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方法文章

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

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DOI：

10.3791/54048

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2016年7月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。

摘要

随着基于干细胞的HIV基因疗法的快速发展，迫切需要一种动物模型来研究经基因修饰细胞的造血分化及免疫功能。人源化骨髓/肝脏/胸腺（BLT）小鼠模型能够在外周系统中完全重建人类免疫系统，包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。该模型中的人源胸腺移植物还可支持T细胞在自体胸腺组织中的胸腺选择过程。除用于HIV感染研究外，该模型也是研究造血干细胞（HSCs）来源细胞分化、发育及功能的有力工具。本文概述了人源化非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷（SCID）-共同γ链敲除（cγ-/-)-骨髓/肝脏/胸腺（NSG-BLT）小鼠，其造血干细胞（HSCs）经CD4嵌合抗原受体（CD4CAR）慢病毒载体转导。我们证明，CD4CAR修饰的造血干细胞能够成功分化为多种细胞谱系，并具有抗HIV活性。本研究旨在展示NSG-BLT小鼠模型在 体内 用于构建抗HIV工程化免疫的模型。需要注意的是，由于实验中使用了慢病毒和人体组织，所有实验操作和手术均应在生物安全二级（BSL2）条件下，于配备特殊防护措施（BSL2+）的二级生物安全柜中进行。

引言

尽管联合抗逆转录病毒疗法已取得成功，HIV感染仍是一种终身性疾病。机体针对HIV的细胞免疫反应在控制HIV复制过程中发挥着极为重要的作用。近年来，干细胞操作技术的进步推动了HIV治疗基因疗法的快速发展1-3因此，拥有一个合适的动物模型至关重要，该模型能够允许 体内 细胞疗法抗HIV功效的研究

由于HIV仅感染人类细胞，因此在动物模型中研究HIV具有复杂性。为克服这一限制，科学家已采用诸如在恒河猴中使用猴免疫缺陷病毒（SIV）等疾病模型4,5。然而，该模型存在重大局限性，原因在于物种间的固有差异以及SIV与HIV之间的不同。此外，仅有高度专业化的设施能够支持非人灵长类动物的研究工作，且每只恒河猴都需要大量投入。因此，迫切需要一种能够利用对HIV感染/致病过程易感的人类免疫系统、且经济成本较低的模型。

非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷（SCID）-共同γ链敲除（cγ-/-)（或NSG）血液/肝脏/胸腺（BLT）人源化小鼠模型已被 increasingly 证明是研究HIV感染的重要工具。通过移植造血干细胞（HSCs）和胎儿胸腺组织，这些小鼠能够发育并重建人类免疫系统1-3一种基于干细胞的基因疗法是通过重编程造血干细胞（HSCs），使其分化为抗原特异性T细胞，从而“重定向”外周T细胞以靶向HIV。我们先前已证明，在人源化NSG-BLT小鼠模型中，利用分子克隆的针对HIV-1 Gag蛋白SL9表位（氨基酸77-85；SLYNTVATL）的抗HIV特异性T细胞受体（TCR）对HSCs进行基因工程改造，可引导干细胞发育为成熟的T细胞，进而抑制HIV的复制。6使用分子克隆T细胞受体（TCR）的局限性在于其受限于特定的人类白细胞抗原（HLA）亚型，从而限制了该疗法的应用范围。相比之下，嵌合抗原受体（CAR）可普遍适用于所有HLA亚型。早期研究采用了一种嵌合抗原受体，其由人CD4分子的胞外区和跨膜区与CD3分子的胞内ζ信号域融合而成（称为CD4ζCAR）。在CD8 T细胞上表达的CD4ζCAR能够识别HIV包膜蛋白，并触发类似于T细胞受体介导的细胞毒性T细胞反应。7我们最近证明，人HSCs可经CD4ζCAR修饰，随后分化为多种造血谱系，包括能够在人源化小鼠模型中抑制HIV复制的功能性T细胞。8随着嵌合抗原受体癌症疗法的快速发展9以及对强效广谱中和抗体的持续表征10-12 针对HIV的单链抗体CAR构建成为可能，因此除了CD4ζCAR之外，许多新的候选构建体将被开发并用于基于干细胞的HIV及其他疾病基因治疗的研究。此外，包含这些抗原特异性CAR的人源化NSG-BLT小鼠模型也可作为有效工具，用于深入研究人类T细胞应答 在体内重要的是，我们的方案与此前报道的人源化BLT小鼠构建方法有所不同13-15 其中，以明胶蛋白混合物中的造血干细胞替代胎肝主干16本方案描述了以下内容：1）构建携带CD4ζCAR的人源化BLT小鼠；2）表征基因修饰细胞的分化特性；3）表征基因修饰细胞的功能特性。

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方案

伦理声明： 人胚胎组织来自 Advanced Biosciences Resources 或 Novogenix，获取时不含任何可识别个人信息，因此其使用无需经过机构审查委员会（IRB）批准。本手稿中描述的动物实验是在加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）动物研究委员会（ARC）的书面批准下进行的，并严格遵守所有联邦、州和地方的指导方针。具体而言，这些研究严格遵循美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》 以及国际实验动物护理评估与认证协会（AALAC）的认证和指导原则，实验方案编号为 UCLA ARC 2010-038-02B。所有手术均在氯胺酮/赛拉嗪和异氟烷麻醉下进行，并尽一切努力减轻动物的疼痛与不适。 

1. 构建经CD4嵌合抗原受体改造的人源化小鼠 

  1. 处理胎儿胸腺并从胎儿肝脏中分离CD34+造血干细胞
    1. 胸腺处理
      1. 在15 ml锥形管中用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）轻轻洗涤胸腺，重复洗涤3–4次。
      2. 加入7 ml RPMI培养基 + 10% FBS + 青霉素/链霉素，将所有成分倒入无菌的100 mm培养皿中。
      3. 使用手术刀将胸腺切成约1毫米大小的小块2将每一块胸腺组织分别放入96孔板的单个孔中。转移胸腺组织时使用弯头钝性镊子。
        1. 向所有孔中加入少量培养基（100–200 μl），以防止组织干燥。在显微镜下观察（胸腺具有叶状结构，应呈现为细胞团块状囊袋样外观）。
          注意：任何外观可疑的组织碎片均应弃去；组织中常含有结缔组织，不应植入。
      4. 移除已确认的胸腺组织块，并将所有组织块放入一个T25细胞培养瓶中。加入7 ml RPMI培养基，添加10%胎牛血清以及450 μg/ml哌拉西林/他唑巴坦和两性霉素B。轻轻摇动培养瓶以混匀。于37 ºC、5% CO₂条件下培养过夜2.
        注意：此步骤旨在防止组织受到细菌污染。
      5. （可选步骤）将胸腺组织冷冻以备后续使用。用含10%二甲基亚砜（DMSO）的90%人AB血清平衡组织块10分钟，以1 ºC/min的速率降温至-50 ºC，随后快速冷却至-150 ºC。解冻时，在37 ºC水浴中快速融化，并用不含DMSO的RPMI完全培养基轻柔洗涤3次。
    2. 肝脏处理
      1. 在50 ml锥形管中用PBS轻轻洗涤肝脏，重复洗涤步骤3至4次。
      2. 向50 ml锥形管中加入10 ml IMDM培养基（Iscove改良的Dulbecco培养基）。将所有液体倒入100 mm无菌培养皿中。
      3. 使用两把手术刀匀浆肝脏组织，将肝脏切成约3 mm的小块2切除并弃去所有白色结缔组织。
      4. 使用带有16号钝头针头的10 ml注射器吸取肝脏组织块及培养基，随后转移至50 ml锥形管中。
      5. 轻轻重悬培养基和组织悬液，并再吹打5-7次，以彻底均质化组织。
      6. 准备10 ml IMDM培养基，添加以下酶：500 U/ml胶原酶、2,400 U/ml透明质酸酶和300 U/ml DNase，以及450 μg/ml哌拉西林/他唑巴坦和两性霉素B。使用0.22 µm滤器过滤培养基，然后将其加入肝组织悬液中。
      7. 将含有肝悬液的50 ml锥形管盖紧，并用自封膜（如Parafilm）密封以防止泄漏。在37 °C培养箱中用管式旋转仪旋转孵育90 min。
      8. 将消化后的细胞悬液通过100 µm细胞滤网过滤至一个新的50 ml离心管中。
        注意：加入 PBS 至悬浮液中，使总体积达到 50 ml。将此悬浮液均分为两份，分别加入两个 50 ml 离心管中，每管含 25 ml 细胞悬浮液。
      9. 在每根试管中，将10 ml密度梯度离心液缓慢轻柔地铺在细胞下方（例如， Ficoll）。以1,200 × g离心20分钟，不启用刹车。注意：本方案中提及的所有离心步骤均在室温（25 ºC）下进行。
      10. 小心地移除界面（即从每管中收集界面层（如白膜层），转移至两个独立的50 ml离心管中。用PBS将每管的体积补至50 ml。在300 × g下离心7–10分钟。小心吸除上清液。
      11. 将两个沉淀合并，再用含有2% FBS的50 ml PBS洗涤三次，每次以300 × g离心7–10分钟，并小心吸除上清液。
      12. 将沉淀重悬于50 ml RPMI培养基（含10% FBS）中。在进行细胞分选前，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
      13. 立即使用CD34分选试剂盒对CD34+细胞进行分选（例如，CD34 微珠），按照制造商提供的说明书操作。
        注意：或者，细胞可在 RPMI 培养基 + 10% FBS 中以每毫升100万个细胞的密度培养过夜。
      14. 同时保存 CD34+ 和 CD34- 组分。
        注意：在此步骤中，可使用 Bambanker 冻存液或其他冻存液对 CD34+ 和 CD34- 细胞进行冻存。每管冻存 1 ml，细胞密度为 4 - 6 x 106 每管 CD34+ 细胞，冻存 1 ml，细胞数量为 40 - 60 × 106 每管 CD34- 细胞数
  2. CD34+ 细胞的转导
    1. 计算所需的6孔组织培养板中的转导孔数。每孔最多可用于转导8 x 106 细胞。每只BLT小鼠使用0.5 × 106 CD34+ 将与 CD34- 细胞和胸腺一同植入肾包膜下，数量为 0.5 x 106 CD34+ 细胞将通过静脉注射。所用 CD34+ 细胞的数量根据小鼠数量确定（每只小鼠 100 万个细胞）。
    2. 用 1.25 ml 重组人纤维连接蛋白溶液包被所需数量的未经组织培养处理的 6 孔板孔例如，Retronectin）（20 µg/ml PBS溶液）加入每孔中。用盖子盖好培养板，在洁净的生物安全柜中室温孵育2小时。
    3. 吸出各孔中的纤连蛋白溶液，每孔加入1.25 ml FACS缓冲液（含4% FBS的PBS）以进行封闭。将培养板在室温（25 ºC）下静置30分钟。
    4. 吸去FACS缓冲液，用PBS洗涤一次。
    5. 将 PBS 保留在包被的孔中，直至准备使用该板。如不立即使用，可在 4 ºC 下过夜储存。
    6. 将CD34+细胞接种于感染培养基（含2%人血清白蛋白的Yssel无血清T细胞培养基）中，置于纤维连接蛋白溶液包被的孔板孔内（约2 x 106 细胞/毫升），37 ºC 下孵育 1 小时。
    7. 使用移液器将慢病毒载体加入孔中，感染复数（MOI）为 2 - 10。轻轻混匀，于 37 ºC 培养过夜。
      注意：应事先确定所用慢病毒载体的滴度。
    8. 第二天早上用细胞刮轻轻刮取孔底以收集细胞。此时收集细胞并用血细胞计数板进行计数。
    9. 为准备用于移植的细胞，将 0.5 x 106 转导CD34+细胞，使用4.5 x 106 每只小鼠的CD34-细胞分装至无菌1.5 ml螺口离心管中。在300 × g条件下离心以沉淀细胞，吸除上清液。再次于300 × g离心，并使用P10移液器小心吸除残留的上清液。在整个实验过程中将干燥的细胞沉淀置于冰上保存。注意：为确保细胞活性，应使用沉淀后的细胞并在2–3小时内完成手术操作。
    10. 为准备用于注射的细胞，将 0.5 x 106 每只小鼠的转导CD34+细胞离心成团，吸除上清液。每只小鼠用100 µl RPMI培养基重悬细胞，置于冰上保存。
    11. 为检测转导效率，取约 1 x 105 在96孔板中，将每种条件下的非转导和转导CD34+细胞分别接种于200 µl细胞因子培养基（含10% FBS的RPMI培养基，添加100 ng/ml人IL-3、IL-6和SCF），于37 ºC培养5–7天。
      注意：此步骤中使用的细胞不用于手术，而是用于确认转导成功，且载体对干细胞的存活与自我更新无毒性。可通过检测载体的基因表达来评估转导效率例如，GFP&CD4）并通过流式细胞术进行分析。
  3. 利用组织移植构建基因工程小鼠
    1. 同一天手术前对NOD.Cg-小鼠进行全身照射Prkdcscid Il2rgtm1Wjl使用铯-137辐照仪对/SzJ（NSG）免疫缺陷小鼠进行2.7 Gy（270 Rad）剂量的照射。
      注意：NSG 小鼠免疫系统严重缺陷，因此其饲养和维护必须符合最高健康标准，并由经过高度培训的人员操作。
    2. 将胸腺组织块和培养基从培养瓶倒入60 mm培养皿中。将PBS倒入另一60 mm培养皿中，用于清洗穿刺针并保持肾脏湿润。
    3. 将正向置换移液器吸头置于冰上预冷的1.5 ml无菌螺口管中进行冷却。与干燥的细胞沉淀及凝胶状蛋白混合物（如Matrigel）一同置于冰上保存。
      注意：在装载植入针之前，必须始终将胶状蛋白质混合物以及任何会接触该混合物的离心管或枪头保持低温。
    4. 麻醉小鼠：分别称量每只小鼠的体重并记录；通过耳缘打孔对小鼠进行编号。经腹腔注射 15 µl 按每克体重给予氯胺酮（2.6 mg/ml 生理盐水溶液）/赛拉嗪（100 mg/ml 生理盐水溶液）。将小鼠放回笼中，等待其完全麻醉。
      注意：通过轻捏小鼠足掌检查其麻醉程度。若小鼠出现反射性退缩反应，需追加原剂量25–50%的氯胺酮/赛拉嗪以加深麻醉。待小鼠无反射性退缩反应后，方可进行手术。
    5. 使用Oster剃毛器，将每只小鼠从背部中线至腹部之间的左侧区域（从肩部到髋部）剃毛。皮下注射0.3 ml稀释后的卡洛芬（6 mg/kg），注射部位为肩部或腹股沟三角区（腿窝）。用棉签蘸取少量人工泪液，滴一滴于每只小鼠的眼部，然后将小鼠侧卧放回笼中。 
      注意：每次手术准备应限于一个鼠笼（约4至5只小鼠）。
    6. 用 PBS 冲洗 16 号癌细胞植入针（套管针）的套管部分。使用一对钝头弯镊，将 60 mm 培养皿中的一块胸腺组织放入套管开口处，使套管针略插入开口内，然后回拉套管针，将组织吸入套管中。
    7. 使用正向置换移液器和预冷的吸头，将5 µl冷的凝胶状蛋白混合物加入含有干燥细胞沉淀的离心管中（植入细胞为CD34+和CD34-混合物），轻轻搅拌以形成细胞悬液。切勿反复吹打。将凝胶状蛋白混合物/细胞悬液移入套管开口处，缓慢回拉针芯，以完成针头的装填。
      注意：建议由助手协助加载移液器，而操作者专注于操控植入针。
    8.  用聚维酮碘擦拭小鼠的脱毛区域，随后用酒精棉片擦拭该区域三次。在皮肤下确定颜色最深的部位，此部位即为脾脏所在位置。肾脏位于脾脏背侧约5 mm处。用弯头镊子提起皮肤，用手术剪在皮肤上沿脾脏方向做一条长约15 mm的切口。随后在下方腹膜层做相似切口。在雄性小鼠中，肾脏应清晰可见，仅需轻压腹部即可使其突出。可用止血钳或一对弯头钝头镊子支撑肾脏。在雌性小鼠中，卵巢常阻碍肾脏的顺利暴露。使用止血钳提起卵巢，小心地将肾脏暴露出来。
    9. 使用尖头镊子在肾包膜的后端夹出一个微小的孔。
      注意：请勿使用这些尖头镊子处理生物危害性材料。
    10. 将植入针滑入此孔并沿肾脏推进，直至套管开口完全被肾包膜覆盖。
    11. 轻轻将组织从肾包膜下推出，然后将针头缓缓退出。胸腺组织碎片可能具有黏性，因此需使用弯头镊子确保胸腺碎片不随针头带出。
    12. 用镊子提起腹膜，用止血钳轻轻将肾脏推回原位。使用4-0薇乔可吸收缝线在腹膜上缝合一针双结缝合线。使用两个自动夹伤口夹闭合皮肤。
    13. 将预留用于注射的转导CD34+细胞混匀，吸取100 µl（0.5x10⁶）6 将细胞注入胰岛素注射器中，通过眶后静脉注射或其他静脉注射途径将细胞注入小鼠体内。用棉签在每只眼睛上滴一滴人工泪液，并将小鼠侧放回笼中。
    14. 所有小鼠植入操作完成后，在离开前需确认动物已恢复意识且能够正常行走。
    15. 术后护理：手术后第二天，皮下注射 0.3 ml 稀释的卡洛芬（6 mg/kg）和 1.2 ml 向每只小鼠注射1.5 ml无菌生理盐水。术后第2天和第3天，每只小鼠皮下注射1.5 ml无菌生理盐水。术后连续10-14天观察小鼠状态及切口情况。10-14天后拆除自动缝合夹，并称量小鼠体重。注意：小鼠在辐射后活动减少，注射生理盐水可防止动物脱水。
    16. 8至10周后，通过采血并对外周血进行FACS分析来检测移植情况，检测标记物如CD45、CD3、CD4、CD8以及载体应表达的任何基因。

2. 基因修饰细胞分化与发育的表征

  1. 外周血基因修饰细胞的表征
    1. 移植后8至10周，通过小鼠眼后静脉采血获取50–100 μl血液，置于含有10 μl EDTA的微量离心管中。以350 × g离心3分钟，收集血浆。若小鼠感染HIV，则将血浆于-80°C冷冻保存，用于ELISA分析或血浆病毒载量检测。
    2. 加入2 ml NH4Cl（83%）溶液以裂解红细胞，在室温（25 °C）孵育5分钟。孵育结束后，加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基至管满，以300 × g离心5分钟。小心吸除上清液。细胞即可用于免疫染色、流式细胞术分析及其他检测。
      注：可在HIV感染前后每两周通过流式细胞术检测各类造血细胞谱系标志物、活化标志物以及初始或记忆细胞的表型标志物。设门依据同型对照染色结果确定。建议同时染色健康人外周血单个核细胞（PBMCs）作为阳性对照。或者，可处死小鼠并通过心脏穿刺获取最多1 ml外周血，足以支持多个流式分析抗体组合的检测17。
  2. 脾脏、胸腺和骨髓中基因修饰细胞的表征
    1. 从人源化BLT小鼠中收获脾脏、胸腺和骨髓
      1. 使用过量异氟烷处死小鼠，并通过辅助性颈椎脱位确认死亡。用70%乙醇喷洒尸体表面，防止毛发污染组织。将小鼠四肢固定于石蜡解剖盘上。
      2. 使用手术剪剪开皮肤，再剪开腹膜层以暴露体腔。
      3. 用镊子取出脾脏。用镊子和剪刀从肾脏处取出胸腺移植物。将胸腺移植物和脾脏分别放入含有5 ml PBS的标记管中。
      4. 从腹部中段切开，去除覆盖下肢远端的皮肤。
      5. 用剪刀剪除下肢肌肉组织，小心将髋臼从髋关节脱位，取出股骨和胫骨，并将其置于含有5 ml PBS的试管中。
    2. 脾细胞的分离
      1. 将100 µm细胞筛置于50 ml锥形管上，用3 ml含10% FBS及青霉素-链霉素（Pen/strep）的RPMI完全培养基润湿细胞筛。
      2. 将脾脏置于细胞筛上，使用10 ml注射器的橡胶推杆研磨脾脏，使其通过筛网进入50 ml锥形管中。
      3. 用5 ml RPMI完全培养基冲洗细胞筛4至5次。
      4. 以300 × g离心10分钟。
      5. 吸除上清液，将沉淀重悬于5 ml红细胞裂解液中，室温孵育10分钟。加入20 ml RPMI完全培养基，以300 × g离心7分钟。
      6. 吸除上清液，将沉淀重悬于10 ml RPMI完全培养基中，再次通过100 µm细胞筛过滤。使用血细胞计数板进行细胞计数。
        注：细胞可用于离体（ex vivo）实验、流式分析，并可活力冻存以备后续使用。在细胞计数前，可使用台盼蓝染色评估活细胞比例。
    3. 从移植物中分离人源胸腺细胞
      1. 将胸腺组织放入6孔板的一个孔中，加入5 ml PBS。使用洁净的钝头镊子和剪刀将胸腺剪成小块。
      2. 将灭菌的不锈钢网片放入孔中，使用10 ml注射器的橡胶推杆在不锈钢网上研磨胸腺组织，使其充分解离。
      3. 充分重悬细胞后，通过100 µm细胞筛过滤。以300 × g离心10分钟，将细胞重悬于10 ml RPMI完全培养基中。若可见细胞团块，需将重悬液再次通过细胞筛过滤。
      4. 使用血细胞计数板进行细胞计数。
        注：细胞可用于流式分析，并可活力冻存以备后续使用。
    4. 骨髓细胞的分离
      1. 用70%乙醇清洁并灭菌研钵和研杵。将股骨和胫骨放入研钵中，加入5 ml冷PBS。使用研杵研磨骨骼，直至PBS变为淡粉色且浑浊。
      2. 用移液器吸取研钵中的液体，通过置于50 ml锥形管上的50 µm细胞筛过滤。用5 ml PBS冲洗研钵，重复操作五次，直至PBS变澄清。
      3. 以300 × g离心7分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于10 ml RPMI完全培养基中。
      4. 使用血细胞计数板进行细胞计数。
        注：细胞可用于离体（ex vivo）实验、流式分析，并可活力冻存以备后续使用。

3. 基因修饰细胞的功能表征 

  1. HIV 感染及随时间监测病毒复制
    1. 在确认人免疫系统重建后，使用胰岛素注射器经眶后静脉注射所需量的 HIV 病毒。HIV 感染后，每 2 周通过眶后采血收集 100 μl 外周血。
    2. 按照第 2.1.1–2.1.2 步骤制备血浆。进行 HIV 病毒载量检测时，使用 RNA 提取试剂盒提取病毒 RNA（按照制造商说明书操作），并采用针对所用 HIV 病毒的特异性引物和探针组，通过实时 RT-PCR 测定病毒载量4,8,18,19。
    3. 为检测细胞相关 HIV RNA 并鉴定被 HIV 活跃感染的细胞，首先按照步骤 2.1.2 进行红细胞裂解。
    4. 将细胞悬液重悬于 1 ml PBS 中，均分至两个离心管中。以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。
    5. 为检测细胞相关 RNA，使用 RNA 提取试剂盒提取 RNA（按照制造商说明书操作），并使用适当的引物和探针组进行实时 RT-PCR。
      注意：所用引物/探针必须不能识别用于修饰干细胞的慢病毒
    6. 为通过流式细胞术检测 HIV 感染细胞，将另一管中的细胞重悬于 50 μl FACS 缓冲液中，使用目标抗体（如抗 CD45、抗 CD4 和抗 CD3 抗体）进行表面染色。表面染色后，固定并透化细胞，使用抗 Gag 抗体（克隆 KC57）对 Gag 蛋白表达进行胞内染色，随后进行流式细胞术分析。
  2. 体外 脾细胞中基因修饰细胞的细胞因子检测
    1. 按照第 2.2.2 节所述方法分离小鼠脾细胞。
    2. 制备靶细胞。为检测经 CD4 嵌合抗原受体修饰的 T 细胞的功能，使用 HIV 感染的 T1 细胞作为靶细胞。在细胞因子检测前 3 天用 HIV 感染 T1 细胞，并通过抗 HIV Gag 抗体（克隆 KC57）胞内染色确认感染。未感染的 T1 细胞作为对照靶细胞。
    3. 将脾细胞与靶细胞或对照细胞以 1:1 比例共孵育过夜。为获得最佳结果，建议设置效应细胞（脾细胞）与靶细胞（感染的 T1 细胞）的梯度比例（1:1、1:3、1:9）。例如，将 90 万脾细胞重悬于 0.25 ml 完全 RPMI 培养基中，加入分别重悬于 0.25 ml 完全 RPMI 培养基中的 90 万、30 万或 10 万 HIV 感染 T1 细胞或未感染 T1 细胞。
    4. 次日早晨，加入蛋白转运抑制剂孵育 6 小时以阻断蛋白转运，并按照先前文献8所述方法进行细胞外标志物染色及细胞内细胞因子表达检测。

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结果

图1展示了利用基因修饰干细胞构建人源化BLT小鼠的示意图。在移植手术后10周，处死小鼠以评估基因修饰细胞的分化与发育情况。如图2所示，从一只经CD4ζCAR修饰的小鼠中获取了多种淋巴组织（血液、脾脏、胸腺和骨髓）。本实验方案中使用的CD4ζCAR包含CD4嵌合抗原受体和GFP，可通过抗CD4抗体以及GFP8的表达进行检测。分离细胞后，使用抗人CD45抗体及抗CD4抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分析。检测到GFP与CD4双阳性细胞，表明CD4CAR+细胞存在于多种淋巴组织中。

为了研究基因修饰细胞的分化情况，使用针对人CD45（淋巴细胞）、CD3（T细胞）、CD19（B细胞）、CD14（单核细胞和巨噬细胞）以及CD337（NK细胞）的抗体对脾细胞进行染色。如图3所示，CD4ζCAR造血干细胞可分化为多种细胞谱系。

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讨论

随着基于CAR和造血干细胞（HSC）的工程化免疫疗法逐步推进至临床研究阶段，建立合适的动物模型以深入研究这些工程化细胞的分化与功能显得尤为重要。在本方案中，我们描述了构建和测试携带经基因修饰、靶向HIV的人源化小鼠的方法。在移植前实现干细胞的高效转导至关重要。然而，由于T细胞在识别靶细胞后具有增殖能力，即使干细胞的修饰水平较低，也足以产生针对HIV复制的强效免疫应答8。

然而，为了实现高效的干细胞修饰，我们建议在小鼠手术中使用经转导的 CD34+ 细胞与自体胸腺组织共同植入，而不是采用此前文献中描述的肝脏和胸腺组织块13-15。明胶样蛋白混合物是一种富含细胞外基质蛋白的可溶性组织基底膜。在正常生理条件下，明胶样蛋白混合物可聚合形成重建的、具有生物学活性且稳定的基质，从而有效促进干细胞的黏附与分化20。术后6至8周可通过眶后静脉取血并结合流式细胞术检测人源细胞的重建情况。为确保载体对干细胞的存活与自我更新无毒性，建议在实验前按照1.2.6节所述方法在CD34+细胞中对载体进行滴度测定。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢杰西卡·塞兰德女士在制作图表过程中提供的艺术协助。本研究由美国国家过敏与传染病研究所/国立卫生研究院（NIAID/NIH）资助，项目编号RO1AI078806；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR），项目编号P30AI28697；加州再生医学研究所，项目编号TR4-06845；美国艾滋病研究基金会（amfAR），项目编号#108929-54-RGRL；以及加州大学多校区研究计划与倡议、加州抗病毒药物发现中心（CCADD）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CD34 微珠试剂盒Miltenyi130-046-702用于分选人 CD34+ 祖细胞
BambankerWako302-14681用于细胞冻存
QIAamp 病毒 RNA 试剂盒 Qiagen52904用于检测血清中的病毒载量
MACSQuant 流式细胞仪Miltenyi用于流式分析
BD LSRFortessa™BD biosciences用于流式分析
透明质酸酶SigmaH6254-500MG 用于组织消化
脱氧核糖核酸酶 I      WorthingtonLS002006 用于组织消化
胶原酶Life technology17104-019 用于组织消化
CFX 实时荧光定量 PCR 检测系统Biorad用于检测病毒载量和基因表达
小鼠品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJThe Jackson Laboratory5557用于构建人源化小鼠
青霉素-链霉素（Pen Strep）Thermo Fisher Scientific10378016用于细胞培养
哌拉西林/他唑巴坦PfizerZosyn抗真菌
两性霉素 B（Fungizone 抗真菌剂）Thermo Fisher Scientific15290-018抗真菌
自动夹伤口夹，9 mm，1000 个/盒Becton Dickinson427631 用于手术
无菌聚酯加强型 Aurora 外科手术服，每箱 30 件      MedlineDYNJP2707 用于手术
缝线，4-0，Vicryl          Owens and Minor23000J304H  用于手术
酒精消毒片          Owens and Minor3583006818用于手术
外科手套，6.5 号Owens and Minor4075711102用于手术
Yssel’s 无血清 T 细胞培养基Gemini Bio-products400-102用于 CD34+ 细胞转导
人血清白蛋白 Sigma-AldrichA9511用于 CD34+ 细胞转导

参考文献

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干细胞基因治疗CD4嵌合抗原受体造血干细胞流式细胞术分析BLT小鼠构建眶后注射HIV感染模型NSG-BLT小鼠
基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染
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