在哺乳动物细胞内复制，胞内病原菌已获得复杂的毒力机制和因子。尽管这些机制对致病能力至关重要，但我们对其调控和动态过程知之甚少。由于在液体培养基中培养的细菌基因表达谱并不能反映其在宿主细胞内的真实环境，因此迫切需要对在胞内生态位中生长的细菌进行转录组分析。此类分析将有助于解析由宿主触发的细菌特异性适应机制，并有助于发现新的治疗靶点。由于哺乳动物RNA的数量至少是细菌RNA的十倍，对胞内生长细菌的转录组分析极具挑战性。本文中，我们描述了一种从感染细胞中分离细菌RNA的实验方法 单核细胞增生李斯特菌 在小鼠巨噬细胞内生长的细菌。所提取的RNA可用于通过多种转录分析技术（如RT-PCR、RNA-Seq、微阵列及其他基于杂交的技术）研究病原菌的胞内适应性及毒力机制。
单核细胞增生李斯特菌 是人类李斯特菌病的致病菌，该疾病主要影响免疫功能低下者、老年人和孕妇6。它 是一种革兰氏阳性兼性胞内病原菌，可侵入多种哺乳动物细胞，数十年来已被用作宿主-病原体相互作用研究的模型7入侵后，它最初存在于一个液泡或吞噬体（在吞噬细胞的情况下）中，必须从中逃逸至宿主细胞的胞质溶胶中才能进行复制。已有研究显示，多种毒力因子参与介导这一逃逸过程，主要包括成孔溶血素单核细胞增生李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O, LLO）以及另外两种磷脂酶。8在细胞质中，细菌利用宿主的肌动蛋白聚合机制，借助细胞内的肌动蛋白丝进行自身推进，并在细胞间传播。图1）。单核细胞增生李斯特菌的所有主要毒力因子 L. monocytogenes 参与入侵、胞内存活和复制的基因由主要毒力转录调控因子 PrfA 激活。 8-10.
在过去十年中，我们及他人开展的多项研究已成功应用了对宿主细胞内增殖的细菌进行转录组分析的方法2,11-15。目前用于分离细菌RNA与宿主RNA的主要方法有两种：1）选择性富集细菌RNA；2）通过差异性细胞裂解进行RNA分离。第一种方法依赖于将总RNA提取物与哺乳动物RNA分子进行减法杂交（例如使用 commercially available kits）或选择性捕获细菌转录序列（SCOTS）11。第二种方法基于细菌与宿主细胞的差异性裂解，即裂解宿主细胞而保持细菌细胞完整。随后通常通过离心将完整的细菌从宿主细胞裂解液中分离，并使用标准技术提取RNA。该方法的主要问题是，在分离完整细菌的同时，宿主细胞的细胞核也会被一同分离，因此RNA样品中仍含有哺乳动物RNA。克服这一问题的一种方法是采用差速离心将完整细菌与宿主细胞核分离，但该过程通常耗时较长，可能引起提取过程中基因表达谱的变化。本文介绍一种改进的、快速的细菌RNA提取方案，该方法基于差异性细胞裂解法。首先，用冷水裂解感染了L. monocytogenes的巨噬细胞；接着，通过短暂离心去除巨噬细胞核，并迅速将完整的细菌截留在滤膜上，随后采用热酚-SDS法提取细菌核酸中的RNA。
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方案
注意：整个实验过程中，巨噬细胞在37 °C、5% CO2的强制通风培养箱中孵育，仅在进行实验操作时短暂取出，所有操作均在II级生物安全柜中进行。L. monocytogenes细菌的操作需遵循生物安全二级（BSL-2）规定。
1. 细胞准备与细菌感染（第1天和第2天）
- 第1天
- 在145 mm培养皿中，以30 ml BMDM + 青霉素-链霉素培养基（表2）接种2.0 × 107个骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。每种待分析的细菌菌株接种3个培养皿。在37 °C、5% CO2的强制通风培养箱中过夜培养。
- 在标准培养箱中，于30 °C条件下，在10 ml脑心浸液（BHI）培养基中启动野生型（WT）L. monocytogenes菌株10403S的过夜细菌培养。将培养管倾斜放置，不进行振荡。注意：这些生长条件可上调鞭毛基因的表达，从而促进高效感染。
- 第2天
- 将BMDM培养基（不含青霉素-链霉素抗生素）（表2）和磷酸盐缓冲液（PBS）预热至37 °C。
- 用25 ml预热的PBS洗涤巨噬细胞单层两次，以去除抗生素。加入30 ml新鲜的BMDM培养基。
- 取1.5 ml过夜细菌培养物，用PBS洗涤：在 > 14,000 × g条件下离心1分钟，弃去上清液，用移液器将细菌轻柔地重悬于1.5 ml PBS中。重复该步骤两次。
- 用0.5 ml洗涤后的野生型L. monocytogenes过夜培养物感染每个巨噬细胞培养皿。若使用多个培养皿，每隔15分钟感染一个培养皿。此时间间隔可确保在感染结束时能够分别收获每个培养皿。
注意：感染复数（MOI）通过将用于感染的细菌培养物进行系列稀释后涂布于BHI琼脂平板，并在37 °C培养24小时后计数菌落形成单位（CFU）来测定。使用0.5 ml的WT L. monocytogenes菌株10403S可获得约100的MOI（即每个巨噬细胞对应100个细菌CFU）。在分析细胞内生长缺陷的细菌突变体时，应考虑使用更高的MOI。 - 在37 °C孵育0.5小时后，用PBS洗涤感染细胞两次，以去除未附着的细菌，然后加入30 ml预热的BMDM培养基。已附着的细菌将在接下来的0.5小时内被内化。
- 感染后1小时，加入30 µl庆大霉素（1:1,000稀释，终浓度为50 µg/ml），以杀死细胞外细菌。
- 组装滤器装置：将滤头安装在带有真空出口的收集液瓶上，然后在滤头上放置一个滤膜（0.45 µm），再放上圆筒形漏斗，并用金属夹固定各部件。准备预冷的无RNase水。
- 感染后6小时，按以下步骤从感染细胞中收获细菌。每个培养皿单独处理。
注意：通常，L. monocytogenes在巨噬细胞内感染6小时期间可完成约1个对数级的生长。更长的孵育时间可能导致细菌过度生长及巨噬细胞死亡，而更短的孵育时间则可能导致细菌载量显著降低。可根据需要调整MOI和感染时间以达到最佳条件。- 用PBS洗涤一次感染细胞。加入20 ml预冷的无RNase水以裂解巨噬细胞。使用细胞刮刀快速但小心地将细胞从培养皿上刮下。
- 将裂解液收集至50 ml锥形管中。涡旋振荡30秒。在4 °C条件下以800 × g离心3分钟。
- 使用真空系统将上清液通过滤器装置过滤。用镊子卷起滤膜，并迅速转移至15 ml锥形管中。将装有滤膜的管子在液氮中速冻。
- 按照步骤1.2.7所述方法，为下一个样品组装带有新滤膜的过滤装置。
- 将冷冻的滤膜在-80 °C保存至次日。也可直接进行核酸提取。
2. 核酸提取（第3天）
注意：所有涉及苯酚和氯仿溶液的操作均须在通风橱中进行。
- 为每个样品准备 400 µl 酸性酚:氯仿（1:1）混合液。在单独的离心管中混合后，通过抽吸收集所得的水相。加入 40 µl 10% SDS。
- 将含有滤膜的离心管置于冰上解冻，以保持低温。向每个含滤膜的离心管中加入 650 µl 醋酸盐-EDTA（AE）缓冲液（表 2）。
- 尽可能快速地执行以下步骤。
- 剧烈涡旋含有滤膜的离心管，使滤膜甩至管壁边缘，并确保缓冲液充分冲洗滤膜。操作过程中应始终将离心管放回冰上以保持低温。注意：可能需要将离心管倒置后进一步涡旋，以彻底将细菌从滤膜上洗脱下来。
- 对所有离心管重复上述操作。在操作结束时，可短暂离心（120 × g，1 分钟）以提高悬浮液的收集效率。
- 将含有细菌的缓冲液转移至含有 SDS 和酚/氯仿混合液（按步骤 2.1 配制）的 1.5 ml 微量离心管中。对所有样品重复此操作。为充分回收滤膜上残留的缓冲液，可能需要再次对含滤膜的离心管进行短暂离心（120 × g，1 分钟）。
- 将所有 1.5 ml 离心管放入多管涡旋仪中，以最大速度涡旋 10 分钟。
- 将离心管置于 65 °C 恒温金属浴中孵育 10 分钟，随后在 4 °C 下以最大速度（> 14,000 × g）离心 5 分钟。
- 将每管中的水相（约 400 µl）转移至新的 1.5 ml 离心管中，每管加入 40 µl 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 1.0 ml 100% 乙醇。充分涡旋混匀。
注意：此步骤可加入糖原以提高沉淀物的可见度。 - 将样品在 -80 °C 下孵育 1 小时；或在 -20 °C 下过夜孵育。随后在 4 °C 下以最大速度（> 14,000 × g）离心 20 分钟。
- 小心抽吸去除每管中的乙醇（上层液体）。向每个样品中加入 500 µl 冷的 70% 乙醇，充分涡旋混匀。在 4 °C 下以最大速度（> 14,000 × g）离心 20 分钟。
- 小心抽吸去除每管中的乙醇。使用无加热的真空浓缩仪干燥样品约 2 分钟。注意避免过度干燥。
- 向每个样品中加入 25 µl 无 RNase 水。室温孵育 20 分钟。小心涡旋混匀后短暂离心。
- 使用微量紫外-可见分光光度计测定样品中的 RNA 浓度。预期每块培养板可提取约 0.5 - 1 µg 核酸。
注意：此时可合并技术重复样本。
3. DNase 处理
- 在微量离心管中按照表1设置反应体系，在37 °C孵育45分钟。加入450 µl无RNase的水和500 µl酚-氯仿-IAA混合液（表2），在最大转速（> 14,000 x g）下离心2分钟以分离相层。
- 将水相转移至新管，加入500 µl氯仿-IAA混合液（表2），涡旋混匀，并在最大转速（> 14,000 x g）下离心2分钟以分离相层。
- 将水相转移至新管，加入1 ml乙醇和50 µl 3 M乙酸钠（pH 5.2），涡旋混匀。
注意：此步骤可加入糖原以改善沉淀物的可视化效果。 - 在-80 °C孵育1小时。或者，可在-20 °C过夜孵育。在4 °C、最大转速下离心20分钟。
- 小心吸除每管中的乙醇。向每个样品中加入500 µl预冷的70%乙醇，充分涡旋混匀。在4 °C、最大转速下离心20分钟。小心吸除每管中的乙醇。
- 使用无加热的真空浓缩仪干燥样品约2分钟。切勿过度干燥。
- 加入12 µl无RNase的水，在室温孵育2分钟，涡旋混匀后短暂离心。样品中含纯化的RNA，应置于冰上保存。或者，可将RNA溶解于含0.1 mM EDTA的无RNase H2O或TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA）中。
- 使用微体积紫外-可见分光光度计测定RNA浓度。每个样品预计可获得约100 ng RNA（若合并技术重复样本）。
注意：按照本方案提取的RNA适用于多种技术进行基因转录分析。我们通常采用RT-qPCR分析单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）在感染巨噬细胞过程中的基因转录情况1-4。
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结果
模型系统如图1所示，包括感染了L. monocytogenes细菌的巨噬细胞，该细菌在巨噬细胞的细胞质中进行复制。图2展示了实验方案。图3显示了野生型L. monocytogenes在巨噬细胞内生长期间毒力基因RT-qPCR分析的典型结果，与在富含营养的实验室培养基BHI中的生长情况进行比较。结果显示了L. monocytogenes两种主要毒力因子的转录水平：hly基因编码李斯特溶血素O（LLO）毒素，以及actA基因编码肌动蛋白组装蛋白，这两个基因在感染巨噬细胞后均显著上调。
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讨论
此处所述方案代表了一种从细菌中分离RNA的优化方法 L. monocytogenes 在巨噬细胞内生长的细菌。该方案基于细胞差异裂解法，包含两个主要步骤以富集细菌RNA：通过离心实现巨噬细胞核的沉淀，以及通过过滤快速收集细菌。随后进行标准的RNA提取流程。尽管本方案描述的是李斯特菌RNA的纯化，但可轻松修改用于其他细菌病原体。虽然该方法侧重于转录分析所需的RNA纯化，但其中用于将胞内生长的细菌与其宿主分离的原理，也可应用于纯化其他细菌组分，如DNA、蛋白质、细胞壁等。 等等。 此类基因组学和生物化学分析将有助于更深入地理解并表征胞内病原体在感染过程中的生命周期。
该实验步骤可获得约 100 ng 的总细菌 RNA。尽管 RNA 产量相对较低，但仍适用于多种下游基因转录分析技术，如 RT-qPCR、RNA-Seq 以及现代基于杂交的技术。为提高 RNA 产量，建议使用新鲜的细菌接种物，以及新鲜的苯酚溶液、无核酸酶水和缓冲液，以避免可能的 RNase 污染。在提取过程中，收集的细菌和分离的 RNA 始终应置于冰上保存。感染时间可根据具体研究的生物学问...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Herskovits 实验室的研究工作得到了欧洲研究理事会（ERC）335400 项目和美国国立卫生研究院（NIH）R01A/109048 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 单核细胞增生李斯特菌 10403S | 20 | ||
| 由 C57B/6 雌性小鼠骨髓制备的巨噬细胞 | 21 | ||
| H2O，无RNA酶 | 赛默飞世尔科技 | 10977-015 | 可使用DEPC处理水 |
| DMEM | 吉布科 | 41965039 | |
| 谷氨酰胺 | 吉布科 | 25030081 | |
| 丙酮酸钠 | 吉布科 | 11360-088 | |
| β-巯基乙醇 | 吉布科 | 31350010 | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | 吉布科 | 15140-122 | |
| 庆大霉素 | 西格玛-奥德里奇 | G1397 | |
| 胎牛血清（FBS） | 吉布科 | 10270106 | |
| 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS） | 西格玛-奥德里奇 | D8537 | |
| 脑心浸出液培养基（BHI） | 默克密理博 | 1104930500 | |
| 饱和酚，pH 4.3 | 菲舍尔 | BP1751I-400 | |
| 氯仿 | 菲舍尔 | BP1145-1 | |
| 异戊醇 | 西格玛-奥德里奇 | W205702 | |
| 乙酸钠 | 西格玛-奥德里奇 | W302406 | |
| EDTA | 西格玛-奥德里奇 | EDS | |
| DNaseI | 费尔蒙塔斯 | EN0521 | |
| 10% SDS | 西格玛-奥德里奇 | L4522 | |
| 无水乙醇 | 默克密理博 | 1070174000 | |
| 37 °C、5% CO2 强制通风培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 型号 3111 | |
| 细胞刮刀 | 南克 | 179693 | |
| 45 mm 滤膜用 Kontes 玻璃支架 | 菲舍尔 | K953755-0045 | |
| MF-Millipore 滤膜，45 mm，0.45 µm | 默克密理博 | HAWP04700 | |
| 真空离心浓缩系统（SpeedVac） | 赛默飞世尔科技 | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 涡旋振荡器 | 科学工业公司 | 型号 G560E | |
| NanoDrop 核酸蛋白测定仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 145 mm 细胞培养皿 | 格瑞纳 | 639 160 | |
| 1.7 ml 无RNA酶离心管 | 爱吉森 | MCT-175-C | |
| 30 °C 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 65 °C 加热块 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 4 °C 台式离心机 | 艾本德 | 5417R | |
| 无菌移液管，25 ml | 格瑞纳 | ||
| Falcon 管，50 ml | 格瑞纳 | ||
| 液氮 |
参考文献
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