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方法文章

皮肤外科去神经术：一种用于检测神经在小鼠皮肤疾病模型中作用需求的方法

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DOI：

10.3791/54050

⸱

2016年6月26日

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文包含小鼠皮肤遗传标记、手术去神经、皮肤活检以及通过整体β-半乳糖苷酶染色观察标记上皮的详细实验方案。这些方法可用于检测在正常及病理皮肤小鼠模型中神经所必需的作用。

摘要

皮肤体感神经的功能是检测作用于皮肤的各种刺激。除了已知的感觉功能外，近期研究还表明神经可能调节特应性皮炎、银屑病和皮肤癌等多种皮肤疾病。本文中，我们描述了检测神经在维持皮肤机械感受器官——触觉圆顶（touch dome, TD）结构中所起作用的实验方案。具体而言，我们讨论了通过整体染色法对TD进行遗传标记、取材和可视化观察的技术，以及在小鼠背部皮肤实施单侧手术去神经的方法。结合这些方法，可直接在同一动物的去神经皮肤与假手术对照皮肤之间比较TD的形态学特征和基因表达情况。这些技术也可轻松应用于各类小鼠皮肤病理模型，以研究神经在其中的作用。此外，皮肤组织可多次取样，使得研究人员能够在疾病发生发展的不同阶段和时间点动态监测病情进展。

引言

近年来，人们越来越认识到神经对那些通常不被视为经典神经病变的疾病具有重要影响1-4。在皮肤中，最新的实验证据表明，感觉神经可调节多种病理过程，范围从银屑病到癌症5-9。这些发现是通过在啮齿类动物中采用手术去神经化以及药理学手段抑制神经功能等技术实现的。以银屑病为例，这些研究为理解人类银屑病斑块在神经功能丧失后发生退行的机制提供了理论框架7,10-12。

皮肤神经还能影响基因表达13,14，并在正常皮肤的机械感知中起关键作用15。特别是，触觉圆顶（TD）上皮由一群柱状表皮细胞构成，其内含有神经内分泌型的默克尔细胞，并由慢适应1型（SA1）神经纤维支配16-18。TD介导轻触觉感知，且已被证实存在Hedgehog信号通路活性5,19。TD的维持依赖于神经支配20,21，因为神经元可分泌Hedgehog配体，以维持正常的TD及其相关的默克尔细胞19。此外，神经支配还能促进TD上皮中依赖Hedgehog通路的肿瘤形成5。这些研究共同强化了一个观点：神经与其微环境中周围细胞之间发生的复杂分子相互作用，对于TD的正常生理功能以及疾病发生均至关重要。

为了探究这些相互作用的性质，本文描述了一系列 体内 用于操控TD中基因表达的技术，以及在谱系示踪后采集皮肤活检以观察TD的方法。最后，我们描述了单侧手术去神经的操作流程，即去除小鼠背部皮肤一侧的神经，而对侧保持完整，作为假手术内部对照。手术数周后，比较去神经侧与假手术对照侧的皮肤，以评估神经消融后发生的变化。尽管这些技术是在正常TD的背景下进行描述的，但去神经手术已被用于研究在小鼠银屑病模型中神经所发挥的必要作用6，伤口愈合13 和肿瘤发生5最后，由于皮肤适合进行多次活检，这为长期监测标记细胞的命运或在多个时间点评估疾病进展提供了机会。

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方案

本方案中描述的所有操作均按照密歇根大学实验动物医学单位制定的规定进行。

1. 在小鼠中诱导基因重组

注意：Gli1tm3(cre/ERT2)Alj/J 小鼠品系（Gli1-CreERT2）13 可实现他莫昔芬诱导的基因重组在胸腺上皮细胞中的靶向表达。将该品系与 B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J 报告小鼠（LacZ）22 杂交，以获得 Gli1;LacZ 小鼠，用于后续通过整体染色法可视化胸腺细胞。

  1. 将他莫昔芬溶液配制为浓度 12.5 mg/ml 的玉米油溶液。
    1. 在 1.5 ml 离心管中加入最多 20 mg 结晶态他莫昔芬，然后加入 1 ml 玉米油。将管子牢固地固定在涡旋振荡器上，在室温下以最高转速持续涡旋，直至他莫昔芬完全溶解（2–4 小时），通过体视显微镜观察确认管内无他莫昔芬颗粒残留。
    2. 将溶液转移至 15 ml 离心管中，用额外的玉米油稀释，使他莫昔芬终浓度为 12.5 mg/ml。通过涡旋振荡黏稠溶液 30 秒以充分混匀。该溶液可在 4 °C 避光条件下储存最多 1 周。
  2. 将他莫昔芬溶液按每 20 g 小鼠体重 200 µl 的体积，通过腹腔注射方式注入 Gli1;LacZ 小鼠体内，使每 20 g 体重小鼠接受的有效他莫昔芬剂量为 2.5 mg。

2. 收集皮肤活检样本

注意：根据实验需求，在他莫昔芬诱导后的数天至数周内采集皮肤活检样本。 所有手术操作均应遵循啮齿类动物手术的标准规程，包括使用无菌手套、佩戴外科口罩或头网，并在手术过程中用无菌手术单覆盖动物。

  1. 通过将90 mg/ml的氯胺酮和6.5 mg/ml的赛拉嗪溶于水中，配制10倍浓度的麻醉剂储备液。使用前将该储备液用无菌PBS按1:10比例稀释，并在室温避光条件下保存，最长可保存8个月。
    1. alternatively，可通过异氟烷吸入对小鼠进行麻醉，起始气体浓度为4%（以氧气为载气）以实现充分麻醉，随后将浓度降至1-2%，维持至手术结束。
  2. 以每20 g小鼠体重200 µl的剂量，将麻醉剂溶液经腹腔注射。通过脚趾夹捏试验检查动物是否达到适当的麻醉深度，并确认心率和呼吸频率正常（分别约为600次/分钟和160次/分钟）。
  3. 使用电动剃毛器小心去除背部背侧活检区域的毛发，注意避免划伤或损伤下方皮肤。
  4. 用碘伏和酒精棉片从前向后擦拭剃毛区域，完成手术部位准备，并确保清除所有毛发碎屑。
  5. 用黑色记号笔标出活检区域，将动物置于无菌手术区域的加热垫上，并覆盖无菌手术巾（为便于演示，此处省略了无菌手术巾以提高可见性）。   
    注意：为了获得毛囊的纵切面，活检区域的长边（用于组织学切片的一边，约1 cm）应沿前后方向（与毛囊走向平行），位于背部中线旁的旁矢状面（图1A）。
  6. 使用无菌#11手术刀沿标记区域进行全层皮肤切除，注意不要损伤下方肌肉筋膜。
    注意：切除的皮肤组织包括表皮、真皮、皮下脂肪和肉膜肌（panniculus carnosus）。通常出血量极少。
  7. 将切除的皮肤样本平铺于干燥的纸巾上，真皮面朝下，修剪掉多余的纸巾。若需等待其他样本采集完成，可将样本置于冷PBS中保存不超过1小时。准备就绪后，进入步骤3.1或3.2进行组织学处理，或进入步骤4进行整体β-半乳糖苷酶（LacZ）染色。
  8. 使用6-0尼龙缝线，以间断简单缝合方式关闭活检创口，缝线间距约为3 mm。
  9. 手术后的小鼠在完全恢复前不得与其他动物同笼饲养。
  10. 手术后立即对动物进行监测，直至其恢复意识，并在术后每日观察直至手术部位愈合，通常在1周内完成。若小鼠出现疼痛或不适迹象，应根据指定的机构动物护理与使用指南给予镇痛药物。术后7-10天内拆除缝线。
    注意：如需配制镇痛剂溶液，可将卡洛芬（50 mg/ml储备液）用无菌水按1:100稀释。以每20 g体重200 µl的剂量（即5 mg/kg小鼠体重），在肩胛间区域靠近颈背部皮肤皱褶处进行皮下注射。

3. 组织学样品处理

注意：根据应用需求，使用以下任一方法对切除的组织进行固定和处理。

  1. 为制备石蜡包埋的组织学样本，将皮肤在室温下用 PBS 中 3.7% 的甲醛固定过夜，随后转移至 70% 乙醇中保存，最长可保存 2 周。包埋前需去除纸巾。
  2. 为制备冷冻组织学样本，将组织浸入预冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中，轻轻振荡孵育 1 小时。移除溶液后，用 PBS 洗涤样本三次，每次约 5 分钟。随后将样本浸入含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中以进行组织冷冻保护（"蔗糖沉降"）。
  3. 在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜。次日，去除纸巾，并从皮肤真皮侧修剪掉多余的脂肪组织。直接将组织包埋于 OCT 包埋剂中，并将冷冻组织块保存于 -80 °C。
    注意：切片后，无论是石蜡包埋样本还是冷冻样本，均可通过免疫组织化学染色鉴定触觉小体（TDs）、默克尔细胞和神经纤维，分别使用针对角蛋白 17（Keratin 17）、角蛋白 8（Keratin 8）和神经丝蛋白（Neurofilament）的抗体，具体方法如先前所述5,19。

4. 通过整体 LacZ 染色观察样品

  1. 制备 X-gal 染色液。
    1. 将 0.94 g 磷酸二氢钠和 2.6 g 磷酸氢二钠溶于 250 ml 无菌水中，调节 pH 至 7.3。向该溶液中加入 0.5 ml 1 M 氯化镁、0.528 g 亚铁氰化钾和 0.412 g 铁氰化钾。再加入 250 µl 辛基苯基聚乙二醇和 125 mg 脱氧胆酸钠。基础溶液可在避光条件下于 4 °C 保存最多 6 个月。
    2. 通过向 X-gal 储存液瓶中加入二甲基甲酰胺，配制 50 倍浓缩的 X-gal 储存液，使其浓度为 50 mg/ml。将该溶液避光保存于 -20 °C。
    3. 使用前，将 X-gal 储存液按 1:50 比例稀释至 X-gal 基础溶液中，制成染色液。对于较小的活检样本（<1 cm2），每份样本加入 1–2 ml 染色液。
  2. 将第 2.7 步采集的皮肤样本置于含有 2% 多聚甲醛和 0.2% 戊二醛的冷 PBS 溶液中固定 30 分钟，于冰上轻轻振荡。对于较小的活检样本（<1 cm2），每份样本使用 1–2 ml 固定液。
    注意：也可选择仅使用 2–4% 多聚甲醛或仅使用 0.5% 戊二醛进行固定。最佳固定条件取决于组织类型、LacZ 表达水平及具体应用。
  3. 去除固定液，用 PBS 洗涤样本三次，每次 5 分钟，在室温下振荡洗涤。
  4. 移除样本下方的滤纸，用钝头镊夹住真皮侧的脂肪组织，使用解剖剪剪除多余的脂肪组织。
  5. 将样本完全浸入 X-gal 染色液中，于 37 °C 过夜孵育。LacZ 表达可在解剖显微镜下观察到蓝色染色（图 1B）。
    注意：若信号强度较弱，可于次日更换染色液并再次过夜孵育。若背景染色过强，可缩短染色时间，或将样本在室温而非 37 °C 下孵育。
  6. 去除染色液，用含 3% DMSO 的 PBS 洗涤样本三次，每次约 5 分钟，在室温下轻轻振荡。
  7. 用 70% 乙醇洗涤样本 2–3 次，每次 5 分钟 。将样本保存于 70% 乙醇中。

5. 手术去神经

  1. 按照步骤 2.2 对动物进行麻醉，并剃除整个背部皮肤的毛发。
  2. 使用聚维酮碘和酒精棉片准备背部手术区域， 并用无菌手术巾覆盖动物（出于演示目的，省略了无菌手术巾以提高可见性）。在无菌手术环境中操作时，使用加热垫保持动物体温。
  3. 使用无菌的 #11 手术刀沿背部中线从颈部基部至尾部上方约 0.5 cm 处做一切口。
  4. 使用钝头镊子轻轻将左侧皮肤从侧腹区掀开，以观察从颈部附近的肩胛脂肪垫至后肢上方的皮下组织。
    注意：背侧皮神经表现为白色条索状结构，穿过躯干壁半透明的筋膜向尾端走行，在进入皮肤下方疏松结缔组织前会形成明显的弯曲（图 2）。
  5. 在解剖显微镜下使用超细镊子，仅从动物左侧 T3-12 节段解剖位置处拔除神经，操作范围从神经在躯干壁弯曲处至其穿入皮肤的部位（图 2）。
    1. 将镊子垂直放置，夹住神经弯曲点下方约 0.5 cm 处，向上牵拉，使神经拉伸并从周围组织分离（图 2C-E）。注意避免撕裂邻近的血管。
    2. 持续操作直至所有从躯干壁延伸至皮肤的神经均被去除。切勿破坏躯干壁致密筋膜内的神经。在整个操作过程中，定期滴加无菌 0.9% 氯化钠溶液以保持组织湿润。
    3. 或者，可用镊子夹住神经近端靠近躯干壁的位置，用精细剪刀剪断；随后，在靠近皮肤处切断远端（图 2F-H）；最后，移除中间的神经节段（图 2I）。
  6. 去除步骤 5.4 中暴露的皮瓣上的任何残留神经。这些纤维为背侧皮神经的远端分支，表现为在皮瓣真皮侧结缔组织中零星分布的白色分枝状细丝（图 2J-K）。
    1. 为去除这些细小分支，将精细镊子大致平行于真皮表面放置，夹住神经后向上拔除，以避免损伤血管或刺穿皮肤。持续操作直至所有可见神经均被清除。
  7. 通过钝性分离，将背中线切口右侧的皮肤掀开，但不切除神经。该侧将作为对侧假手术对照。
  8. 采用单纯间断缝合法沿背中线缝合切口以关闭创面。术后按照前述方法（步骤 2.8–2.10）监测动物恢复情况。术后 7–10 天拆除缝线。
  9. 为在术后数周内功能性评估去神经状态是否稳定，使用电动剪刀去除背部皮肤的毛发。
  10. 使用皮下注射针轻轻刺击去神经区域的皮肤，观察动物是否出现反应（通常表现为颤抖或转头）。若该区域已稳定去神经，动物将几乎无反应或完全无反应。
  11. 使用黑色记号笔标记无反应区域，同时在对侧假手术侧标记大小和位置相似的区域。
  12. 按照步骤 2.1–2.9 从上述部位采集活检样本用于分析。
    注意：或者，可将整个背部皮肤（包括去神经区域和假手术区域）作为一个整体完整取下，用于全层染色，方法类似于步骤 4 中所述。

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结果

通过构建表达他莫昔芬诱导型的转基因小鼠 Gli1-CreERT2 和一个 LacZ 报告等位基因，可实现对TD上皮的可视化，并能够随时间追踪这些细胞的命运。整个去神经手术过程通常每只小鼠可在1小时内完成，且应对动物造成的不适最小。

我们之前的研究表明，神经对于维持正常的毛囊隆起（TD）及其相关的角蛋白8+ Merkel细胞均至关重要（图3A–C）5,19。神经对于促进TD中Gli1的表达也具有关键作用（图3D）。鉴于TD簇在皮肤中出现频率相对较低（图1B），为准确量化TD频率，必须取样多个冷冻切片。通常，我们从每只动物的假手术皮肤和去神经皮肤中各选取15个非连续切片（每个切片厚10 µm，长约1 cm）进行评估。去神经处理...

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讨论

神经不仅在感觉功能中起着关键作用，还在哺乳动物器官的发育、维持和再生中发挥重要作用13,24-27。由于近期研究发现神经与多种皮肤疾病相关，本文所述技术可用于研究不同动物疾病模型中皮肤神经支配的必要性。事实上，单侧去神经技术可实现对同一小鼠体内神经完整与神经受损皮肤的直接比较，从而提供理想的内部对照，以消除个体间差异的影响，后续数据分析可采用配对t检验。

尽管本文所述实验主要利用 LacZ 报告基因，但这些实验可进行调整，将 Gli1-CreERT2 等位基因与其他荧光报告基因或条件性等位基因组合，以在毛囊隆突区（TD）中调控基因表达。例如，可将 Gli1-CreERT2 小鼠与携带 Patched1 条件性等位基因的小鼠（B6N.129-Ptch1tm1Hahn/J）28 杂交，从而获得在他莫昔芬诱导后可形成源自TD的肿瘤的小鼠模型5。需要注意的是，Gli1-C...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Autumn Peterson在小鼠摄影方面的协助，Daniel Thoresen在小鼠操作方面的协助，以及Nicole Ward博士和Abdelmadjid Belkadi博士在手术去神经化方面的协助。本研究得到了美国国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（资助号R00AR059796和R01AR065409）、密歇根大学皮肤病学系、生物科学学者计划、器官发生中心、密歇根大学综合癌症中心以及John S.和Suzanne C. Munn癌症基金的资助。S.C.P.得到了美国国家普通医学科学研究所（资助号T32 GM007315）的资助。本研究还得到了美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划、癌症研究中心、国家癌症研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精消毒片PDIB339
镇静剂 AnaSed（赛拉嗪）LloydNADA 139-236
抗体，抗角蛋白 8发育研究杂交瘤库TROMA-I大鼠抗体，使用浓度为 1:500
抗体，抗角蛋白 17Cell Signaling#4543兔抗体，使用浓度为 1:1,000
抗体，抗神经丝蛋白Cell SignalingC28E10兔抗体，使用浓度为 1:500
聚维酮碘消毒片MedlineMDS093917
卡洛芬（Rimadyl）Zoetis
无线可充电剃毛剪Wahl修剪器型号 8900
玉米油Sigma-AldrichC8267
冷冻切片机LeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306使用浓度为 1:1,000
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750
脱毛膏NairN/A
二甲基甲酰胺Sigma-Aldrich319937
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418
戊二醛Sigma-AldrichG5882
ImmEdge 笔Vector LaboratoriesH-4000
盐酸氯胺酮HospiraNDC 0409-2051-05
氯化镁SigmaM8266
微型盖玻片VWR48404-454
显微载玻片VWR48311-703
10% 中性缓冲福尔马林VWRBDH0502-4LP
6-0 尼龙缝合线DemeTECHNL166012F4P
辛基苯基-聚乙二醇Sigma-AldrichI8896
O.C.T. 包埋剂Sakura Tissue-Tek4583
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
亚铁氰化钾Sigma-AldrichP9387
铁氰化钾Sigma-Aldrich702587
磷酸二氢钠Sigma-AldrichP9791
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS5136
蔗糖Sigma-Aldrich84097
他莫昔芬Sigma-AldrichT5648-1G
超细镊子Dumont0103-5-PO
Vectashield 封片剂Vector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001使用前用二甲基甲酰胺溶解，配制成 50 倍储存液

参考文献

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