皮肤去神经外科手术:一种用于皮肤病的小鼠模型测试要求的神经方法

摘要

本文包括小鼠皮肤遗传标记、手术去神经支配、皮肤活检和通过整装 β-半乳糖苷酶染色可视化标记的上皮细胞的详细方案。这些方法可用于测试正常和病理皮肤的小鼠模型中对神经的需求。

摘要

引言

在过去的几年里，人们越来越广泛地认识到神经对通常不被视为经典神经病的疾病^1-4 的影响。在皮肤中，最近的实验证据表明，感觉神经可以调节从银屑病到癌症的各种病症^5-9。这已经使用手术去神经支配和啮齿动物神经功能的药物抑制等技术得到证明。 在银屑病的情况下，这些研究为理解为什么人类银屑病斑块在神经功能丧失后会消退提供了一个机制框架^7,10-12。

皮肤神经也可以影响基因表达^{13,14，并且}对正常皮肤的机械感应至关重要¹⁵。特别是，触摸圆顶 （TD） 上皮细胞由一块柱状表皮细胞与由缓慢适应的 1 型 （SA1） 神经纤维支配的神经内分泌默克尔细胞^16-18 组成。TDs 介导轻触觉，并已被证明显示 Hedgehog 通路活性^5,19。TD 的维持取决于神经支配^20,21，因为神经分泌刺猬配体以维持正常的 TD 及其相关的默克尔细胞¹⁹。此外，神经支配促进 TD 上皮细胞⁵ 的 Hedgehog 依赖性肿瘤形成。总之，这些研究强化了这样一种观念，即神经与其生态位中的周围细胞之间发生的错综复杂的分子相互作用对于正常的 TD 生理学和疾病至关重要。

为了询问这些相互作用的性质，我们在这里描述了一系列体内技术，用于纵 TD 中的基因表达，以及收集皮肤活检用于谱系追踪后 TD 可视化。最后，我们描述了进行单侧手术去神经支配的程序，其中神经从小鼠背侧皮肤的一侧去除，同时保持对侧完整作为假内部对照。手术后几周，比较去神经支配和假对照皮肤，以评估神经消融时发生的变化。尽管这些技术是在正常 TD 的背景下描述的，但去神经术已用于检查银屑病⁶ 、伤口愈合¹³ 和肿瘤发生⁵ 小鼠模型中对神经的需求。最后，由于皮肤适合重复活检，这为监测标记细胞的长期命运或评估多个时间点的疾病进展提供了机会。

方案

在此协议中描述的所有程序按照由密歇根单位的大学实验动物医学既定法规的规定执行。

1.诱导小鼠基因重组

注^:TM3 中 ^{Gli1（CRE / ERT2）ALJ} / J小鼠品系（ 中^{Gli1-CreERT2）13}启用定向三苯氧胺诱发基因重组到TD上皮。跨越这株B6.129S4-GT（ROSA）26Sor ^tm1Sor / J记者小鼠（LacZ的 ^）22 中Gli1产生;动物LacZ的可视化通过整个安装下面染色TD细胞。

1. 准备他莫昔芬溶液在玉米油中的12.5毫克/毫升的浓度。
   1. 在1.5ml管中，添加最多20毫克结晶他莫昔芬，并然后将1ml的玉米油。牢固胶带将管旋涡混合器，并在室温最高设置旋涡不断，直到他莫昔芬已完全溶​​解（2-4小时），如通过在解剖显微镜对没有他莫昔芬的微粒的下检查管证实。
   2. 转移溶液到15毫升管中并稀释他莫昔芬，以12.5毫克/毫升用另外的玉米油的最终浓度。通过涡旋粘稠溶液另外30秒混合。存储在黑暗中在4℃下向该溶液长达1周。
2. 腹膜内注射他莫昔芬溶液进入中Gli1; ​​LacZ的小鼠，在每个20克小鼠体重200μl的体积，对于每个20 G鼠标2.5重量毫克有效三苯氧胺的剂量。

2.嘉实皮肤活检

注:根据实验，收获皮肤活检几天到几周他莫昔芬诱导后。对于所有的手术，遵循标准协议灭鼠手术，包括使用无菌手套，戴口罩或头发网，覆盖在手术过程中，用无菌手术单的动物。

1. 在水混合90毫克/毫升氯胺酮和6.5毫克/毫升的甲苯噻嗪准备10倍的股票麻醉剂的解决方案。稀释此储备溶液1:10比例无菌PBS只是在使用前，并在室温在黑暗中储存长达8个月。
   1. 可替代地，通过吸入异氟烷麻醉小鼠，用4％的气体浓度与氧气开始充分麻醉动物，并随后降低该至1-2％的程序的持续时间。
2. 腹膜内注射麻醉剂溶液，剂量为每个20 G鼠标体重200微升。检查动物已经达到脚趾捏法镇静的正确平面，并确认心脏和呼吸率（分别约为600次每分钟160次呼吸，）是正常的。
3. 使用电剪从活检网站上的背背部皮肤取下毛发，小心不要缺口或损坏肌肤底层。
4. 经擦拭的剃须准备手术部位开发领域中使用聚维酮碘和酒精擦拭前 - 至 - 后方向。确保所有的头发都剪报从网站上删除。
5. 介绍了使用黑色标记活检部位，放置在暖垫动物在无菌手术区，并用无菌手术悬垂覆盖（用于演示目的，无菌的悬垂性被忽略了提高知名度）。
   注意:要获得毛囊纵向部分，所述活检的长边（边缘被切片用于组织学，约1厘米）应在一个前 - 后方向延伸（平行于毛囊的方向），parasagital到背中线（ 图1A）。
6. 使用无菌＃11解剖刀使沿标记的区域的完整厚度切除而不损坏底层肌肉筋膜。
   注意:将切下的皮肤组织包括表皮，真皮​​，皮下脂肪和肌层。出血通常是最小的。
7. 拼合ŧ他切除上干纸巾皮肤样品，真皮侧倒，修剪掉多余的纸巾，并将样品在冷PBS存储长达1小时，如果其它样品需要被收集。准备就绪后，前往步骤3.1或3.2来处理组织学样品，或整个安装β半乳糖苷酶（lacZ）染色步骤4。
8. 缝合关闭使用6-0尼龙缝线活检部位，在间隔开的大致为3毫米的简单中断模式。
9. 不要返回已接受手术到同一个笼子里的其他动物，直到完全恢复后的小鼠。
10. 监控动物手术后，直到他们每天回过神来，也是直到手术区已愈合，通常在1周。使用止痛剂按照指定的机构动物护理和使用指南，如果小鼠表现出疼痛或痛苦的迹象。手术后取出在7-10天内缝线。
    注意:如果需要，通过稀释卡布洛芬（50毫克/毫升股票SOLUT准备镇痛液离子）1:在无菌水中100。注入肩胛骨之间的溶液皮下的颈背附近，在一个剂量的每个20克体重200微升（5毫克/千克小鼠体重）。

3.处理样品的组织学

注意:要解决和处理切除的组织，使用下面根据应用两种方法。

1. 以产生石蜡包埋的组织学样品，固定在3.7％甲醛的PBS中O / N在室温在70％的乙醇对皮肤和存储长达2周。嵌入到石蜡之前取出纸巾。
2. 用于产生冷冻的组织学样品，浸入所述组织在PBS中冷的4％多聚甲醛和1小时轻轻摇动。除去溶液，并用PBS 3的变化，每个大约为5分钟，洗涤样品。接着，浸没在30％蔗糖的样品在PBS中cryoprotect组织（"蔗糖下沉"）。
3. 轻轻摇动O / N孵育在4℃下。次日，取出纸张束埃尔并从皮肤的真皮侧修剪掉多余的脂肪组织。嵌入组织直接进入OCT和冻块存储在-80℃。
   注意:切片后，无论是石蜡或冷冻样品可通过免疫组织化学染色，以确定阵，默克尔细胞和使用抗角蛋白17，角蛋白8和神经丝，分别神经，如先前所描述^5,19。

4.可视化样品中全​​安装的LacZ染色

1. 制备的X-gal染色溶液。
   1. 结合0.94克磷酸二氢钠，和2.6加入磷酸氢二钠于250ml无菌水中。调节pH值至7.3。此，加入0.5毫升的1M氯化镁，0.528克亚铁氰化钾，和0.412克铁氰化钾。添加辛基苯基聚乙二醇250微升和125毫克脱氧胆。碱溶液可以储存在4℃下长达6个月在黑暗中。
   2. 准备50X股票的X-gal soluti关于通过加入二甲基甲酰胺的X-gal的库存瓶以产生50毫克/毫升溶液。存储在黑暗中在-20℃下向该溶液。
   3. 只是使用，稀释的库存的X-gal溶液1:50到的X-gal碱溶液，以产生染色溶液之前。对于较小的活检（<1 ^平方厘米），每个样品染色溶液等分试样1-2毫升。
2. 固定在含有2％多聚甲醛/ 0.2％戊二醛在冷PBS 30分钟，在冰上轻轻晃动的溶液步骤2.7中收集的皮肤样品。对于较小的活检（<1 ^平方厘米），用1-2毫升，每样固定液。
   注:另外，只有样品固定在2-4％多聚甲醛，或仅在0.5％的戊二醛。最佳固定条件取决于组织，LacZ的表达和应用的程度。
3. 除去固定液，用PBS 3的变化，每次5分钟，于室温在摇床上漂洗样品。
4. 取出纸巾样品下方，切去exces通过抓住钝钳脂肪和与解剖剪刀修整上来自皮肤的真皮侧的脂肪组织。
5. 浸没在X-gal的染色液的样品，并在37℃CO / N孵育。 LacZ的表达将作为一个解剖显微镜（ 图1B）下蓝染色可见。
   注意:如果信号强度较弱，更换染色液第二天，重复O / N培养。如果背景染色过于激烈，减少染色的时间，或在室温下孵育样品，而不是37℃。
6. 除去染色液并在含有PBS中的3％DMSO的约5分钟，在RT轻轻摇动3变化洗样品。
7. 洗涤样品，每次5分钟，70％乙醇2-3变化。商店的样品在70％的乙醇。

5.去神经外科

1. 麻醉动物如步骤2.2和刮整个背部皮肤。
2. 准备手术区○F使用聚维酮碘和酒精擦拭，并用无菌手术单动物的背部皮肤（用于演示目的，无菌的悬垂性被忽略了提高知名度）。用加热垫，而在无菌手术区经营保持动物温暖。
3. 使用沿着从颈部的底部背中线无菌＃11解剖刀大致0.5厘米尾部上方的切口。
4. 使用钝钳，轻轻反映在左侧的皮肤从侧翼远离形象化从肩胛脂肪垫下面的组织的颈部附近只后肢以上。
   注意:背皮神经似乎锐弯并进入疏松结缔组织皮肤下方（ 图2）之前尾端行进穿过躯干壁的半透明面板，为白色链。
5. 使用解剖显微镜下超细镊子，从阴性特质的左侧只取出神经升位于通过从拔除解剖学部位T3-12在躯干壁到其进入位点到皮肤的分段弯曲（ 图2）。
   1. 东方镊子垂直和由下面的弯曲部位把持约为0.5厘米，向上拉，造成神经伸展和从周围组织（ - E 图2C）分离除去神经。小心避免破裂相邻血管。
   2. 继续，直到从树干墙皮肤一直延伸神经都被删除。不要把后备箱壁上的密集筋膜内扰乱神经。通过周期性施加无菌的0.9％盐水溶液的液滴保持组织在整个过程湿润。
   3. 另外，通过把握其近端主干墙钳附近，用细剪刀剪断取下的神经。随后，切断皮肤附近的远端（ 图2F - H）。最后，去掉INTervening神经节段（ 图2I）。
6. 从步骤5.4暴露皮瓣取出所有的神经。这些纤维包括背皮神经的远端分支，并出现零星位于上皮瓣真皮侧（ 图2J - K）结缔组织内白色分支链。
   1. 要删除这些细的分支，定位细镊子大致平行于皮肤表面，抓住神经和勇敢向上，以避免破坏血管和穿刺皮肤。继续，直到所有可见的神经已被删除。
7. 使用钝性分离，反映背中线切口右侧皮肤，但不删除神经。这将作为对侧假手术对照。
8. 沿着在一个简单的断续图案背中线缝合关闭切口。监视恢复和OPER后在动物atively如以前证明（步骤2.8-10）。手术后取出在7-10天内缝线。
9. 在功能上评估手术后稳定去神经长达数周，使用电动推剪去除背部皮肤的毛。
10. 轻轻挑破使用皮下注射针头失神经支配的皮肤区域，并注意是否动物的响应，通常由打了一个寒颤或转动它的头。如果皮肤面积已稳定失神经支配，动物会表现出很少或没有回应。
11. 使用黑色标记，轮廓没有反应的区域，以及类似的大小和位置的对侧假侧的区域。
12. 收集从这些站点活组织检查按照步骤2.1-2.9进行分析。
    注意:可替换地，整个背侧背部皮肤，包括去神经和假手术的区域，可以作为一个单一的片材整个贴装染色，类似于如在步骤4中所描述的被移除。

结果

通过表达他莫昔芬诱导中Gli1-CreERT2产生小鼠和LacZ报道等位基因，这是可能的可视化的TD上皮和跟踪这些细胞的命运随时间。整个去神经过程通常可以每只​​小鼠1小时内完成，并应产生最少的困扰的动物。

我们先前的研究已经表明，神经是维持正常阵以及与其相关的角蛋白8 ⁺默克尔细胞（ 图3A - C）的关键^5,19。神经也可用于促进在TD（ 图3D） 中Gli1的表达是至关重要的。鉴于TD集群的整个皮肤（ 图1B）的相对较少的外观，当务之急是要多品尝冰冻切片准确定量TD频率。通常情况下，我们评估15个非利弊ecutive部分（各10微米厚，约1厘米长）来自假和失神经支配的皮肤从每个动物。下面去神经，神经的稳定损耗，无论是...

讨论

神经起到至关重要的作用不仅轰动，而且在哺乳动物器官发育，维持和再生^13,24-27。作为神经最近已在不同的皮肤疾病有牵连，此处所描述的技术可以被用来研究在多种动物疾病模型的为支配的要求。的确，单方面去神经技术允许的皮肤与来自相同小鼠完整的或破坏的神经直接比较。这提供了一个理想的内部控制，以补偿从动物到动物的差异，与随后的数据分析利用配对t检验。

而这里描述的过程在很大程度上利用LacZ报告基因，这些实验可以适于使得中Gli1-CreERT2等位基因与其它荧光报道或有条件的等位基因组合以修改在TD基因表达。例如， 中Gli1-CreERT2小鼠可以越过与动物窝藏Patched1（B6N.129-PTCH1 ^tm1Hahn / ^J）28的条件基因产生形成诱导他莫昔芬后⁵ TD-源性肿瘤的小鼠。值得注意的是， 中Gli1-CreERT2应变也诱导重组在物理上不...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酒精制备垫	PDI	B339
AnaSed （甲苯噻嗪）	Lloyd	NADA 139-236
抗体，抗角蛋白 8	发育研究 杂交瘤细胞	TROMA-I	大鼠抗体，以 1：500 浓度使用
，抗角蛋白 17	细胞信号#	4543	兔抗体，以 1：1,000 浓度使用
抗体，抗神经丝	细胞信号传导	C28E10	兔抗体，以 1：500 浓度使用
Betadine 制备垫	Medline	MDS093917
卡洛芬（Rimadyl）	Zoetis
无绳可充电理发器	Wahl	修剪器 8900
型玉米油	Sigma-Aldrich	C8267
低温恒温器	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306	以 1：1,000 浓度使用
脱氧胆酸盐	Sigma-Aldrich	D6750
脱毛霜	Nair	N/A
二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	319937
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
戊二醛	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge 笔	Vector Laboratories	H-4000
氯胺酮盐	Hospira	NDC 0409-2051-05
氯化镁	Sigma	M8266
微型盖玻片	VWR	48404-454
微型载玻片	VWR	48311-703
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	BDH0502-4LP
6-0 尼龙缝合线	DemeTECH	NL166012F4P
辛基苯基 - 聚乙二醇	Sigma-Aldrich	I8896
OCT 化合物	樱花组织-TEC	4583
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
亚铁氰化	物Sigma-Aldrich	P9387
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	702587
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	P9791
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S5136
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648-1G
超细镊子	Dumont	0103-5-PO
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	在二甲基孔酰胺中溶解，在使用前制备 50x 原液