Method Article

皮肤去神经外科手术:一种用于皮肤病的小鼠模型测试要求的神经方法

DOI:

10.3791/54050

⸱

June 26th, 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In This Article

Summary

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本文包括小鼠皮肤遗传标记、手术去神经支配、皮肤活检和通过整装 β-半乳糖苷酶染色可视化标记的上皮细胞的详细方案。这些方法可用于测试正常和病理皮肤的小鼠模型中对神经的需求。

Abstract

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Introduction

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在过去的几年里，人们越来越广泛地认识到神经对通常不被视为经典神经病的疾病1-4 的影响。在皮肤中，最近的实验证据表明，感觉神经可以调节从银屑病到癌症的各种病症5-9。这已经使用手术去神经支配和啮齿动物神经功能的药物抑制等技术得到证明。 在银屑病的情况下，这些研究为理解为什么人类银屑病斑块在神经功能丧失后会消退提供了一个机制框架7,10-12。

皮肤神经也可以影响基因表达13,14，并且对正常皮肤的机械感应至关重要15。特别是，触摸圆顶 （TD） 上皮细胞由一块柱状表皮细胞与由缓慢适应的 1 型 （SA1） 神经纤维支配的神经内分泌默克尔细胞16-18 组成。TDs 介导轻触觉，并已被证明显示 Hedgehog 通路活性5,19。TD 的维持取决于神经支配20,21，因为神经分泌刺猬配体以维持正常的 TD 及其相关的默克尔细胞19。此外，神经支配促进 TD 上皮细胞5 的 Hedgehog 依赖性肿瘤形成。总之，这些研究强化了这样一种观念，即神经与其生态位中的周围细胞之间发生的错综复杂的分子相互作用对于正常的 TD 生理学和疾病至关重要。

为了询问这些相互作用的性质，我们在这里描述了一系列体内技术，....

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Protocol

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在此协议中描述的所有程序按照由密歇根单位的大学实验动物医学既定法规的规定执行。

1.诱导小鼠基因重组

注:TM3 中 Gli1（CRE / ERT2）ALJ / J小鼠品系（ 中Gli1-CreERT2）13启用定向三苯氧胺诱发基因重组到TD上皮。跨越这株B6.129S4-GT（ROSA）26Sor tm1Sor / J记者小鼠（LacZ的 ）22 中Gli1产生;动物LacZ的可视化通过整个安装下面染色TD细胞。

  1. 准备他莫昔芬溶液在玉米油中的12.5毫克/毫升的浓度。
    1. 在1.5ml管中，添加最多20毫克结晶他莫昔芬，并然后将1ml的玉米油。牢固胶带将管旋涡混合器，并在室温最高设置旋涡不断，直到他莫昔芬已完全溶​​解（2-4小时），如通过在解剖显微镜对没有他莫昔芬的微粒的下检查管证实。
    2. 转移溶液到15毫升管中并稀释他莫昔芬，以12.5毫克/毫升用另外的玉米油的最终浓度。通过涡旋粘稠溶液另外30秒混合。存储在黑暗中在4℃下向该溶液长达1周。
  2. 腹膜内注射他莫昔芬溶液进入中....

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Results

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通过表达他莫昔芬诱导中Gli1-CreERT2产生小鼠和LacZ报道等位基因，这是可能的可视化的TD上皮和跟踪这些细胞的命运随时间。整个去神经过程通常可以每只​​小鼠1小时内完成，并应产生最少的困扰的动物。

我们先前的研究已经表明，神经是维持正常阵以及与其相关的角蛋白8 +默克尔细胞（ 图3A - C）的关键5,19。神经也可用于促进在TD（ 图3D） 中Gli1的表达是至关重要的。鉴于TD集群的整个皮肤（ 图1B）的相对较少的外观，当务之急是要多品尝冰冻切片准确定量TD频率。通常情况下，我们评估15个非利弊ecutive部分（各10微米厚，约1厘米长）来自假和失神经支配的皮肤从每个动物。下面去神经，神经的稳定损耗，无论是.......

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Discussion

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神经起到至关重要的作用不仅轰动，而且在哺乳动物器官发育，维持和再生13,24-27。作为神经最近已在不同的皮肤疾病有牵连，此处所描述的技术可以被用来研究在多种动物疾病模型的为支配的要求。的确，单方面去神经技术允许的皮肤与来自相同小鼠完整的或破坏的神经直接比较。这提供了一个理想的内部控制，以补偿从动物到动物的差异，与随后的数据分析利用配对t检验。

而这里描述的过程在很大程度上利用LacZ报告基因，这些实验可以适于使得中Gli1-CreERT2等位基因与其它荧光报道或有条件的等位基因组合以修改在TD基因表达。例如， 中Gli1-CreERT2小鼠可以越过与动物窝藏Patched1（B6N.129-PTCH1 tm1Hahn / J）28的条件基因产生形成诱导他莫昔芬后5 TD-源性肿瘤的小鼠。值得注意的是， 中Gli1-CreERT2应变也诱导重组在物理上不.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者要感谢 Autumn Peterson 在小鼠摄影方面的帮助，Daniel Thoresen 在小鼠方面的帮助，以及 Nicole Ward 和 Abdelmadjid Belkadi 博士在手术去神经支配方面的帮助。这些研究得到了美国国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（R00AR059796 和 R01AR065409 年赠款）的资助;密歇根大学皮肤病学系;生物科学学者计划;器官发生中心;密歇根大学综合癌症中心;以及 John S. 和 Suzanne C. Munn 癌症基金会。SCP 得到了国家普通医学科学研究所（赠款 T32 GM007315）的资助。这项工作还得到了美国国家癌症研究所癌症研究中心 NIH 校内研究计划的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
酒精制备垫PDIB339
AnaSed （甲苯噻嗪）LloydNADA 139-236
抗体，抗角蛋白 8发育研究 杂交瘤细胞TROMA-I大鼠抗体，以 1：500 浓度使用
，抗角蛋白 17细胞信号#4543兔抗体，以 1：1,000 浓度使用
抗体，抗神经丝细胞信号传导C28E10兔抗体，以 1：500 浓度使用
Betadine 制备垫MedlineMDS093917
卡洛芬（Rimadyl）Zoetis
无绳可充电理发器Wahl修剪器 8900
型玉米油Sigma-AldrichC8267
低温恒温器LeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306以 1：1,000 浓度使用
脱氧胆酸盐Sigma-AldrichD6750
脱毛霜NairN/A
二甲基甲酰胺Sigma-Aldrich319937
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD8418
戊二醛Sigma-AldrichG5882
ImmEdge 笔Vector LaboratoriesH-4000
氯胺酮盐HospiraNDC 0409-2051-05
氯化镁SigmaM8266
微型盖玻片VWR48404-454
微型载玻片VWR48311-703
10% 中性缓冲福尔马林VWRBDH0502-4LP
6-0 尼龙缝合线DemeTECHNL166012F4P
辛基苯基 - 聚乙二醇Sigma-AldrichI8896
OCT 化合物樱花组织-TEC4583
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
亚铁氰化物Sigma-AldrichP9387
铁氰化钾Sigma-Aldrich702587
磷酸二氢钠Sigma-AldrichP9791
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS5136
蔗糖Sigma-Aldrich84097
他莫昔芬Sigma-AldrichT5648-1G
超细镊子Dumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001在二甲基孔酰胺中溶解，在使用前制备 50x 原液
库 抗体酸盐

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woo....

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