方法文章

干细胞基工程免疫抗HIV感染的人性化小鼠模型

DOI：

10.3791/54048

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2016年7月2日

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1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

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该协议描述了构建人源化骨髓/肝脏/胸腺小鼠模型的方法，该模型具有基于干细胞的工程免疫力，可抵抗 HIV 感染。

摘要

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与基于细胞干基因疗法的快速发展对抗HIV，有迫切要求的用于动物模型来研究所述遗传修饰的细胞的造血细胞分化和免疫功能。人源化的骨髓/肝脏/胸腺（BLT）小鼠模型允许在周围的人的免疫系统，其包括T细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞的完整的重建。人胸腺植入物还允许在自体胸腺组织的T细胞的胸腺选择。除了感染艾滋病毒的研究中，模型矗立作为一个强大的工具来研究造血干细胞（HSCs）的细胞的分化，发育和功能。在这里，我们勾勒出人性化的非肥胖型糖尿病（NOD）的建设-严重联合免疫缺陷病（SCID）中的常见γ链基因敲除（Cγ - / - ）-Bone骨髓/肝脏/胸腺（NSG-BLT）小鼠造血干细胞转导与CD4嵌合抗原受体（CD4CAR）慢病毒载体。我们表明，CD4CAR造血干细胞可以成功地分化成多种谱系，并有抗HIV活性。该研究的目的是说明使用NSG-BLT小鼠模型的作为抗HIV工程化免疫的体内模型。值得注意的是，因为慢病毒和人体组织时，实验和手术应该在II级生物安全柜与特殊的预防措施（BSL2 +）设施执行在生物安全等级2（BSL2）。

引言

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尽管联合抗逆转录病毒治疗的成功，HIV感染仍然是一个终身疾病。抗HIV细胞免疫反应在控制HIV复制非常重要的作用。在干细胞处理的最新进展已经允许基因治疗的飞速发展途径HIV治疗1-3。其结果是，它有一个适当的动物模型，它允许在抗HIV基于细胞的疗法的效力的体内研究是非常重要的。

在动物模型中与HIV的工作是由一个事实，即病毒只感染人类细胞复杂。为了规避这一限制，科学家们开始借助疾病模型像猕猴4,5猴免疫缺陷病毒（SIV）。不幸的是，在此模型中，由于跨物种的固有差异和SIV和HIV之间的差异主要限制。此外，只有高度专业化的设施是C支持工作，非人类灵长类动物，每个猕猴apable需要大量的投资。因此，为模型中的迫切需要，利用人的免疫系统，这是易受HIV感染/发病机制，并且是较少财政望而却步。

非肥胖糖尿病（NOD） -严重联合免疫缺陷（SCID）-commonγ链基因敲除（三γ - / - ）（或NSG）血液/肝脏/胸腺（BLT）的人源化小鼠模型日益被证明是一个重要的工具以研究艾滋病病毒感染。通过注入的造血干细胞（HSC）以及胎胸腺，小鼠能够开发和概括一个人免疫系统1-3。基于干细胞的基因治疗的一种类型涉及'重定向'的外周T细胞重新编程造血干细胞（HSC）能够分化为....

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方案

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伦理声明:人类胎儿组织是从高级Biosciences的资源或从Novogenix获得并未经识别信息，不需要为它的使用的IRB批准得到。在这个手稿中描述的动物研究是加州大学洛杉矶分校和分校（UCLA）的动物研究委员会（ARC）的按照所有联邦，州和地方的指导方针书面同意下进行。具体来说，这些研究是在严格按照该指南的关怀和全国研究委员会实验动物的使用和认可，并为实验动物的评估和认可委员会（AALAC）协会的指导原则中的指导原则进行国际加州大学洛杉矶分校在ARC协议编号2010-038-02B。所有手术均在氯胺酮/甲苯​​噻嗪和异氟醚麻醉下进行并作出一切努力，以尽量减少动物的痛苦和不适。

1.人性化小鼠的构建CD4嵌合抗原受体工程化

  1. 处理胎儿胸腺和胎肝隔离CD34 +造血干细胞
    1. 胸腺处理
      1. 轻轻洗磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH值7.4，胸腺在15ml锥形管中。重复洗涤步骤3 - 4倍。
      2. 添加7毫升RPMI培养基+ 10％FBS +青霉素/链霉素。倒出一切进入无菌百毫米培养皿。
      3. 使用解剖刀到胸腺切成小块的约1mm 2。放置在单个井的每一个胸腺片在96孔板中。利用转印胸腺件到96孔板时弯曲的钝钳。
        1. 的媒体少量添加（100 - 200微升）到所有的孔中，....

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结果

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图1显示了构建具有修饰的干细胞源化的BLT小鼠的轮廓。植入手术10周后，处死小鼠，以评估基因修饰细胞的分化和发育。 如图2中所示，多个淋巴组织（血液，脾，胸腺和骨髓）中从使用CD4ζCAR改性的小鼠收获。在这个协议中使用的CD4ζCAR包含可由抗CD4抗体和GFP 8的表达进行检测的CD4嵌合抗原受体和GFP。细胞分离并用抗人CD45抗体，以及抗CD4抗体染色，并通过流式细胞仪分析。 GFP和CD4双阳性细胞中检测到，这表明CD4CAR +细胞在多种淋巴组织的存在。

调查该基因修饰的细胞的分化，脾细胞与抗人CD45（淋巴细胞），CD3（T细胞），CD19（B细胞），CD14（单核细胞和巨噬细胞）和CD337（NK细胞）抗体染色。正如图3所示，CD4ζCAR造血干细胞分化成多种谱系。

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讨论

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与汽车和走向临床研究基于HSC工程免疫力蓄势待发，它有一个合适的动物模型来仔细研究这些工程细胞的分化和功能是非常重要的。在这个协议中，我们描述的构建和测试与设计的抗HIV基因修饰的干细胞小鼠人性化的方法。有前移植干细胞的有效转导是重要的。然而，由于T细胞在识别靶细胞增殖的能力，干细胞修饰的低含量足以产生针对HIV复制8健壮响应。

然而，要实现干细胞修饰水平高，我们建议使用转CD34 +细胞与自体胸腺代替肝脏和别处已经13-15描述了小鼠胸腺手术大块胶状蛋白质混合物。胶状蛋白质混合物是solubilizED组织基底膜含有丰富的细胞外基质蛋白。在正常生理条件下，胶状蛋白质混合物聚合，以产生一个复原的，生物活性和稳定的基质，将允许干细胞20的有效附着和分化。人类细胞重建可以通过眼眶后出血检查和流式细胞仪6 - 8周手术后。为了确保载体是没有毒性为干细胞存活和更新，它被推荐为在1.2.6描述的滴度在实验前的CD34 +细胞的载体。

核供应国集团-BLT小鼠模型的能力，.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们要感谢 Jessica Selander 女士为我们制作图表提供的艺术助理。这项工作由 NIAID/NIH 的赠款资助，赠款号。RO1AI078806，加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心 （CFAR），资助号。P30AI28697，加州再生医学研究所，授予号。TR4-06845，美国艾滋病研究联合会 （amfAR），授权号。#108929-54-RGRL 以及加州大学多校区研究计划和倡议，加州抗病毒药物发现中心 （CCADD）

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CD34 微珠试剂盒Miltenyi130-046-702用于分选人 CD34+ 祖细胞
BambankerWako302-14681用于冷冻细胞
QIAamp 病毒 RNA 试剂盒 Qiagen52904用于测量血清中的病毒载量
MACSQuant 流式细胞仪Miltenyi用于流式分析
BD LSRFortessa™BD biosciences用于流式分析
透明质酸酶SigmaH6254-500MG 用于组织消化
脱氧核糖核酸酶 I      沃辛顿LS002006 用于组织消化
胶原酶Life 技术17104-019 用于组织消化
CFX 实时 PCR 检测系统Biorad用于测量病毒载量和基因表达
小鼠、菌株 NOD。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ杰克逊实验室5557用于构建人源化小鼠
青霉素 链霉素 （Pen Strep）Thermo Fisher Scientific10378016用于培养细胞
哌拉西林/他唑巴坦辉瑞Zosyn抗真菌
两性霉素 B （Fungizone 抗真菌剂）Thermo Fisher Scientific15290-018抗真菌
自动夹式绕线夹，9 毫米 - 1,000 个克顿·狄金森427631 用于外科手术
无菌聚乙烯增强 Aurora 手术衣，每箱 30 件      MedlineDYNJP2707 用于外科手术
缝合线， 4-0， vicryl          欧文斯和米诺23000J304H  用于外科手术
酒精制备垫          Owens 和 Minor3583006818手术
手套，外科手套，6 1/2Owens 和 Minor4075711102手术
Yssel's 无血清 T 细胞培养基Gemini Bio products400-102用于 CD34+ 细胞转导
人血清白蛋白 Sigma-AldrichA9511用于 CD34+ 细胞转导
贝用

参考文献

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  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P.....

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标签

CD4 BLT HIV NSG BLT

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