皮肤外科去神经术：一种用于检测神经在小鼠皮肤疾病模型中作用需求的方法

摘要

本文包含小鼠皮肤遗传标记、手术去神经、皮肤活检以及通过整体β-半乳糖苷酶染色观察标记上皮的详细实验方案。这些方法可用于检测在正常及病理皮肤小鼠模型中神经所必需的作用。

摘要

皮肤体感神经的功能是检测作用于皮肤的各种刺激。除了已知的感觉功能外，近期研究还表明神经可能调节特应性皮炎、银屑病和皮肤癌等多种皮肤疾病。本文中，我们描述了检测神经在维持皮肤机械感受器官——触觉圆顶（touch dome, TD）结构中所起作用的实验方案。具体而言，我们讨论了通过整体染色法对TD进行遗传标记、取材和可视化观察的技术，以及在小鼠背部皮肤实施单侧手术去神经的方法。结合这些方法，可直接在同一动物的去神经皮肤与假手术对照皮肤之间比较TD的形态学特征和基因表达情况。这些技术也可轻松应用于各类小鼠皮肤病理模型，以研究神经在其中的作用。此外，皮肤组织可多次取样，使得研究人员能够在疾病发生发展的不同阶段和时间点动态监测病情进展。

引言

近年来，人们越来越认识到神经对那些通常不被视为经典神经病变的疾病具有重要影响^1-4。在皮肤中，最新的实验证据表明，感觉神经可调节多种病理过程，范围从银屑病到癌症^5-9。这些发现是通过在啮齿类动物中采用手术去神经化以及药理学手段抑制神经功能等技术实现的。以银屑病为例，这些研究为理解人类银屑病斑块在神经功能丧失后发生退行的机制提供了理论框架^7,10-12。

皮肤神经还能影响基因表达^13,14，并在正常皮肤的机械感知中起关键作用¹⁵。特别是，触觉圆顶（TD）上皮由一群柱状表皮细胞构成，其内含有神经内分泌型的默克尔细胞，并由慢适应1型（SA1）神经纤维支配^16-18。TD介导轻触觉感知，且已被证实存在Hedgehog信号通路活性^5,19。TD的维持依赖于神经支配^20,21，因为神经元可分泌Hedgehog配体，以维持正常的TD及其相关的默克尔细胞¹⁹。此外，神经支配还能促进TD上皮中依赖Hedgehog通路的肿瘤形成⁵。这些研究共同强化了一个观点：神经与其微环境中周围细胞之间发生的复杂分子相互作用，对于TD的正常生理功能以及疾病发生均至关重要。

为了探究这些相互作用的性质，本文描述了一系列 体内....

方案

本方案中描述的所有操作均按照密歇根大学实验动物医学单位制定的规定进行。

1. 在小鼠中诱导基因重组

注意：Gli1^{tm3(cre/ERT2)Alj}/J 小鼠品系（Gli1-CreERT2）¹³ 可实现他莫昔芬诱导的基因重组在胸腺上皮细胞中的靶向表达。将该品系与 B6.129S4-Gt(ROSA)26Sor^tm1Sor/J 报告小鼠（LacZ）²² 杂交，以获得 Gli1;LacZ 小鼠，用于后续通过整体染色法可视化胸腺细胞。

1. 将他莫昔芬溶液配制为浓度 12.5 mg/ml 的玉米油溶液。
   1. 在 1.5 ml 离心管中加入最多 20 mg 结晶态他莫昔芬，然后加入 1 ml 玉米油。将管子牢固地固定在涡旋振荡器上，在室温下以最高转速持续涡旋，直至他莫昔芬完全溶解（2–4 小时），通过体视显微镜观察确认管内无他莫昔芬颗粒残留。
   2. 将溶液转移至 15 ml 离心管中，用额外的玉米油稀释，使他莫昔芬终浓度为 12.5 mg/ml。通过涡旋振荡黏稠溶液 30 秒以充分混匀。该溶液可在 4 °C 避光条件下储存最多 1 周。
2. 将他莫昔芬溶液按每 20 g 小....

结果

通过构建表达他莫昔芬诱导型的转基因小鼠 Gli1-CreERT2 和一个 LacZ 报告等位基因，可实现对TD上皮的可视化，并能够随时间追踪这些细胞的命运。整个去神经手术过程通常每只小鼠可在1小时内完成，且应对动物造成的不适最小。

我们之前的研究表明，神经对于维持正常的毛囊隆起（TD）及其相关的角蛋白8⁺ Merkel细胞均至关重要（图3A–C）^5,19。神经对于促进TD中Gli1的表达也具有关键作用（图3D）。鉴于TD簇在皮肤中出现频率相对较低（图1B），为准确量化TD频率，必须取样多个冷冻切片。通常，我们从每只动物的假手术皮肤和去神经皮肤中各选取15个非连续切片（每个切片厚10 µm，长约1 cm）进行评估。去神经处理.......

讨论

神经不仅在感觉功能中起着关键作用，还在哺乳动物器官的发育、维持和再生中发挥重要作用^13,24-27。由于近期研究发现神经与多种皮肤疾病相关，本文所述技术可用于研究不同动物疾病模型中皮肤神经支配的必要性。事实上，单侧去神经技术可实现对同一小鼠体内神经完整与神经受损皮肤的直接比较，从而提供理想的内部对照，以消除个体间差异的影响，后续数据分析可采用配对t检验。

尽管本文所述实验主要利用 LacZ 报告基因，但这些实验可进行调整，将 Gli1-CreERT2 等位基因与其他荧光报告基因或条件性等位基因组合，以在毛囊隆突区（TD）中调控基因表达。例如，可将 Gli1-CreERT2 小鼠与携带 Patched1 条件性等位基因的小鼠（B6N.129-Ptch1^tm1Hahn/J）²⁸ 杂交，从而获得在他莫昔芬诱导后可形成源自TD的肿瘤的小鼠模型⁵。需要注意的是，Gli1-C.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酒精消毒片	PDI	B339
镇静剂 AnaSed（赛拉嗪）	Lloyd	NADA 139-236
抗体，抗角蛋白 8	发育研究杂交瘤库	TROMA-I	大鼠抗体，使用浓度为 1:500
抗体，抗角蛋白 17	Cell Signaling	#4543	兔抗体，使用浓度为 1:1,000
抗体，抗神经丝蛋白	Cell Signaling	C28E10	兔抗体，使用浓度为 1:500
聚维酮碘消毒片	Medline	MDS093917
卡洛芬（Rimadyl）	Zoetis
无线可充电剃毛剪	Wahl	修剪器型号 8900
玉米油	Sigma-Aldrich	C8267
冷冻切片机	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306	使用浓度为 1:1,000
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
脱毛膏	Nair	N/A
二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	319937
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
戊二醛	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge 笔	Vector Laboratories	H-4000
盐酸氯胺酮	Hospira	NDC 0409-2051-05
氯化镁	Sigma	M8266
微型盖玻片	VWR	48404-454
显微载玻片	VWR	48311-703
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	BDH0502-4LP
6-0 尼龙缝合线	DemeTECH	NL166012F4P
辛基苯基-聚乙二醇	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. 包埋剂	Sakura Tissue-Tek	4583
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
亚铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P9387
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	702587
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	P9791
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S5136
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648-1G
超细镊子	Dumont	0103-5-PO
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	使用前用二甲基甲酰胺溶解，配制成 50 倍储存液